הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

ב Vivo העברת גנים לתאי אפיתל חלב עכבר באמצעות הזרקה intraductal חלב

2.5K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/64718

⸱

10 בפברואר 2023

 , 
1Lester & Sue Smith Breast Center, Baylor College of Medicine, 2Department of Medicine, Baylor College of Medicine, 3Department of Molecular & Cellular Biology, Baylor College of Medicine, Houston, TX 77030

במאמר זה

סיכום

הפרוטוקול הנוכחי מתאר הזרקה אינטרדוקטלית של וקטורים נגיפיים דרך הטיט כדי להעביר גנים מעניינים לתאי אפיתל החלב.

תקציר

בלוטות החלב של העכבר מורכבות מעצים צינוריים, המרופדים בתאי אפיתל ויש להם פתח אחד בקצה כל פטמה. תאי האפיתל ממלאים תפקיד מרכזי בתפקוד בלוטת החלב והם המקור לרוב גידולי החלב. החדרת גנים מעניינים לתאי אפיתל של חלב עכברים היא צעד קריטי בהערכת תפקוד גנים בתאי אפיתל ויצירת מודלים של גידולי חלב עכבריים. מטרה זו יכולה להיות מושגת באמצעות הזרקה intraductal של וקטור נגיפי הנושא את הגנים של עניין לתוך עץ החלב עכבר. הנגיף המוזרק מדביק לאחר מכן תאי אפיתל חלב, ומביא את הגנים המעניינים. הווקטור הנגיפי יכול להיות לנטיויראלי, רטרו-ויראלי, אדנוביראלי או אדנו-וירוס הקשור לנגיפים (AAV). מחקר זה מדגים כיצד גן מעניין מועבר לתאי אפיתל חלב באמצעות הזרקה אינטרדוקטלית של וקטור נגיפי של עכבר. לנטיוירוס הנושא GFP משמש להצגת ביטוי יציב של גן מועבר, ורטרו-וירוס הנושא Erbb2 (HER2/Neu) משמש להדגמת נגעים היפרפלסטיים לא טיפוסיים הנגרמים על ידי אונקוגנים וגידולי חלב.

מבוא

תאי אפיתל של בלוטות החלב ממלאים תפקיד מרכזי בתפקוד בלוטות אלה והם תא המקור העיקרי של סרטן השד. מחקרים על ביולוגיה של בלוטת החלב וגידולים לעתים קרובות זקוקים להעברת גנים בעלי עניין לתאים אלה. כל בלוטת חלב של עכבר מורכבת מעץ צינורי מרופד בתאי אפיתל עם פתח יחיד בקצה הפטמה. מבנה זה הופך את תאי אפיתל החלב לנגישים בקלות לווקטורים נגיפיים, אשר יכולים להיות מועברים לתוך לומן של עץ דוקטלי באמצעות הזרקה intraductal1.

הטכניקה של הזרקה intraductal חלב שימש במקור עבור בעלי חיים גדולים בהרבה כגון עזים, ארנבות, חולדות1. עבור חיה קטנה בהרבה כמו עכברים, הזרקה אינטרדוקטלית דורשת כלים עדינים רבים ושיטות עבודה רבות יותר של המפעילים. ישנן שתי גישות להזרקת עכבר intraductal. האחת היא זריקה1. עוד אחד הוא הזרקה ישירה של הצינור הראשוני של #3 או #4 בלוטת החלב לאחר חשיפה כירורגית1. מכיוון שהראשון אינו פולשני ומהיר יותר ברגע שהמפעיל הוכשר היטב, טכניקה זו נפוצה יותר ותתואר בפירוט במאמר זה.

בהשוואה למודלים הנפוצים של עכברים טרנסגניים מסורתיים, שבהם הגן המעניין מוצג בשלב של ביציות מופרות באמצעות מיקרו-הזרקה 2,3,4, להעברת גנים בשיטת הזרקת הנגיף התוך צינורי יש יתרונות רבים, כולל: (1) הוא מונע את התהליך הגוזל זמן של יצירת קו עכבר מהונדס עבור כל גן מעניין; (2) הוא מונע פגיעה פוטנציאלית בהתפתחות תקינה של בלוטות החלב המוטלת על ידי הגן המעניין; (3) הוא מציג את הגן המעניין בכל עת רצויה לאחר הלידה; (4) הוא יכול בקלות להכניס במשותף יותר מגן אחד של עניין; (5) הוא מחקה טוב יותר את התהליך הגידולי הטבעי משום שהתאים הנגועים ולכן נושאי האונקוגן מוקפים בתאים נורמליים; ו-(6) בשילוב עם טכנולוגיית TVA (וירוס הגידול A, חלבון פני השטח של תאי העופות והקולטן לווקטור RCAS רטרו-וירוס)5, ניתן להחדיר את הגן המעניין לאוכלוסיית תאים ספציפית כדי לחקור את מקור התא של גידולים ולבצע בדיקות מעקב אחר שושלת תאים בבלוטות החלב 6,7,8, 9.

כל וקטור הנגזר רטרווירוס10, lentivirus 11,12, adenovirus13, ווירוס הקשור אדנווירוס (AAV)14 עשוי לשמש להעברה intraductal של חומרים גנטיים. רטרו-וירוס ווקטורים של לנטי-וירוס משתלבים בגנום המארח לצמיתות; לכן, הם מציגים גנים של עניין יציב לתוך תאי אפיתל החלב. בעוד שלנטיוירוס יכול להשתלב בגנום של כל תא שהוא פוגש15, האינטגרציה הגנומית היעילה של רטרו-וירוס זקוקה להתרבות תאי המטרה16. וקטורי אדנו-ויראלי ו-AAV אינם משתלבים בגנום של תאים נגועים, ולכן מבטאים רק באופן ארעי את הגן המעניין17,18. תכונה זו יכולה להוות יתרון כאשר הגן המעניין צריך לבוא לידי ביטוי לפרק זמן קצר בלבד, כגון Cre, למחיקת גן מדכא גידול פלוקס.

Lentivirus, adenovirus, ו- AAV מדביקים כל תאי עכבר שהם נתקלים בהם. אך מכיוון שהאפיתל הלומינלי מבודד במידה רבה מהשכבה הבסיסית הבסיסית, המופרדת עוד יותר מהסטרומה על ידי קרום המרתף, הזרקה אינטרדוקטלית מגבילה את הזיהום בעיקר לתאי אפיתל לומינליים, התא העיקרי של מוצא סרטן השד. בתוך שכבת אפיתל לומינלית זו, ישנם גם תת-סוגים שונים של תאים, כולל תאי גזע, תאי אב וכמה קבוצות של תאים ממוינים. כדי להדביק תת-קבוצות תאים ספציפיות באוכלוסיית התאים הלומינליים, ניתן להשתמש בטכנולוגיית TVA, שבה וקטורים RCAS5,10 שמקורם בנגיף לויקוזיס העופות או וקטורים לנטי-ויראליים פסאודו-טיפיים11 מדביקים באופן סלקטיבי את התאים המבטאים TVA בעכברים הנושאים טרנסגן TVA תחת שליטתו של מקדם ספציפי לסוג התא, כגון מקדם הפעיל רק בתאי גזע 6 או אבות מסוימים 6, 7 או תאים מכתשית8 או תאים פעילים במסלול Wnt9.

פרוטוקול זה מציג את הטכניקה של החדרת גנים מעניינים לתאי אפיתל חלב באמצעות הזרקה intraductal של וקטור נגיפי. לאחר מכן מודגם זיהוי הביטוי של הגנים שהוכנסו והנגעים ההיפרפלסטיים והגידולים המתקבלים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל ההליכים באמצעות עכברים בוצעו בהתאם לפרוטוקול בעל חיים שאושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים. במחקר הנוכחי נעשה שימוש בנקבות FVB/N או MMTV-tva בנות 9-12 שבועות. העכברים הושגו באופן מסחרי או בייצור עצמי (ראו טבלת חומרים). נעשה שימוש בנגיפים Lenti-EGFP (FUCGW) ו-RCAS-Erbb2 (Neu). הכנת הנגיף וקביעת הטיטר בוצעו בעקבות הדוחות שפורסמו בעבר10,12.

1. הכנת מזרק

  1. חתכו את מחטי רכזת המתכת 33 G (ראו טבלת חומרים) לאורך של כ-1 ס"מ. לאחסן את המחטים ואת מזרק 50 μL ב 70% אלכוהול לאחר autoclaving.
  2. מוציאים מזרקים ומחטים מהאלכוהול. הוציאו את שארית האלכוהול מהמזרק והמחט. יש לפרק את המזרק לייבוש באוויר על כרית ספסל סופגת אוטוקלאבית.
  3. מרכיבים את המזרק לאחר הייבוש.

2. הכנת וירוסים

  1. הוציאו צינורית ויראלית אחת או יותר לפי הצורך מהמקפיא בטמפרטורה של -80°C והפשירו את הנגיף על קרח.
    הערה: בהתאם למספר התאים שיש להדביק, ייתכן שיהיה צורך לדלל את הנגיף לטיטרים מיועדים באמצעות PBS 1x בשלב זה.
  2. הוסיפו ברומופנול כחול על ידי טבילת קצה פיפטה לעומק של 1 ס"מ באבקת ברומופנול כחולה (ראו טבלת חומרים). לאחר מכן, הביאו את כמות העקבות המצורפת של ברומופנול כחול לתרחיף הנגיף.
    הערה: במחקר הנוכחי, המלאי הנגיפי הוא בדרך כלל 200 מיקרוליטר לכל צינור, כך שריכוז הצבע הסופי הוא כ -0.2% (0.2 מיקרוגרם / 100 מיקרוליטר). ברומופנול כחול צריך להיות מעוקר עם קרינת מיקרוגל במשך 45 שניות בהספק גבוה של 1250 W (ראה טבלת חומרים). הקפד לבצע את כל ההליך בסביבה סטרילית.
  3. מערבבים את כחול הברומופנול עם תמיסת הנגיף על ידי פיפטינג למעלה ולמטה 10 פעמים.
  4. מניחים את הנגיף על קרח ומביאים את דלי הקרח לוויבריום.

3. הכנת בעלי חיים

  1. הרדימו עכברה נקבה על ידי הזרקה תוך צפקית של 2 μL/g של חומר הרדמה (37.6 מ"ג/מ"ל קטמין, 1.92 מ"ג/מ"ל קסילזין ו-0.38 מ"ג/מ"ל אצפרומזין, ראו טבלת חומרים). בדוק את עומק ההרדמה עם צביטת בוהן. יש למרוח משחה על העיניים כדי למנוע יובש בזמן הרדמה.
    הערה: העכבר חייב להיות לא מגיב לצביטה בבוהן תחת הרדמה טובה. ניתן להשתמש באיזופלורן גם כדי להרדים את העכברים.
  2. הניחו את העכבר במצב שכיבה על כרית חמה וחברו את כל ארבעת הגפיים לספסל באמצעות סרט הדבקה.
  3. זהה פטמה אחת (או יותר) להזרקה (מספר 4 מועדף למחקר הנוכחי). חשוף אותו על ידי גזיזת השיער שמסביב באמצעות זוג מספריים.
  4. יש למרוח 70% אלכוהול ומקלוני יודופור על אזור הפטמה בשלושה סיבובים כדי לנקות ולחשוף את הפטמה.

4. הזרקה intraductal של וירוס

הערה: ניתן להשתמש במנורה מגדלת כדי לסייע בהדמיה של פתח הפטמה.

  1. חצו את הקצה הדיסטלי של פטמה באמצעות זוג מספריים קפיציים סטריליים של מיקרודיסקציה, עד שניתן לראות פתח צינור מרכזי קטן מתחת למנורת זכוכית מגדלת (ראו טבלת חומרים).
  2. יש להעמיס 10 מיקרוליטר של תערובת וירוס/ברומופנול כחול לתוך המזרק.
    הערה: Lenti-EGFP (FUCGW) ו- RCAS-Erbb2 (Neu) משמשים בהדגמה זו.
  3. הכנס בזהירות את המחט לפתח הפטמה בעזרת מנורת הזכוכית המגדלת. כיוון המחט מותאם מעט מהמדיאלי לצדדי כדי ליישר קו עם הצינור הראשי.
  4. הזריקו את כל 10 μL של הנגיף לתוך עץ הצינור.
    הערה: הצינורות מתחת לעור צריכים להפוך כחולים, אם ההזרקה מוצלחת. כל התנגדות או מראה של שינוי צבע מקומי מציין את כישלון ההזרקה.
  5. הנח את העכבר על מגלשה חמה יותר להגדיר על 45 ° C עד העכבר מתעורר לחלוטין (~ 30-60 דקות).

5. איתור תאים נגועים על ידי סטריאומיקרוסקופ פלואורסצנטי

  1. שלושה עד חמישה ימים לאחר הזרקת הנגיף הנושא GFP או גנים פלואורסצנטיים אחרים, יש להרדים את העכבר על ידי מינון יתר שלו עם 4 uL/g של חומר הרדמה (37.6 מ"ג/מ"ל קטמין, 1.92 מ"ג/מ"ל קסילזין ו-0.38 מ"ג/מ"ל אצפרומזין).
  2. פתח את חלל בית החזה. חותכים את העור לאורך קו האמצע הגחוני ולאורך הגפיים העליונות והתחתונות באמצעות זוג מספריים. להרים את העור ולחשוף את בלוטות החלב.
  3. הסר את בלוטת החלב המוזרקת מהעור באמצעות זוג מלקחיים ומספריים. כמו כן, הסר בלוטה שלא הוזרקה כבקרה.
  4. מניחים את בלוטות החלב על מגלשות זכוכית ופורשים את הבלוטות לצורתן המקורית.
  5. התבוננו ודמיינו את הבלוטות תחת סטריאומיקרוסקופ פלואורסצנטי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

נתונים מייצגים מוצגים כאן כדי להדגים הזרקה אינטרדוקטלית מוצלחת, זיהום ויראלי מוצלח, ואת ההשפעה של הגנים המועברים על גידולי החלב. כמות הנגיף המוזרק חייבת להיות מותאמת למטרת כל ניסוי. כדי להמחיש עד כמה עץ צינור החלב יכול להיות נגוע, יש להשתמש בכמות גדולה של גנים נושאי וירוסים שניתן לצלם, כגון GFP. מצד שני, כדי לחקות את הגידול הספונטני הטבעי, יש להשתמש בכמות קטנה של נגיף הנושא אונקוגן כך שרק תאים מעטים יהיו נגועים ויתפתחו לנגעים טרום סרטניים, ובסופו של דבר לסרטן פולשני, בשדה של בלוטת החלב הנורמלית לחלוטין.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

מאמר זה מדגים את טכניקת ההזרקה התוך-צינורית הנגיפית להחדרת גנים לתאי אפיתל חלב של עכברים לצורך מידול סרטן שד ספורדי. בדרך כלל, עכברים של לפחות 5 שבועות ומעלה מוזרקים כך התהליך האונקוגני מתחיל לאחר התפתחות בלוטת החלב. חוץ מזה, פתח הפטמה של עכברים מתחת לגיל 5 שבועות הוא לעתים קרובות קטן מדי להזרקה. מצד שני, פטמות של עכברים זקנים מאוד מנוונות לפעמים, וטרנסקציה עלולה להיכשל בחשיפת פתח צינורי. כמו כן, חשוב לציין כי הפטמות של כמה מודלים של גידולים טרנסגניים או נוקאאוט עשויים להיות קשים להזרקה עקב התפתחות חלב לא תקינה הנגרמת על...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

שני המחברים מצהירים כי אין ניגוד עניינים.

תודות

אנו מודים לד"ר גארי צ'מנס על הערותיו המועילות על כתב יד זה. עבודה זו נתמכה על ידי משרד ההגנה (DOD) CDMRP BC191649 (YL) ו- BC191646 (YL) כמו גם המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) CA271498 (YL). המחברים רוצים להודות למתקן הליבה הפתולוגית של מרכז השד הנתמך על ידי SPORE P50CA186784, ולליבת הציטומטריה ומיון התאים הנתמכת על ידי CPRIT-RP180672, NIH CA125123 ו- RR024574 בסיועו של ג'ואל מ. סדרסטרום.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
נוגדן נגד HACovanceMMS-101Pדילול: 1: 1000
דמעות מלאכותיותCovetrusNDC 11695-0832-1
ברומופנול כחולסיגמאB5525קרינת מיקרוגל למשך 45 שניות בעוצמה גבוהה של תנור מיקרוגל 1250W
FACSCantoIIBD BiosciencesV96100899
סטריאומיקרוסקופ פלואורסצנטיLeicaMZ16 FA
FUCGW lenti-virusמתוצרת עצמיתN/Aראה הפניה # 12
FVB/Nמעבדת ג'קסוןJAX:001800
מחט המילטוןהמילטון91033מזרק המילטון אוטוקלאב
המילטוןהמילטון201000
מנורת מגדלת LEDIntertek3165273
מספריים קפיציים מיקרו דיסקציהRobozRS-5621חיטוי
MMTV-tvaתוצרתראה התייחסות # 10
RCAS-Neu (HA)מתוצרת עצמיתN/Aראה הפניה # 10
Rodent Comboanesthetic IIIVeterinaryPharmacy Veterinary Prescription37.6 מ"ג/מ"ל קטמין, 1.92 מ"ג/מ"ל קסילזין, ו-0.38 מ"ג/מ"ל אצפרומזין
חיטוי עצמית

מקורות

  1. Nguyen, D. -A., Beeman, N., Lewis, M., Schaack, J., Neville, M. C. Methods in Mammary Gland Biology and Breast Cancer Research. Eds Margot. Ip, M. M., Asch, B. B. , Springer US. 259-270 (2000).
  2. Gordon, J. W., Ruddle, F. H. Integration and stable germ line transmission of genes injected into mouse pronuclei. Science. 214 (4526), 1244-1246 (1981).
  3. Costantini, F., Lacy, E. Introduction of a rabbit beta-globin gene into the mouse germ line. Nature. 294 (5836), 92-94 (1981).
  4. Brinster, R. L., et al. Somatic expression of herpes thymidine kinase in mice following injection of a fusion gene into eggs. Cell. 27 (1), 223-231 (1981).
  5. Du, Z., Li, Y. RCAS-TVA in the mammary gland: an in vivo oncogene screen and a high fidelity model for breast transformation. Cell Cycle. 6 (7), 823-826 (2007).
  6. Bu, W., et al. Mammary precancerous stem and non-stem cells evolve into cancers of distinct subtypes. Cancer Research. 79 (1), 61-71 (2019).
  7. Bu, W., et al. Keratin 6a marks mammary bipotential progenitor cells that can give rise to a unique tumor model resembling human normal-like breast cancer. Oncogene. 30 (43), 4399-4409 (2011).
  8. Haricharan, S., et al. Contribution of an alveolar cell of origin to the high-grade malignant phenotype of pregnancy-associated breast cancer. Oncogene. 33 (50), 5729-5739 (2014).
  9. Bu, W., Zhang, X., Dai, H., Huang, S., Li, Y. Mammary cells with active Wnt signaling resist ErbB2-induced tumorigenesis. PLoS One. 8 (11), 78720(2013).
  10. Du, Z., et al. Introduction of oncogenes into mammary glands in vivo with an avian retroviral vector initiates and promotes carcinogenesis in mouse models. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (46), 17396-17401 (2006).
  11. Siwko, S. K., et al. Lentivirus-mediated oncogene introduction into mammary cells in vivo induces tumors. Neoplasia. 10 (7), 653-662 (2008).
  12. Bu, W., Xin, L., Toneff, M., Li, L., Li, Y. Lentivirus vectors for stably introducing genes into mammary epithelial cells in vivo. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 14 (4), 401-404 (2009).
  13. Russell, T. D., et al. Transduction of the mammary epithelium with adenovirus vectors in vivo. Journal of Virology. 77 (10), 5801-5809 (2003).
  14. Wagner, S., Thresher, R., Bland, R., Laible, G. Adeno-associated-virus-mediated transduction of the mammary gland enables sustained production of recombinant proteins in milk. Scientific Reports. 5, 15115(2015).
  15. Naldini, L., et al. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science. 272 (5259), 263-267 (1996).
  16. Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. Retroviruses. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1997).
  17. Mitani, K., Kubo, S. Adenovirus as an integrating vector. Current Gene Therapy. 2 (2), 135-144 (2002).
  18. McCarty, D. M., Young, S. M., Samulski, R. J. Integration of adeno-associated virus (AAV) and recombinant AAV vectors. Annual Review of Genetics. 38, 819-845 (2004).
  19. Bu, W., Li, Y. Intraductal injection of lentivirus vectors for stably introducing genes into rat mammary epithelial cells in vivo. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 25 (4), 389-396 (2020).
  20. Dong, J., et al. Genetic manipulation of individual somatic mammary cells in vivo reveals a master role of STAT5a in inducing alveolar fate commitment and lactogenesis even in the absence of ovarian hormones. Developmental Biology. 346 (2), 196-203 (2010).
  21. Haricharan, S., et al. Mechanism and preclinical prevention of increased breast cancer risk caused by pregnancy. eLife. 2, 00996(2013).
  22. Reddy, J. P., et al. Defining the ATM-mediated barrier to tumorigenesis in somatic mammary cells following ErbB2 activation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (8), 3728-3733 (2010).
  23. Dong, J., et al. The PR status of the originating cell of ER/PR-negative mouse mammary tumors. Oncogene. 35 (31), 4149-4154 (2016).
  24. Young, A., et al. Targeting the pro-survival protein BCL-2 to prevent breast cancer. Cancer Prevention Research. 15 (1), 3-10 (2022).
  25. Schlimgen, R., et al. Risks associated with lentiviral vector exposures and prevention strategies. Journal of Occupational and Environmental Medicine. 58 (12), 1159-1166 (2016).
  26. Holloway, K. R., et al. Krt6a-positive mammary epithelial progenitors are not at increased vulnerability to tumorigenesis initiated by ErbB2. PLoS One. 10 (1), 0117239(2015).
  27. Holloway, K. R., et al. Targeting oncogenes into a defined subset of mammary cells demonstrates that the initiating oncogenic mutation defines the resulting tumor phenotype. International Journal of Biological Sciences. 12 (4), 381-388 (2016).
  28. Hein, S. M., et al. Luminal epithelial cells within the mammary gland can produce basal cells upon oncogenic stress. Oncogene. 35 (11), 1461-1467 (2015).
  29. Annunziato, S., et al. In situ CRISPR-Cas9 base editing for the development of genetically engineered mouse models of breast cancer. EMBO Journal. 39 (5), 102169(2020).
  30. Annunziato, S., et al. Modeling invasive lobular breast carcinoma by CRISPR/Cas9-mediated somatic genome editing of the mammary gland. Genes & Development. 30 (12), 1470-1480 (2016).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

הזרקת וקטורים ויראלייםהעברה גנטית לנטיוויראליתהעברה גנטית רטרוויראליתמודל לגידול שפיר של בלוטת החלבמיקרוסקופיה פלואורסצנטיתציטומטריה זרימתיתתרחיף תאים בודדים
ב Vivo העברת גנים לתאי אפיתל חלב עכבר באמצעות הזרקה intraductal חלב
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.