הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

חקר סטיות X כרומוזומליות בתאי שחלה באמצעות הכלאה פלואורסצנטית באתרו

2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/64734

⸱

7 באפריל 2023

 ,  ,  ,  , 
1Department of Obstetrics and Gynecology, Radboudumc, 2Department of Pediatrics, Radboudumc, Amalia Children’s Hospital, 3Department of Reproductive Medicine, Nij Geertgen Center for Fertility

במאמר זה

סיכום

מאמר זה מציג שתי שיטות המבוססות על הכלאה פלואורסצנטית באתרו כדי לקבוע את התוכן כרומוזומלי X של תאי שחלה ברקמת קליפת השחלות הלא מושתלת ומושתלת מנקבות עם סטיות כרומוזומליות X.

תקציר

מיליוני אנשים ברחבי העולם מתמודדים עם נושאים הקשורים לפוריות. ירידה בפוריות, או אפילו אי פוריות, עשויה לנבוע מסיבות רבות ושונות, כולל הפרעות גנטיות, אשר הפרעות כרומוזומליות הן הנפוצות ביותר. הכלאה פלואורסצנטית באתרו (FISH) היא שיטה ידועה ונפוצה לאיתור סטיות כרומוזומליות בבני אדם. FISH משמש בעיקר לניתוח הפרעות כרומוזומליות בזרעונים של זכרים עם סטיות כרומוזומליות מספריות או מבניות. יתר על כן, טכניקה זו מיושמת לעתים קרובות גם אצל נשים כדי לזהות סטיות כרומוזומליות X הידועות כגורמות לדיסגנזה שחלתית. עם זאת, מידע על התוכן כרומוזומלי X של תאי שחלה מנקבות עם סטיות כרומוזומליות X בלימפוציטים ו / או תאים buccal עדיין חסר.

מטרת מחקר זה היא לקדם מחקר בסיסי לגבי סטיות כרומוזומליות X בנקבות, על ידי הצגת שתי שיטות המבוססות על FISH לזיהוי התוכן הכרומוזומלי X של תאי השחלה. ראשית, מתוארת שיטה לקביעת התוכן הכרומוזומלי X של תאי שחלה מבודדים (ביציות, תאי גרנולוזה ותאי סטרומה) ברקמת קליפת השחלות שלא הושתלה מנקבות עם סטיות כרומוזומליות X. השיטה השנייה מכוונת להערכת ההשפעה של סטיות כרומוזומליות על פוליקולוגנזה על ידי קביעת התוכן הכרומוזומלי X של תאי שחלה של זקיקים משניים ואנטרליים שזה עתה נוצרו ברקמת השחלה, מנקבות עם סטיות כרומוזומליות X לאחר השתלה ארוכת טווח בעכברים מדוכאי חיסון. שתי השיטות יכולות להיות מועילות במחקר עתידי כדי לקבל תובנה לגבי פוטנציאל הרבייה של נקבות עם סטיות כרומוזומליות X.

מבוא

אי פוריות היא בעיה בריאותית של מערכת הרבייה הגברית או הנשית, המשפיעה על כ -186 מיליון אנשים בגיל הפוריות ברחבי העולם1. לפחות 35% מהזוגות העקרים, אי פוריות נגרמת על ידי הפרעה של מערכת הרבייה הנשית2. ישנם גורמים רבים שיכולים לגרום לאי פוריות נשית, כגון גורמים גנטיים, הפרעות בדרכי המין, תפקוד אנדוקריני, מחלות דלקתיות וטיפול יאטרוגני3.

הפרעות גנטיות קיימות בכ -10% מהנקבות העקרים 4,5. מכל ההפרעות הגנטיות, סטיות כרומוזום X הן הגורם השכיח ביותר לדיסגנזה שחלתית2. מספר מחקרים דיווחו כי סטיות כרומוזומליות X אצל נשים עם תסמונת טרנר (TS) או תסמונת X משולש קשורות לאי ספיקת שחלות מוקדמת עקב אובדן מואץ של תאי נבט או פגיעה באוגנזה 6,7,8.

ניתן לחלק סטיות של כרומוזום X ל: 1) סטיות מספריות, שבהן מספר כרומוזומי X שונה אך כרומוזומי X שלמים; ו-2) סטיות מבניות, שבהן כרומוזום X צבר או איבד חומר גנטי 3,9. סטיות מספריות של כרומוזום X שכיחות יותר מהפרעות מבניות ונגרמות לעיתים קרובות על ידי טעויות ספונטניות במהלך חלוקת התא 3,9. כאשר שגיאה כזו מתרחשת במהלך מיוזה, היא עלולה להוביל לגמטות אנאופלואידיות ובסופו של דבר לצאצאים עם סטיות כרומוזומליות בכל התאים. כאשר פגמים כרומוזומים מתעוררים בתאים סומטיים כתוצאה מטעויות המתרחשות במהלך מיטוזה בשלבים המוקדמים של האונטוגנזה, הדבר עלול להוביל למוזאיקה. אצל אנשים אלה, שני תאים עם תוכן כרומוזומלי X נורמלי ותאים עם סטיות כרומוזומליות X נמצאים.

בשנות ה-80 של המאה ה-20 פותחה שיטה ציטוגנטית הנקראת הכלאה פלואורסצנטית באתרה (FISH) כדי לדמיין ולאתר רצפים ספציפיים של חומצות גרעין על כרומוזומים מטא-פאזיים ובין-פאזיים10,11. טכניקה זו משתמשת בבדיקות DNA עם תווית פלואורסצנטית כדי להיקשר לרצף מסוים בכרומוזום, אשר לאחר מכן ניתן לדמיין באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

כיום, FISH נמצא בשימוש נרחב ככלי אבחון קליני ונחשב לתקן הזהב באיתור סטיות כרומוזומליות10. בתחום רפואת הרבייה, ניתוח FISH על זרע שימש כדי לקבל תובנה לגבי התוכן כרומוזומלי X של זרעונים אצל גברים עם סטיות כרומוזומליות מספריות או מבניות בתאים סומטיים12,13,14. מחקרים אלה הראו כי גברים עם סטיות כרומוזומליות היו בסיכון גבוה יותר להיות בעלי תדירות גבוהה יותר של זרעונים אנאופלואידים נוכחים בזרע שלהם בהשוואה לזכרים עם קריוטיפים נורמליים12,13,14.

בניגוד לזרעונים, מעט מאוד ידוע על התוכן כרומוזומלי X של תאי שחלה (כולל ביציות, תאי גרנולוסה/תקה ותאי סטרומה) אצל אנשים עם סטייה כרומוזומלית, כמו גם על ההשלכות האפשריות של אנופלואידיות של תאים אלה על פוטנציאל הרבייה שלהם. סיבה חשובה למידע המועט על הקריוטיפ של תאי השחלות בהשוואה לזרעונים היא העובדה שנשים צריכות לעבור הליך פולשני כגון ניקוב זקיק או ניתוח להשגת ביציות או רקמת קליפת השחלות. לכן, קשה להשיג גמטות נקביות למטרות מחקר.

כיום, מחקר התערבות תצפית מבוצע בהולנד כדי לחקור את היעילות של שימור בהקפאה של רקמת השחלות בנשים צעירות עם TS15. מקטע אחד של רקמת קליפת השחלות של המטופלת היה זמין לזיהוי התוכן כרומוזומלי X של תאי השחלה16,17. במסגרת המחקר פותחה שיטה חדשנית המבוססת על FISH של רקמת קליפת השחלות המנותקת כדי לקבוע אם קיימות סטיות כרומוזומליות בתאי שחלה בנקבות הנושאות סטייה כרומוזומלית בתאים סומטיים שאינם שחלתיים, כגון לימפוציטים או תאים בוקאליים. בנוסף, נקבעה גם השפעת האנאופלואידיות בתאי השחלה על פוליקולוגנזה. לשם כך שונה פרוטוקול FISH מבוסס המאפשר ניתוח של מקטעים היסטולוגיים ברקמת קליפת השחלות לאחר פוליקולוגנזה מלאכותית במהלך השתלת קסנו ארוכת טווח בעכברים מדוכאי חיסון. במחקר זה אנו מציגים שתי שיטות המבוססות על FISH לקביעת התוכן הכרומוזומלי X בתאי שחלה ברקמת קליפת השחלות הלא מושתלת ומושתלת בנקבות עם סטיות כרומוזומליות X, במטרה לשפר את המדע הבסיסי בנושא זה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

פרוטוקול מחקר TurnerFertility אושר על ידי הוועדה המרכזית למחקר המערב נבדקים אנושיים (NL57738.000.16). במחקר זה התקבלה רקמת קליפת המוח השחלתית של 93 נשים עם TS. חומרים הדורשים אמצעי בטיחות מפורטים בטבלה 1.

טבלה 1: אמצעי בטיחות.

חומרהזארד
חומצה אצטיתכוויות עור חמורות וגירוי של מערכת הנשימה
קולגנאזמגרה את העיניים, מערכת הנשימה והעור
דאפימגרה את העיניים, מערכת הנשימה והעור
DNase Iמגרה את העיניים, מערכת הנשימה והעור
אתנולדליק מאוד
פורמלדהידרעיל לאחר שאיפה, בליעה ומגע עם העור
פורממיד
(בבדיקות פלואורסצנטיות)		עלול לפגוע בילד שטרם נולד
ליבראסהמגרה את העיניים, מערכת הנשימה והעור
מתנולדליק מאוד, רעיל בשאיפה, בליעה ומגע עם העור
נונידט P40מגרה את העור או העיניים
פפסיןמגרה את העיניים, מערכת הנשימה והעור
פרוטאינאז Kקשיי נשימה לאחר שאיפה
קסילןדליק מאוד, רעיל לאחר שאיפה ומגע עם העור. יש להימנע ממגע עם העיניים.

טבלה 1: חומרים הדורשים אמצעי בטיחות.

1. דגים על תאי קליפת שחלה בודדים מבודדים

  1. דיסוציאציה של רקמת קליפת השחלות כדי להשיג תאים בודדים
    1. חתכו את רקמת קליפת השחלות המשומרת/מופשרת לחתיכות קטנות של כ-1 מ"מ x 1 מ"מ x 1 מ"מ באמצעות אזמל.
    2. לעכל אנזימטית את מקטעי הרקמה ב 4 מ"ל של מחומם מראש (37 ° C) L15 בינוני המכיל 0.1 מ"ג / מ"ל תערובת אנזימי דיסוציאציה רקמה, 10 מיקרוגרם / מ"ל DNase I, ו 1 מ"ג / מ"ל collagenase I מ C. histolyticum במשך מקסימום של 75 דקות ב 37 ° C. מקפצים את תערובת העיכול מעלה ומטה כל 15 דקות.
    3. עצור את העיכול האנזימטי על ידי הוספת 4 מ"ל של L15 קר בתוספת 10% סרום בקר עוברי (FBS). שטפו את הרקמה המנותקת פעם אחת עם 8 מ"ל של מדיום L15 קר על ידי צנטריפוגה ב 500 x גרם והשהו מחדש ב 500 μL של מדיום L15 ללא מערבולות כדי למנוע נזק לתאים.
    4. מעבירים את תרחיף התא המכיל בעיקר תאי סטרומה בודדים וזקיקים קטנים (ביציות מוקפות בשכבה אחת של תאי גרנולוזה) לצלחת פטרי פלסטית ובוחנים את תרחיף התא תחת סטריאומיקרוסקופ (הגדלה פי 100).
    5. הרימו את הזקיקים הקטנים (<50 מיקרומטר) באופן ידני באמצעות פיפטה פלסטית של 75 מיקרומטר והעבירו את הזקיקים לטיפה של L15 בינוני בתוספת 10% FBS ב 4 °C כדי למנוע הצטברות של זקיקים. בצעו איסוף זקיקים למשך 30 דקות לכל היותר. כדי לשפר את התפשטות תאי הזקיקים לפני ניתוח FISH, להעביר את הזקיקים מטוהרים לתמיסה של 0.06% טריפסין, 1 מ"ג / מ"ל חומצה ethylenediaminetetraacetic (EDTA), ו 1 מ"ג / מ"ל גלוקוז לדגור במשך 20 דקות ב 37 ° C.
    6. להשיג תאי סטרומה השחלות מן ההשעיה התא קליפת המוח באמצעות פיפטה פלסטיק 75 מיקרומטר, תוך הקפדה מיוחדת כדי למנוע זיהום עם זקיקים קטנים.
  2. ניתוח FISH של תאי שחלה בודדים
    1. העבר את זקיקי השחלות המטופלים (מומלץ n = 5-20) עם טריפסין/EDTA/גלוקוז או תאי סטרומה (n > 1,000) לטיפות של 5 μL של 0.15 mM KCl/15 μL של מלח חוצץ פוספט של Dulbecco (DPBS) על מגלשה ודגור במשך 20 דקות ב 37 ° C.
    2. יבשו וקיבעו מראש את המגלשות ב-300 מיקרוליטר של 0.05 mM KCl/7.5% חומצה אצטית/22.5% מתנול למשך 2 דקות בטמפרטורת החדר (RT). כסו את המגלשות במתנול/חומצה אצטית (3:1) למשך 2 דקות ב-RT כדי לסיים את הקיבוע.
    3. הכינו נתרן ציטראט סטנדרטי פי 20 (SSC) על ידי הוספת 876 גרם נתרן כלורי ו-441 גרם טרי-נתרן ציטראט דיהידרט ב-5 ליטר מים מזוקקים. לאחר מכן, הוסף 100 מ"ל של SSC 20x ל 900 מ"ל של מים demineralized (demi) כדי לקבל 2x SSC. שטפו את הדגימה ב-2x SSC ב-73°C, כסו אותה ב-100 μL של 2% פרוטאינאז K, ואטמו אותה בכיסוי. דגרו על המגלשות במשך 10 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בתחנת ההכלאה.
    4. הסר את הכיסוי ושטוף את המגלשות במשך 5 דקות ב- DPBS ב- RT. קבע את הדגימה למשך 5 דקות עם 1% פורמלדהיד ב- RT. בשלב זה, החומר עדיין אינו מחובר במלואו למגלשות הזכוכית ולכן אין להניחו על משטח ניעור.
    5. שטפו את המגלשות במשך 5 דקות ב-DPBS ב-RT, ולאחר מכן התייבשו ב-70%, 80%, 90% ו-100% אתנול למשך 2 דקות כל אחת. יבשו באוויר את הדגימה המיובשת והכליאו אותה עם בדיקות עם תווית פלואורסצנטית.
    6. בחר בדיקה ספציפית לצנטרומר עבור כרומוזום X ובדיקה צנטרומרית ספציפית לכרומוזום אחר כבקרה כדי לקבוע את התוכן כרומוזומלי X של תאי השחלה. במקרה זה, נעשה שימוש בבדיקות ספציפיות לצנטרומרה עבור כרומוזום X (CEP X [DXZ1]) המסומן ישירות עם פלואורוכרום ספקטרוםירוק וכרומוזום 18 (CEP 18 [D18Z1]) המסומן ישירות עם פלואורוכרום ספקטרום.
    7. הוסף 1 μL של CEP X, 1 μL של CEP 18 ו- 18 μL של חיץ ההכלאה לדגימה ואטם עם מכסה המודבק לשקופיות כדי למנוע אידוי של הבדיקה במהלך הכלאה. העבר את המגלשות לתחנת ההכלאה לדנטורציה ב 73 ° C למשך 3 דקות, ואחריה הכלאה במהלך דגירה לילה ב 37 °C (77 °F).
    8. הסר את תלוש הכיסוי ואת כל הדבק שנותר מהמגלשה לאחר הכלאה. שטפו את המגלשות ב-0.4x SSC/0.3% Tween-20 ב-72°C למשך 2 דקות, ולאחר מכן דגירה למשך דקה אחת ב-2x SSC/0.1% Tween-20 ב-RT.
    9. יש לייבש את המגלשות על ידי דגירות עוקבות של 2 דקות ב-70%, 80%, 90% ו-100% אתנול ולייבש באוויר בחושך. כסו את השקופיות באמצעי הרכבה המכיל 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). יש לשמור על טמפרטורה של -20°C למשך 10 דקות לפחות לפני ניתוח על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
  3. דימות
    1. בחן את האותות עבור כרומוזום X באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי המקושר לתוכנת עיבוד תמונה.
      1. ראשית, בחר DAPI פלואורוכרום.
        1. קבל תמונה על-ידי בחירה באפשרות New Cell > Live > Capture בהגדלה של 630x. יופיע חלון חדש עם הסף. הגדר את הפס הכחול של הסף ל- 0 כדי למזער את הרקע ואת הסרגל האדום למקסימום (255) כדי להפוך את האותות לבהירים יותר. לחץ על קבל.
        2. יופיע חלון חדש עם שיפור עם הצעה לכהה/בהיר יותר (12), רדיוס (3) ועומק (1). השתמש בערכים המוצעים או התאם אותם אם אינך מרוצה.
      2. שנית, בחר fluorochrome SpectrumOrange ולחץ על לכידה.
        1. הגדר את הפס הכחול של הסף ל- 0 כדי למזער את הרקע ואת הסרגל האדום למקסימום (255) כדי להפוך את האותות לבהירים יותר. לחץ על קבל.
        2. החלון עם השיפור יופיע עם הצעה לכהה/בהיר יותר (-11), רדיוס (2.7) ועומק (0.6). השתמש בערכים המוצעים או התאם אותם אם אינך מרוצה.
      3. לבסוף, בחר fluorochrome SpectrumGreen ולחץ על לכידה.
        1. הגדר את הפס הכחול של הסף ל- 0 כדי למזער את הרקע ואת הסרגל האדום למקסימום (255) כדי להפוך את האותות לבהירים יותר. לחץ על קבל.
        2. החלון עם השיפור יופיע עם הצעה לכהה/בהיר יותר (0), רדיוס (3) ועומק (0). השתמש בערכים המוצעים או התאם אותם אם אינך מרוצה. שמור את התמונה בקובץ חדש שנוצר.
          הערה: תאים סומטיים הוערכו רק כאשר שני אותות של כרומוזום הביקורת 18 נראו. ברוב הביציות ניתן היה לזהות רק אות אחד לכל כרומוזום.
    2. אחסן את השקופיות בחושך ב- 4 ° C לאחר ניתוח כדי למנוע אובדן אותות.

2. דגים על קטעי פרפין ברקמת קליפת השחלות המושתלת

הערה: שבר אחד של רקמת קליפת המוח השחלתית המשומרת/מופשרת בהקפאה של 18 נקבות עם TS הושתל בעכברים משולבים חמורים (SCID) למשך 5 חודשים. הליך הקסנוגרפטינג תואר בעבר ונערך באוניברסיטה הקתולית של לוביין (בריסל, בלגיה) בהתאם להנחיות המקומיות של הוועדה לחקר בעלי חיים בנוגע לרווחת בעלי חיים (סימוכין 2014/UCL/MD/007)18,19.

  1. בחירת מקטעים של רקמת קליפת השחלות המכילה זקיקים
    1. קיבעו רקמת קליפת השחלות בפורמלדהיד 4% והטמיעו את הרקמה בפרפין. חותכים את הבלוקים עם אזמל כדי להסיר פרפין נוסף וחותכים את גוש הפרפין לעובי 4 מיקרומטר על מיקרוטום סיבוב.
    2. בחר כל חלק שביעי של סרט פרפין עבור צביעת hematoxylin ו eosin (HE) כדי לקבוע אילו חלקים מכילים זקיקים. שים את החלק באמבט מים ב 40-45 מעלות צלזיוס ולהרכיב אותם על שקופיות מיקרוסקופ immunohistochemistry.
  2. דה-פרפיניזציה וצביעת HE
    1. הניחו את המגלשות על כיריים למשך 10 דקות בטמפרטורה של 60°C, ולאחר מכן טבלו את המגלשות ב-100% קסילן למשך 5 דקות. אין צורך למקם את המגלשות ישירות על הכיריים. לחות את החלקים עבור 15 s ב 100% אתנול, ואחריו 2 x 15 s ב 96% אתנול. שטפו את המגלשות במי ברז במשך 2 דקות.
    2. הכתימו את המגלשות בהמטוקסילין למשך 10 דקות ולאחר מכן שטפו את המגלשות לזמן קצר במי ברז. לטבול בקצרה את שקופיות בתמיסת ביקרבונט (100 גרם של מגנזיום גופרתי ו 10 גרם של סודיום ביקרבונט ב 5 L של מים מזוקקים). שטפו את המגלשות במי ברז במשך 5 דקות.
    3. הכתימו את המגלשות באאוסין למשך 4 דקות וייבשו את המגלשות שלוש פעמים עם 100% אתנול, ולאחר מכן קסילן. מכסים את כתמי ה-HE בשקופיות ומעריכים את קטעי ה-HE תחת מיקרוסקופ אור כדי לבחור את המקטעים עם זקיקים (הגדלה פי 100).
  3. טיפול מקדים והכלאה של מקטעי פרפין לדגי DNA
    1. בחר מקטעים חדשים שהיו מונחים לפני או אחרי החלק שהכיל זקיקים מסרט הפרפין. הרכיבו קטע אחד על מגלשת זכוכית. יבשו את חלקי הפרפין למשך 45 דקות לפחות על כיריים בטמפרטורה של 56°C. אין צורך למקם את המגלשות ישירות על הכיריים.
    2. deparaffinize את החלקים ב xylene במשך 10 דקות. טבלו את המגלשות באתנול 99.5% ושטפו אותן במשך 5 דקות במי ברז. טפל מראש בשקופיות עם תמיסת אחזור מטרה (pH נמוך) למשך 10 דקות ב-96°C. לאחר הקירור, שטפו את המגלשות במים מזוקקים.
    3. טפל בשקופיות במשך 5 דקות עם חומצה הידרוכלורית 0.01 M, ולאחר מכן עיכול פפסין (200 U / mL) במשך 15 דקות ב 37 ° C. שטפו שוב את המגלשות בחומצה הידרוכלורית 0.01 M ולאחר מכן ב-PBS.
    4. קבעו את המגלשות בפורמלדהיד/PBS 1% למשך 5 דקות. שטפו את המגלשות לזמן קצר ב-PBS, ולאחר מכן שוב במי דמי. יש לייבש את המגלשות באתנול 99.5% ולתת להן להתייבש באוויר.
    5. בחר בדיקה ספציפית לצנטרומרה עבור כרומוזום X ובדיקה צנטרומרית ספציפית לכרומוזום אחר כבקרה כדי לקבוע את התוכן כרומוזומלי X של תאי גרנולוזה. כאן, כרומוזום 18 משמש כבקרה.
    6. יש למרוח 5 μL של בדיקה CEP 18 (D18Z1) המסומנת ישירות ב-fluorochrome SpectrumGreen ו-probe CEP X (DXZ1) המסומן ישירות ב-fluorochrome SpectrumRed על השקופיות שטופלו מראש. יש למרוח כיסוי ולאטום את האזור בדבק צילום. הניחו את המגלשות בהכלאה לדנטורציה ב-80°C למשך 10 דקות והכלאה למשך לילה ב-37°C.
    7. למחרת, שטפו את המגלשות במשך 5 דקות ב-2x SSC ב-42°C, ולאחר מכן שטיפה של 2 דקות ו-1 דקות ב-0.3% Nonidet P40 ב-73°C. רענן את 2x SSC ושטוף את המגלשות שוב במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. מכסים את הקובט כך שהחלקים נשמרים בחושך.
    8. שטפו את המגלשות לזמן קצר במים מזוקקים. יש לייבש את המגלשות באתנול 99.5% ולתת להן להתייבש שוב באוויר. לבסוף, טען את השקופיות עם פתרון המכיל DAPI ואמצעי הרכבה.
  4. דימות
    1. נתח את התוצאות תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי בהגדלה של 630x. פתח את תוכנת עיבוד התמונה במחשב. בחר FISH כפרופיל.
    2. בדוק אם פליטת DAPI מוגדרת ל- 431 ננומטר והעירור ל- 359 ננומטר, פליטה אדומה של טקסס ב- 613 ננומטר ועירור ב- 595 ננומטר, ופליטת FITC ב- 519 ננומטר ועירור ב- 495 ננומטר.
    3. רכשו תמונה באמצעות בחירה באפשרות Live > Capture Single Image. מטב את איכות התמונה באמצעות התאמת החשיפה והרווח באמצעות הזזת מחוון החשיפה והרווח בתפריט 'תמונה ' משמאל (לדוגמה, חשיפה: 212 אלפיות השנייה והרווח: 7.9). החשיפה והרווח הנדרשים עשויים להשתנות בהתאם לתמונה; שימו לב לשינויים במהלך תהליך זה לקבלת תמונה ממוטבת. שמור את התמונה בקובץ חדש שנוצר.
    4. אחסן את השקופיות בחושך ב- 4 ° C לאחר ניתוח כדי למנוע אובדן אותות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

דגים על תאי שחלה מבודדים לפני ההשתלה
רקמת קליפת השחלות בהקפאה מנקבות עם 45,X/46,XX (מטופלת A) או 45,X/46,XX/47,XXX (מטופלת B) TS שימשו להמחשת התוצאות באמצעות פרוטוקול זה. בחולה A, ל-50% מהלימפוציטים היה קריוטיפ 45,X ול-50% היה 46,XX. בחולה B, 38% מהלימפוציטים היו 45,X, 28% היו 46,XX ו-34% היו 47,XXX. בדיקות ספציפיות לצנטרומיר עבור כרומוזום X (ירוק) וכרומוזום 18 כביקורת (אדום) שימשו כדי לקבוע את התוכן כרומוזומלי X של תאי גרנולוזה בודדים, תאי סטרומה וביציות שבודדו מרקמת קליפת השחלות של חולי TS ללא השתלת...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

ניתוח FISH הוא טכניקה ידועה לזיהוי סטיות כרומוזומליות X בלימפוציטים או תאי buccal של זכרים ונקבותכאחד 10. מספר מחקרים תיארו FISH על גמטות של זכרים עם סטיות כרומוזומליות X, אך מידע מפורט שהתקבל על ידי FISH על תאי שחלה מנקבות עם סטיות כרומוזומליות X עדיין חסר14. מאמר זה מציג שיטות חדשניות המבוססות על FISH כדי לקבוע אם אנופלואידיות קיימת בתאי השחלות של רקמת קליפת המוח השחלתית הלא מושתלת ומושתלת מנקבות עם סטיות כרומוזומליות X.

האתגר העיקרי של הפרוטוק...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

המחברים מודים למרג'ו ואן בראקל, דומיניק סמיטס, גיום ואן דה זנדה, פטרישיה ואן קליף ומילאן אינטזאר על מומחיותם ועזרתם הטכנית. מקורות מימון: Merck Serono (A16-1395), Goodlife ו-Ferring.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
חומצה אצטיתBiosolve BV0001070602BS
צנטריפוגה 1200Hettich אוניברסלי4140
קולגנאז ISigma131470
CoverslipVWR0631-0146
DAPIוקטורH-1200
DNase IRoche10104159001
דולבקו s פוספט חוצץ מלח LonzaBE17-513Q
EDTAMerck108421
Eosin-YSigma1159350100
אתנולEMSURE1009832500
סרום בקר עוברי (FBS)טכנולוגיית חיים10100147
מיקרוסקופ פלואורסצנטי למקטעים DM4 BLeica Microsystems 
מיקרוסקופ פלואורסצנטי A1Zeiss AXIO
בדיקות עם תווית פלואורסצנטית לתאים מנותקיםאבוט דיאגנוסטיקהCEPX (DXZ1) 05J1023
CEP18 (D18Z1) 05J0818
בדיקות עם תווית פלואורסצנטית לקטעי רקמותאבוט דיאגנוסטיקסCEP X (DXZ1 05J08-023
CEP 18 (D18Z1)  05J10-028
פורמלדהידדבק 108337
גלוקוזמרק
DakoS2451
חומצה הידרוכלוריתMerck1003171000
תוכנה לעיבוד תמונה תאי קליפת השחלה בודדים (Cytovision 7.7)Leica Biosystems
תוכנה לעיבוד תמונה על חתכי פראפין Leica Application Suitex (3.7.5.24914)
שקופיות מיקרוסקופ אימונוהיטוכימיהDakoK802021-2
L15Lonza12-700Q
Liberase DHRoche05 401 151 001
מיקרוסקופ אורZeiss מערב גרמניה
מגנזיום סולפטMerckA335586
מתנולHoneywell14262-1L
הרכבה בינוניתVectashield, וקטורH-1000
Nonidet P40Sigma7385-1L
פרפיןPoth Hile2712.20.10
פפסיןסיגמאP7000-25G
תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS)Gibco11530546
פלסטיק פיפטהCooperSurgical7-72-4075/1
אשלגן כלורי Merck1049361000
Proteinase KQiagen19131
מיקרוטום סיבוב HM 355Sתרמו מדעי
Dahlhausen11.000.00.515
שקופית לדגים על תאים מנותקיםתרמו מדעיJ1810AM1JZ
נתרן ביקרבונטסיגמא55761-500G
נתרן ציטראט סטנדרטי (SSC)פישר מדעי, Invitrogen10515203
סטריאומיקרוסקופ IX 70אולימפוס
   DakoGV80511-2
TrypsinSigmaT4799
Tween-20ThermoFisher85113
XyleneBOOM760518191000
סיגמא 252549 (Fixogum)Leica Microsystems LK071A המטוקסילין סיגמא 1159380025 מאגר הכלאה Abott Diagnostics 32-804826/06J67-001 תחנת הכלאה  אזמל פתרון אחזור מטרה

מקורות

  1. Vander Borght, M., Wyns, C. Fertility and infertility: Definition and epidemiology. Clinical Biochemistry. 62, 2-10 (2018).
  2. Yatsenko, S. A., Rajkovic, A. Genetics of human female infertility. Biology of Reproduction. 101 (3), 549-566 (2019).
  3. Yahaya, T. O., et al. Chromosomal abnormalities predisposing to infertility, testing, and management: a narrative review. Bulletin of the National Research Centre. 45 (1), 65(2021).
  4. Foresta, C., Ferlin, A., Gianaroli, L., Dallapiccola, B. Guidelines for the appropriate use of genetic tests in infertile couples. European Journal of Human Genetics. 10 (5), 303-312 (2002).
  5. Heard, E., Turner, J. Function of the sex chromosomes in mammalian fertility. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (10), 002675(2011).
  6. Reynaud, K., et al. Number of ovarian follicles in human fetuses with the 45,X karyotype. Fertility and Sterility. 81 (4), 1112-1119 (2004).
  7. Otter, M., Schrander-Stumpel, C. T., Curfs, L. M. Triple X syndrome: a review of the literature. European Journal of Human Genetics. 18 (3), 265-271 (2010).
  8. Modi, D. N., Sane, S., Bhartiya, D. Accelerated germ cell apoptosis in sex chromosome aneuploid fetal human gonads. Molecular Human Reproduction. 9 (4), 219-225 (2003).
  9. Hassold, T., Hunt, P. To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy. Nature Reviews Genetics. 2 (4), 280-291 (2001).
  10. Huber, D., von Voithenberg, L. V., Kaigala, G. V. Fluorescence in situ hybridization (FISH): History, limitations and what to expect from micro-scale FISH. Micro and Nano Engineering. 1, 15-24 (2018).
  11. Hu, L., et al. Fluorescence in situ hybridization (FISH): an increasingly demanded tool for biomarker research and personalized medicine. Biomarker Research. 2 (1), 3(2014).
  12. Hwang, K., Weedin, J. W., Lamb, D. J. The use of fluorescent in situ hybridization in male infertility. Therapeutic Advances in Urology. 2 (4), 157-169 (2010).
  13. Ramasamy, R., Besada, S., Lamb, D. J. Fluorescent in situ hybridization of human sperm: diagnostics, indications, and therapeutic implications. Fertility and Sterility. 102 (6), 1534-1539 (2014).
  14. Chatziparasidou, A., Christoforidis, N., Samolada, G., Nijs, M. Sperm aneuploidy in infertile male patients: a systematic review of the literature. Andrologia. 47 (8), 847-860 (2015).
  15. Schleedoorn, M., et al. TurnerFertility trial: PROTOCOL for an observational cohort study to describe the efficacy of ovarian tissue cryopreservation for fertility preservation in females with Turner syndrome. BMJ Open. 9 (12), 030855(2019).
  16. Peek, R., et al. Ovarian follicles of young patients with Turner's syndrome contain normal oocytes but monosomic 45,X granulosa cells. Human Reproduction. 34 (9), 1686-1696 (2019).
  17. Nadesapillai, S., et al. Why are some patients with 45,X Turner syndrome fertile? A young girl with classical 45,X Turner syndrome and a cryptic mosaicism in the ovary. Fertility and Sterility. 115 (5), 1280-1287 (2021).
  18. Dolmans, M. M., et al. Reimplantation of cryopreserved ovarian tissue from patients with acute lymphoblastic leukemia is potentially unsafe. Blood. 116 (16), 2908-2914 (2010).
  19. Dath, C., et al. Xenotransplantation of human ovarian tissue to nude mice: comparison between four grafting sites. Human Reproduction. 25 (7), 1734-1743 (2010).
  20. Cacciottola, L., Donnez, J., Dolmans, M. M. Ovarian tissue damage after grafting: systematic review of strategies to improve follicle outcomes. Reproductive BioMedicine Online. 43 (3), 351-369 (2021).
  21. Bishop, R. Applications of fluorescence in situ hybridization (FISH) in detecting genetic aberrations of medical significance. Bioscience Horizons. 3 (1), 85-95 (2010).
  22. Burgoyne, P. S., Mahadevaiah, S. K., Turner, J. M. The consequences of asynapsis for mammalian meiosis. Nature Reviews Genetics. 10 (3), 207-216 (2009).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

ניתוח FISHרקמת קליפת השחלהחריגות כרומוזומליותפוליקולוגנזהתאי גרנולוזהעיכול אנזימטימיקרוסקופיה פלואורסצנטית
חקר סטיות X כרומוזומליות בתאי שחלה באמצעות הכלאה פלואורסצנטית באתרו
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.