מאמר שיטה

חקר סטיות X כרומוזומליות בתאי שחלה באמצעות הכלאה פלואורסצנטית באתרו

DOI:

10.3791/64734

⸱

7 באפריל 2023

 ,  ,  ,  , 
1Department of Obstetrics and Gynecology, Radboudumc, 2Department of Pediatrics, Radboudumc, Amalia Children’s Hospital, 3Department of Reproductive Medicine, Nij Geertgen Center for Fertility

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מאמר זה מציג שתי שיטות המבוססות על הכלאה פלואורסצנטית באתרו כדי לקבוע את התוכן כרומוזומלי X של תאי שחלה ברקמת קליפת השחלות הלא מושתלת ומושתלת מנקבות עם סטיות כרומוזומליות X.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מיליוני אנשים ברחבי העולם מתמודדים עם נושאים הקשורים לפוריות. ירידה בפוריות, או אפילו אי פוריות, עשויה לנבוע מסיבות רבות ושונות, כולל הפרעות גנטיות, אשר הפרעות כרומוזומליות הן הנפוצות ביותר. הכלאה פלואורסצנטית באתרו (FISH) היא שיטה ידועה ונפוצה לאיתור סטיות כרומוזומליות בבני אדם. FISH משמש בעיקר לניתוח הפרעות כרומוזומליות בזרעונים של זכרים עם סטיות כרומוזומליות מספריות או מבניות. יתר על כן, טכניקה זו מיושמת לעתים קרובות גם אצל נשים כדי לזהות סטיות כרומוזומליות X הידועות כגורמות לדיסגנזה שחלתית. עם זאת, מידע על התוכן כרומוזומלי X של תאי שחלה מנקבות עם סטיות כרומוזומליות X בלימפוציטים ו / או תאים buccal עדיין חסר.

מטרת מחקר זה היא לקדם מחקר בסיסי לגבי סטיות כרומוזומליות X בנקבות, על ידי הצגת שתי שיטות המבוססות על FISH לזיהוי התוכן הכרומוזומלי X של תאי השחלה. ראשית, מתוארת שיטה לקביעת התוכן הכרומוזומלי X של תאי שחלה מבודדים (ביציות, תאי גרנולוזה ותאי סטרומה) ברקמת קליפת השחלות שלא הושתלה מנקבות עם סטיות כרומוזומליות X. השיטה השנייה מכוונת להערכת ההשפעה של סטיות כרומוזומליות על פוליקולוגנזה על ידי קביעת התוכן הכרומוזומלי X של תאי שחלה של זקיקים משניים ואנטרליים שזה עתה נוצרו ברקמת השחלה, מנקבות עם סטיות כרומוזומליות X לאחר השתלה ארוכת טווח בעכברים מדוכאי חיסון. שתי השיטות יכולות להיות מועילות במחקר עתידי כדי לקבל תובנה לגבי פוטנציאל הרבייה של נקבות עם סטיות כרומוזומליות X.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אי פוריות היא בעיה בריאותית של מערכת הרבייה הגברית או הנשית, המשפיעה על כ -186 מיליון אנשים בגיל הפוריות ברחבי העולם1. לפחות 35% מהזוגות העקרים, אי פוריות נגרמת על ידי הפרעה של מערכת הרבייה הנשית2. ישנם גורמים רבים שיכולים לגרום לאי פוריות נשית, כגון גורמים גנטיים, הפרעות בדרכי המין, תפקוד אנדוקריני, מחלות דלקתיות וטיפול יאטרוגני3.

הפרעות גנטיות קיימות בכ -10% מהנקבות העקרים 4,5. מכל ההפרעות הגנטיות, סטיות כרומוזום X הן הגורם השכיח ביותר לדיסגנזה שחלתית2. מספר מחקרים דיווחו כי סטיות כרומו....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול מחקר TurnerFertility אושר על ידי הוועדה המרכזית למחקר המערב נבדקים אנושיים (NL57738.000.16). במחקר זה התקבלה רקמת קליפת המוח השחלתית של 93 נשים עם TS. חומרים הדורשים אמצעי בטיחות מפורטים בטבלה 1.

טבלה 1: אמצעי בטיחות.

חומרהזארד
חומצה אצטיתכוויות עור חמורות וגירוי של מערכת הנשימה
קולגנאזמגרה את העיניים, מערכת הנשימה והעור
דאפי....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

דגים על תאי שחלה מבודדים לפני ההשתלה
רקמת קליפת השחלות בהקפאה מנקבות עם 45,X/46,XX (מטופלת A) או 45,X/46,XX/47,XXX (מטופלת B) TS שימשו להמחשת התוצאות באמצעות פרוטוקול זה. בחולה A, ל-50% מהלימפוציטים היה קריוטיפ 45,X ול-50% היה 46,XX. בחולה B, 38% מהלימפוציטים היו 45,X, 28% היו 46,XX ו-34% היו 47,XXX. בדיקות ספציפיות לצנטרומיר עבור כרומוזום X (ירוק) וכרומוזום 18 כביקורת (אדום) שימשו כדי לקבוע את התוכן כרומוזומלי X של תאי גרנולוזה בודדים, תאי סטרומה וביציות שבודדו מרקמת קליפת השחלות של חולי TS ללא השתלת.......

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ניתוח FISH הוא טכניקה ידועה לזיהוי סטיות כרומוזומליות X בלימפוציטים או תאי buccal של זכרים ונקבותכאחד 10. מספר מחקרים תיארו FISH על גמטות של זכרים עם סטיות כרומוזומליות X, אך מידע מפורט שהתקבל על ידי FISH על תאי שחלה מנקבות עם סטיות כרומוזומליות X עדיין חסר14. מאמר זה מציג שיטות חדשניות המבוססות על FISH כדי לקבוע אם אנופלואידיות קיימת בתאי השחלות של רקמת קליפת המוח השחלתית הלא מושתלת ומושתלת מנקבות עם סטיות כרומוזומליות X.

האתגר העיקרי של הפרוטוק.......

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מודים למרג'ו ואן בראקל, דומיניק סמיטס, גיום ואן דה זנדה, פטרישיה ואן קליף ומילאן אינטזאר על מומחיותם ועזרתם הטכנית. מקורות מימון: Merck Serono (A16-1395), Goodlife ו-Ferring.

....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
חומצה אצטיתBiosolve BV0001070602BS
צנטריפוגה 1200Hettich אוניברסלי4140
קולגנאז ISigma131470
CoverslipVWR0631-0146
DAPIוקטורH-1200
DNase IRoche10104159001
דולבקו s פוספט חוצץ מלח LonzaBE17-513Q
EDTAMerck108421
Eosin-YSigma1159350100
אתנולEMSURE1009832500
סרום בקר עוברי (FBS)טכנולוגיית חיים10100147
מיקרוסקופ פלואורסצנטי למקטעים DM4 BLeica Microsystems 
מיקרוסקופ פלואורסצנטי A1Zeiss AXIO
בדיקות עם תווית פלואורסצנטית לתאים מנותקיםאבוט דיאגנוסטיקהCEPX (DXZ1) 05J1023
CEP18 (D18Z1) 05J0818
בדיקות עם תווית פלואורסצנטית לקטעי רקמותאבוט דיאגנוסטיקסCEP X (DXZ1 05J08-023
CEP 18 (D18Z1)  05J10-028
פורמלדהידדבק 108337
גלוקוזמרק
DakoS2451
חומצה הידרוכלוריתMerck1003171000
תוכנה לעיבוד תמונה תאי קליפת השחלה בודדים (Cytovision 7.7)Leica Biosystems
תוכנה לעיבוד תמונה על חתכי פראפין Leica Application Suitex (3.7.5.24914)
שקופיות מיקרוסקופ אימונוהיטוכימיהDakoK802021-2
L15Lonza12-700Q
Liberase DHRoche05 401 151 001
מיקרוסקופ אורZeiss מערב גרמניה
מגנזיום סולפטMerckA335586
מתנולHoneywell14262-1L
הרכבה בינוניתVectashield, וקטורH-1000
Nonidet P40Sigma7385-1L
פרפיןPoth Hile2712.20.10
פפסיןסיגמאP7000-25G
תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS)Gibco11530546
פלסטיק פיפטהCooperSurgical7-72-4075/1
אשלגן כלורי Merck1049361000
Proteinase KQiagen19131
מיקרוטום סיבוב HM 355Sתרמו מדעי
Dahlhausen11.000.00.515
שקופית לדגים על תאים מנותקיםתרמו מדעיJ1810AM1JZ
נתרן ביקרבונטסיגמא55761-500G
נתרן ציטראט סטנדרטי (SSC)פישר מדעי, Invitrogen10515203
סטריאומיקרוסקופ IX 70אולימפוס
   DakoGV80511-2
TrypsinSigmaT4799
Tween-20ThermoFisher85113
XyleneBOOM760518191000
סיגמא 252549 (Fixogum)Leica Microsystems LK071A המטוקסילין סיגמא 1159380025 מאגר הכלאה Abott Diagnostics 32-804826/06J67-001 תחנת הכלאה  אזמל פתרון אחזור מטרה

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Vander Borght, M., Wyns, C. Fertility and infertility: Definition and epidemiology. Clinical Biochemistry. 62, 2-10 (2018).
  2. Yatsenko, S. A., Rajkovic, A. Genetics of human female infertility. Biology of Reproduction. 101 (3), 549-566 (2019).
  3. Yahaya, T. O., et al....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

FISHe

מאמרים קשורים