הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

שיטות לחקר תרומות הרחם לביסוס הריון במודל עכבר לכריתת שחלות

2.8K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/64763

⸱

7 באפריל 2023

 ,  ,  ,  ,  , 
1Biomedicine Discovery Institute, Department of Anatomy and Developmental Biology, Monash University, 2Gynaecology Research Centre, Royal Women’s Hospital and Department of Obstetrics and Gynaecology, University of Melbourne, 3The Ritchie Centre, Hudson Institute for Medical Research and Department of Obstetrics and Gynaecology, Monash University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

ביסוס הריון הוא תהליך דינמי הכולל הצלבה מורכבת של עוברים ורחם. התרומות המדויקות של סביבת הרחם האימהית לתהליכים אלה נותרו תחום מחקר פעיל. כאן, פרוטוקולים מפורטים מסופקים כדי לסייע בעיצוב מודלים של בעלי חיים in vivo כדי לענות על שאלות מחקר אלה.

תקציר

כדי לבסס הריון, בלסטוציסט בר קיימא חייב לקיים אינטראקציה מוצלחת עם רירית הרחם (רירית הרחם) כדי להקל על ההשתלה והיווצרות השליה ולאפשר הריון מתמשך. המגבלות להצלחת הריון הנגרמות על ידי מומים עובריים ידועות היטב והתגברו במידה רבה בעשורים האחרונים עם עליית הפריה חוץ גופית (IVF) וטכנולוגיות רבייה מסייעות. עם זאת, עד כה, התחום לא התגבר על המגבלות הנגרמות על ידי אנדומטריום שאינו פתוח כראוי, ובכך הביא לקיפאון בשיעורי ההצלחה של הפריה חוץ גופית. תפקודי השחלות ורירית הרחם שלובים זה בזה באופן הדוק, שכן הורמונים המיוצרים על ידי השחלה אחראים למחזוריות הווסת של רירית הרחם. לכן, בעת שימוש במודלים מכרסמים של הריון, זה יכול להיות קשה לקבוע אם תוצאה שנצפתה נובעת מגירעון בשחלות או ברחם. כדי להתגבר על כך, פותח מודל עכבר שחלתי עם החזרת עוברים או דצידואליזציה מלאכותית כדי לאפשר מחקר של תרומות ספציפיות לרחם להריון. מאמר זה יספק הוראות כיצד לבצע כריתת שחלות ויציע תובנות לגבי טכניקות שונות לאספקת הורמונים אקסוגניים לתמיכה בדצידואליזציה מלאכותית מוצלחת או בהריון לאחר החזרת עוברים מתורמים בריאים. טכניקות אלה כוללות הזרקה תת עורית, כדוריות שחרור איטי ומשאבות מיני אוסמוטיות. יידונו היתרונות והחסרונות העיקריים של כל שיטה, המאפשרים לחוקרים לבחור את עיצוב המחקר הטוב ביותר לשאלת המחקר הספציפית שלהם.

מבוא

עם השימוש הגובר בטכנולוגיות רבייה בסיוע בעשורים האחרונים, התגברו על מחסומים רבים להתעברות, המאפשרים לזוגות רבים להקים משפחות למרות בעיות פוריות1. לעתים קרובות ניתן לעקוף ביציות או גירעונות זרע באמצעות הפריה חוץ גופית או הזרקת זרע intracytoplasmic; עם זאת, נושאים הקשורים לרחם וקליטת רירית הרחם נותרו "קופסה שחורה" חמקמקה של פוטנציאל רבייה2.

הריון נוצר כאשר עובר באיכות גבוהה בהצלחה אינטראקציה עם אנדומטריום פתוח (רירית הרחם). הסיכויים להריון מוצלח בכל מחזור חודשי נתון נמוכים, בסביבות 30%3,4. מבין אלה שמצליחים, רק 50%-60% מתקדמים מעבר לשבוע 20 להריון, כאשר כישלון ההשתלה אחראי ל-75% מההריונות שאינם מגיעים לשבוע 203. למרות נתונים אלה מסוף שנות התשעים, התחום עדיין לא התגבר על המגבלות הנגרמות על ידי רירית הרחם שאינה קולטת כראוי. זה הביא לקיפאון - ולפעמים לירידה - בשיעורי ההצלחה של הפריה חוץ גופית בשנים האחרונות 5,6.

לנשים עם אי פוריות בלתי מוסברת יש לעתים קרובות חלון פתוח שנעקר או שאינן מסוגלות להשיג פתיחות מסיבות לא ידועות. לאחרונה פותח מערך קליטת רירית הרחם, המעריך ביטוי של מאות גנים במטרה להתאים את עיתוי החזרת העוברים לחלון הקבלה של הפרט 7,8,9. עם זאת, בתחום עדיין חסרה הבנה של הפתוגנזה של סיבוכי הריון הבאים לידי ביטוי לאחר השלמת תהליך ההשתלה.

מערכת הרבייה הנשית דינמית מאוד ונמצאת תחת בקרה הורמונלית הדוקה. ציר ההיפותלמוס-יותרת המוח-גונדל (HPG) שולט בשחרור הורמון מחלמן והורמון מגרה זקיקים, המווסתים היבטים של מחזור השחלות, כולל הבשלת זקיקים ופעילות אסטרוגן ופרוגסטרון. בתורו, מחזור הווסת הרחם מוסדר על ידי אסטרוגנים ופרוגסטרון10,11. לפיכך, חקר מנגנונים ביולוגיים של הרחם מסובך על ידי השפעה השחלות. לדוגמה, כאשר חוקרים כיצד טיפולים בסרטן עשויים להשפיע על הרחם, זה יכול להיות קשה להבחין אם כל פנוטיפ הרחם שנצפה (כגון אובדן הריון או acyclicity הווסת) הוא תוצאה של עלבון ישיר לרחם או תוצאה של נזק לשחלות.

כדי להבין באופן מקיף את הפוריות, יש לאפיין את תרומת הרחם להריון. חשוב לציין, הבנה זו חייבת להתרחב מעבר לתפקוד הרחם תחת שליטה שחלתית. לא ניתן לחקור זאת בבני אדם; לכן, מודלים של בעלי חיים משמשים לעתים קרובות. ככזה, כריתת שחלות (OVX) משמשת בדרך כלל כדי לאפשר לחוקרים לווסת את מחזורי הייחום של מכרסמים (בדומה למחזור החודשי) על ידי אספקת הורמונים באופן אקסוגני. בנוסף, OVX מאפשר לחקור את תגובות הרחם ללא תלות בהשפעה השחלתית12. עם זאת, אם הורמונים אינם מסופקים באופן מיידי לאחר OVX, פנוטיפ גיל המעבר יהיה בסופו של דבר, אשר צריך להישקל בזהירות על ידי החוקרים.

OVX משמש לעתים קרובות בדגמי מכרסמים 13,14,15,16,17 וקל יחסית לבצע אותו לאחר אימון מתאים. השיטות משתנות בהתאם להסרת השחלה לבדה או השחלה והאובידוקט, כמו גם בהתאם לגיל החיה (לבעלי חיים בוגרים, רוכבי אופניים יש שחלות גדולות יותר עם קורפוס לוטאום גלוי על פני השטח שלהם, כלומר השחלות שלהם קל יותר לדמיין). באופן דומה, קיימות שיטות רבות לתוספי הורמונים, כולל זריקות תת עוריות14, כדורים בשחרור איטי 15, משאבות מיני אוסמוטיות18 והשתלת שחלות.

במאמר זה, הוראות מפורטות ניתנות כיצד לבצע כריתת שחלות ולהכין שלושה סוגים של תוספי הורמונים, כולל זריקות תת עוריות, כדורים בשחרור איטי, משאבות מיני אוסמוטיות. שני פרוטוקולים מפורטים מסופקים עבור נקודות קצה ניסיוניות הנהנות מ- OVX ואחריו תוספת הורמונים אקסוגנית (החזרת עוברים ודצידואליזציה מלאכותית). מאמר זה דן בחוזקות ובחולשות של כל גישה במטרה להנחות חוקרים כיצד לבצע מחקרים לבידוד ההשפעות על הרחם, במיוחד בתחומי המחקר הריון ופוריות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל בעלי החיים שוכנו במתקנים מבוקרי טמפרטורה ובעלי מחסום גבוה (מעבדת המחקר לבעלי חיים של אוניברסיטת מונאש) עם גישה חופשית למזון ומים ומחזור אור כהה של 12 שעות. כל ההליכים בוצעו בהתאם לאישור ועדת האתיקה של פלטפורמת המחקר בבעלי חיים מונאש (#21908, 17971) ובוצעו בהתאם לקוד העיסוק של המועצה הלאומית לבריאות ולמחקר רפואי לטיפול ושימוש בבעלי חיים.

1. הכנה כירורגית

  1. Autoclave כל כלי הניתוח, גזה, מגבות נייר הדרושים עבור ההליכים על מחזור סחורות קשות / יבש ב 121 ° C עם זמן אחיזה של 30 דקות זמן ייבוש של 30 דקות.
  2. הניחו כרית ספסל סטרילית לסביבת העבודה הכירורגית והכינו משככי כאבים.
    1. לדלל קרפרופן במי מלח סטריליים ל-1 מ"ג/מ"ל, ולדלל את בופיוואקאין במי מלח סטריליים לתמיסת 0.5% (w/v).
    2. הוסף 3.5 מ"ל של meloxicam לבקבוק מים בכלוב 400 מ"ל.
  3. חממו מראש את כריות החום לכלובי ההתאוששות, והציבו מנורות חום כדי להאיר באור עקיף את בעלי החיים המתאוששים.
  4. יש להקפיד על לבישת כל ציוד הגנה אישי מתאים, כולל רשת לשיער, מסכת פנים, חלוק וכפפות.
  5. תרגול טכניקה סטרילית טובה, כולל ריסוס קבוע של הכפפות באתנול ולאפשר להן להתאדות לפני הטיפול בחיה או בכלי ניתוח כדי למנוע זיהום אתנול.

2. ביצוע כריתת שחלות

  1. באמצעות מכונת הרדמה בגז עם איזופלורן, מלאו מראש את קופסת האינדוקציה למשך 3-5 דקות באיזופלורן 5% כאשר קצב הזרימה מוגדר על 4 ליטר/דקה.
  2. הניחו את העכבר בתוך קופסת האינדוקציה, וברגע שאיבדו את הכרתם, העבירו אותו לקונוס האף והפחיתו את קצב הזרימה ל-0.4 ליטר/דקה, כאשר מכשיר האידוי איזופלורן מוגדר ל~2.5%.
    הערה: אחוז האיזופלורן המשמש להמשך ההליך משתנה בהתאם לזן העכבר, גיל וחשיפה לטיפולים (למשל, כימותרפיה) ויש להתאים אותו על בסיס הערכה מדוקדקת של דפוסי הנשימה של כל בעל חיים. דפוסי הנשימה צריכים להישאר כמו נשימות בטן סדירות. נשימות מהירות בבית החזה עשויות להצביע על כך שמישור כירורגי עמוק לא הושג או נשמר; במקרה זה, התאם את אחוז האידוי isoflurane לפי הצורך.
  3. יש למרוח חומר סיכה לעיניים בנדיבות על ידי סחיטת הצינור ולטפטוף עדין של העין.
  4. יש לגלח שטח קטן (2 ס"מ x 2 ס"מ) בגובה עמוד השדרה ומתחתיו.
  5. יש לתת 5 מ"ג/ק"ג קרפרופן מתמיסה מדוללת של 1 מ"ג/מ"ל תת עורית בשפשוף הצוואר.
  6. בדוק את עומק ההרדמה עם רפלקס צביטת הבוהן על ידי צביטת הבוהן האחורית של העכבר. אם אין תגובת צביטת בוהן, החיה נמצאת במישור הכירורגי העמוק, וההליך יכול להמשיך.
  7. יש למרוח בטאדין על אזור הניתוח, ולכסות בוילון כירורגי (גזה עם חלון בגודל 2X2 ס"מ חתוך).
  8. בעזרת מלקחיים עם שיני חולדה, משכו את העור בבטן הגב כלפי מעלה, ובצעו חתך אורכי ~5 מ"מ.
    הערה: חתך עור בגובה זה בגבו של בעל החיים הוא הטוב ביותר למיקום קליפס כירורגי כדי להפחית את הסיכוי שבעל החיים יסיר את האטבים ויזדקק לתיקון קליפס.
  9. בעזרת מלקחיים קהים, המשיכו לנתח את העור הרחק משכבת השריר שמתחתיה, לנוע מטה לצד אחד לכיוון הכליה.
  10. זהה את כרית השומן בכליות, בשחלות ובשחלות באופן חזותי דרך דופן השריר.
    הערה: הכליה תופיע בצבע אדום כהה, כרית השומן תיראה לבנה בהירה, ואם היא נראית לעין, השחלה תיראה כמו נקודה ורודה קטנה בתוך כרית השומן.
  11. בעזרת מלקחיים, לתפוס ולהרים את שכבת השריר. בצע חתך ~ 0.5-1 ס"מ עם מספריים כירורגיים חדים. ממשיכים להחזיק את דופן השריר עם מלקחיים, ומחליפים מספריים למלקחיים קהים כדי למשוך את כרית שומן השחלה דרך החתך.
  12. בעזרת מחזיק מחט מעוקל, מהדקים מתחת לשחלה ואובידוקט בקצה הדיסטלי של קרן הרחם.
    הערה: לחלופין, ניתן להסיר את השחלה לבדה, ולהשאיר את האובידוקט שלם. עם זאת, נדרש מיקרוסקופ מנתח כדי להמחיש במדויק את ההבחנה בין השחלה לאובידוקט.
  13. הסר את השחלה עם מספריים או אזמל. המשך להדק במשך 30 שניות כדי למנוע דימום מוגזם.
  14. הסר את המהדק, ולטפוח אותו עם גזה סטרילית במידת הצורך.
  15. כדי לסגור את החתך בדופן השריר, השתמש במלקחיים כדי להרים את החלק העליון של החתך כך שהחתך יימשך באופן טבעי.
  16. השתמש בתפרי משי (מידה 3-0) כדי לסגור את חתך דופן השריר עם קשר מנתח.
  17. החל שתיים עד שלוש טיפות של bupivacaine מקומי באמצעות מזרק 1 מ"ל ללא מחט מחוברת, ולחזור על שלבים 2.9-2.17 בצד השני.
  18. כדי לסגור את החתך בעור, השתמש בגזה כדי לטפוח את האזור היבש של עודף bupivacaine, ולחץ את שני הצדדים של העור יחד.
  19. יש למרוח קליפס כירורגי אחד או שניים בקוטר 7 מ"מ, המאפשרים מקום לנפיחות כחלק מתהליך הריפוי.
  20. העבר את העכבר לכלוב התאוששות, ועקוב מקרוב במשך 15 דקות.
    הערה: בעלי החיים צריכים להתעורר במהירות; הקפד לפקח על הנשימה מקרוב עבור דפוסי נשימה נורמליים בבית החזה.

3. הכנת הורמונים: הזרקה תת עורית

  1. הפוך 1 מ"ג / מ"ל תמיסת מלאי של אסטרדיול.
    1. שקול 0.001 גרם (1 מ"ג) של אבקת אסטרדיול לתוך צינור סטרילי 1.5 מ"ל.
    2. הוסף 1 מ"ל של 100% אתנול לצינור, ומערבל במשך כמה שניות.
      הערה: האתנול יישאר צלול עם כתמים גלויים של אבקת אסטרדיול.
    3. עטפו את הצינור בסרט כדי למנוע אידוי אתנול.
    4. עטפו את הצינור ברדיד אלומיניום, והניחו אותו על נדנדה למשך הלילה כדי להמיס לחלוטין את אבקת האסטרדיול.
    5. יש לדלל מלאי זה של 1 מ"ג/מ"ל בשמן שומשום לריכוז הסופי הרצוי.
      הערה: מינונים של 100 ng במשך 3 ימים נדרשים עבור priming לפני דצידואליזציה מלאכותית, ומינונים נמוכים נוספים של 25 ng נדרשים כאשר פרוגסטרון ניתן. זאת כדי להילחם בלולאת המשוב השולטת בביטוי קולטני פרוגסטרון. להחזרת עוברים נדרשות שתי מנות של 100 ננוגרם ביום הראשון וביום 3 לפני החזרת העוברים ביום הרביעי. בזמן החזרת העוברים, נדרש גם מינון נמוך של 25 ננוגרם.
    6. צייר את הכמות הנדרשת של אסטרדיול בשמן לתוך מזרק 1 מ"ל, ולאחר מכן לצרף קצה מחט 26 גרם.
    7. יש להזריק את המינון המתאים באופן תת-עורי (בין אם בשפשוף או באגף; 100 ng/100 μL או 25 ng/100 μL להכנה לפני החזרת עוברים או דצידואליזציה מלאכותית או בזמן החזרת העוברים) בתדירות הנדרשת.
      הערה: שמן צמיג מאוד, לכן הקפד להזריק לאט ועצור למספר שניות לפני הסרת המחט. פעולה זו תמזער את כמות השמן הדולפת מאתר ההזרקה.
  2. הכינו תמיסת מלאי של 200 מ"ג/מ"ל של פרוגסטרון.
    1. שוקלים 0.4 גרם (400 מ"ג) של אבקת פרוגסטרון לתוך צינור סטרילי של 5 מ"ל.
    2. מוסיפים 2 מ"ל של אתנול 100% לצינור, ומערבלים למשך מספר שניות.
      הערה: האתנול יהפוך בצבע לבן.
    3. חזור על שלבים 3.1.3-3.1.4.
    4. מדללים את מלאי 200 מ"ג/מ"ל בשמן שומשום לריכוז הסופי הרצוי.
      הערה: מינונים של 2 מ"ג ביום נדרשים לתמיכה בהחזרת עוברים.
    5. יש להזריק את המינון המתאים (למשל, 2 מ"ג/100 מיקרוליטר ביום לתמיכה בהריון) באופן תת עורי כמו בשלבים 3.1.6-3.1.7.

4. הכנת הורמונים: כדורים בשחרור איטי

  1. הניחו נייר כסף על פני השטח של זרימה למינרית או מכסה מנוע בטיחות ביולוגית Class II.
  2. הניחו את כל הציוד (כפפות, צלחות פטרי, מזרקים 1 מ"ל, מלקחיים עדינים) במכסה המנוע, והפעילו את ה- UV למשך 20 דקות.
    הערה: אין להפעיל את ה-UV עם חומר האיטום בתוך מכסה המנוע כפי שהוא שוקע.
  3. שטפו את הצינור הסילסטי באתנול 100%, ואפשרו לו להתייבש באוויר במכסה המנוע. לאחר הייבוש, סמן ~ 1 ס"מ אורכים לאורך הצינור, וחתך עם אזמל.
  4. הסר את הבוכנה ממזרק, וסחט פנימה ~ 200 μL של חומר איטום. מחליפים את הבוכנה, ומשחררים כמות קטנה של חומר איטום מהמזרק.
  5. מרחו כמות קטנה של חומר איטום על קצה אחד של הצינור, והחליקו אותו עם אצבע בכפפה.
  6. הניחו לייבוש למשך הלילה או למשך 20-30 דקות באור UV בתוך מכסה המנוע.
  7. יוצקים כמות מתאימה של פרוגסטרון לצלחת פטרי מעוקרת. בעזרת מלקחיים, יש להכניס כדוריות לתוך אבקת הפרוגסטרון כדי למלא את הכדורית.
    1. הקש על הקצה האטום של הגלולה על משטח מכסה המנוע כדי לעבות את הפרוגסטרון כלפי מטה. לחלופין, השתמש בקצה של מלקחיים מעוקרים כדי לדחוף את הפרוגסטרון למטה. אפשר מספיק מקום לאיטום נוסף.
  8. אטמו את הקצה הפתוח בחומר איטום, כמתואר בשלבים 3.4-3.5.
  9. עטפו את צלחת הפטרי המכילה את כדורי הפרוגסטרון בנייר כסף כדי להגן עליה מפני אור.
  10. הפעל את הכדוריות למשך 72 שעות לפחות לפני החדרה תת עורית על ידי דגירה ב- FCS 1% עם פחמים (cs-FCS: PBS) ב- 37 ° C.
    הערה: ניתן להכין כדוריות בתפזורת עם קצה אטום אחד מראש. עם זאת, פרוגסטרון טרי צריך לשמש כדי למלא אותם בכל פעם. יש לוודא שהכדורים המוכנים מראש עוברים עיקור UV לפני המילוי בפרוגסטרון. הכדוריות יפרישו ~ 500 מיקרוגרם ליום למשך 6-10 ימים, המהווה תמיכה מספקת להליכי דצידואליזציה מלאכותית והחזרת עוברים, אם כי ייתכן שתידרש הזרקת אסטרוגן נוספת במינון נמוך כדי לשמור על פעילות קולטן פרוגסטרון מעבר ל 4-5 ימים. מעבר ל-10 ימים, ייתכן שיהיה צורך בגלולת פרוגסטרון חלופית.

5. הכנת הורמונים: משאבות מיני אוסמוטיות

  1. הכינו פרוגסטרון בריכוז הרצוי בתמיסה מימית, ובחרו את דגם המשאבה המיני אוסמוטית המתאים (ראו טבלת חומרים).
    הערה: עבור סעיף 7 (הליך ניסיוני: החזרת עוברים), נדרשת לידה של 2 מ"ג ליום למשך 12 יום. לכן, יש להמיס 28 מ"ג פרוגסטרון ב~100 מיקרוליטר מים סטריליים לכל בעל חיים (עקוב אחר הוראות היצרן עבור הנפח הספציפי). ייתכן שיידרשו דילולים סדרתיים. עבור סעיף 8 (הליך ניסיוני: דצידואליזציה מלאכותית), נדרשת אספקה של 500 מיקרוגרם ליום למשך 3 ימים. לכן, יש להמיס 1,500 מיקרוגרם פרוגסטרון ב~100 מיקרוליטר מים סטריליים לכל חיה. הכינו תמיסה נוספת כדי לקחת בחשבון את הנפח שאבד במהלך הליך המילוי.
  2. הגדר את הציוד (כפפות, מגבונים בעלי סיבים נמוכים, צלחות פטרי, מלח סטרילי, מזרקים 1 מ"ל, סירות שקילה קטנות, נייר כסף ומאזניים מדויקים עד 0.01 גרם) בתוך מכסה מנוע בטיחות ביולוגית דרגה II, ולאחר מכן הפעל את ה- UV למשך 20 דקות.
  3. צייר את הפתרון ההורמונלי לתוך מזרק 1 מ"ל, ולאחר מכן לצרף צינור מילוי סטרילי, בזהירות להבטיח כי אין בועות אוויר.
  4. לשקול את המשאבה ואת ממתן הזרימה שלה בתוך סירת שקילה סטרילית.
  5. הכנס את צינור המילוי דרך הפתח בחלק העליון של המשאבה עד שהוא לא יכול להמשיך הלאה.
  6. מחזיק את המשאבה זקופה, לדחוף לאט את הבוכנה של המזרק כדי למלא את הצינור.
    הערה: יש להימנע מסתימה מהירה מכיוון שהיא עלולה להכניס בועות אוויר למשאבה.
  7. כאשר התמיסה עולה על גדותיה מראש המשאבה, הסירו בעדינות את צינור המילוי, ונגבו את עודפי התמיסה במגבון סטרילי בעל סיבים נמוכים.
  8. הכנס את מנחה הזרימה דרך הפתח בחלק העליון של המשאבה עד שהוא לא יכול להמשיך הלאה. ברגע שנכנסים באופן מלא, לחץ בחוזקה על המשאבה ועל מנחה הזרימה יחד.
  9. שקלו את המשאבה המלאה כשמנחה הזרימה במקומו.
    הערה: ההבדל במשקל המתקבל משלב 5.3 ושלב 5.8 ייתן את המשקל נטו של התמיסה שנטענה (כלומר, עלייה של 0.1 גרם = 100 מיקרוליטר של תמיסה נוספת).
  10. מניחים את המשאבה הממולאת בכלי פטרי סטרילי מלא במי מלח סטריליים.
  11. לאחר מילוי כל המשאבות, עטפו את צלחת הפטרי בנייר כסף, והניחו אותה בתוך אינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך 4-6 שעות לפחות (או עד שהיא מוכנה לשימוש).

6. הליך כירורגי: החדרת כדורי הורמון תת עורי ומשאבות מיני

  1. הכינו את השטח לפי סעיף 1 (הכנה כירורגית).
  2. מרדימים את בעלי החיים לפי שלבים 2.1-2.3.
  3. יש לגלח אזור קטן באזור הצוואר (~ 1 ס"מ x 1 ס"מ).
  4. יש לתת 5 מ"ג/ק"ג קרפרופן מתמיסה מדוללת של 1 מ"ג/מ"ל תת עורית באגף הרגל.
  5. בדוק את רפלקס צביטת הבוהן. אם אין רפלקס, החיה נמצאת במישור הכירורגי העמוק, וההליך יכול להתחיל.
  6. החל betadine על אזור הניתוח, ולכסות אותו עם וילון כירורגי (גזה עם חלון 2 ס"מ x 2 ס"מ לחתוך).
  7. בעזרת מלקחיים עם שיני חולדה, משכו את העור בשפשוף הצוואר (באמצע הדרך בין הקשקוש האמיתי לתחושת הגב) כלפי מעלה, ובצעו חתך אורכי ~5 מ"מ.
  8. באמצעות מלקחיים קהים, יש לנתח את העור הרחק משכבת השריר שמתחתיה בכיוון מטה.
    הערה: להחדרת משאבת מיני אוסמוטית, יש ליצור כיס לאורך צד אחד של בעל החיים, כך שהמשאבה לא תגביל את תנועת בעל החיים או תלחץ על מקום החתך.
  9. לאחר שנוצר מספיק מקום לכדורית ההורמון או למשאבת המיני, השתמש במלקחיים סטריליים כדי להרים את הגלולה או משאבת המיני, והכנס אותה לכיס התת עורי שנעשה בדיסקציה קהה.
  10. כדי לסגור את החתך בעור, יש לוודא שהגלולה או המשאבה הזעירה רחוקה מספיק לתוך הכיס כדי שהקליפסים הכירורגיים לא יפגעו בו.
  11. יש למרוח bupivacaine באופן מקומי לפי שלב 2.17.
  12. סגור את הפצע עם קליפס כירורגי אחד. העבר את העכבר לכלוב התאוששות, ועקוב מקרוב במשך 15 דקות. מכיוון שמדובר בהליך קצר, בעלי החיים צריכים להיות אמבולטוריים תוך דקות.

7. הליך ניסיוני: החזרת עוברים

  1. עבור בעלי חיים שעברו כריתת שחלות, הורמון ראשוני 3 ימים לפני החזרת העובר על ידי זריקה תת עורית של 100 ng/100 μL אסטרדיול (שלב 3.1).
  2. יום אחד לפני החזרת העוברים, הורמון ראש את החיות עם זריקה תת עורית של 2 מ"ג / 100 μL medroxyprogesterone אצטט (שלב 3.2).
  3. הכינו את השטח לפי סעיף 1 (הכנה כירורגית).
  4. מרדימים את בעלי החיים לפי שלבים 2.1-2.3.
  5. התחל את ההליך לפי שלבים 2.4-2.10.
  6. תחת מיקרוסקופ מנתח, ליצור נקודת הזרקה תוך רחמית עם קצה מחט 26 G.
  7. פיפטה חמישה בלסטוציסטים לתוך טיפת מדיה M2, ולאחר מכן להעביר אותם לתוך קרן הרחם.
  8. כדי לסגור את החתך בדופן השריר, הרימו את החלק העליון של החתך באמצעות מלקחיים כך שהחתך יימשך באופן טבעי.
  9. באמצעות תפרי משי, לסגור את אתר דופן השריר עם קשר של מנתח. יש למרוח טיפות של bupivacaine באופן מקומי.
  10. חזור על שלבים 7.5-7.8 בצד השני.
  11. כדי לסגור את החתך בעור, השתמש בגזה כדי לטפוח את האזור היבש של עודף bupivacaine, ולחץ את שני הצדדים של העור יחד.
  12. יש למרוח קליפס כירורגי אחד או שניים, המאפשרים מקום לנפיחות כחלק מתהליך הריפוי.
    הערה: אם החיות עוברות כריתת שחלות, נדרשים הורמונים אקסוגניים בזמן החזרת העוברים. או להזריק פרוגסטרון תת עורית (2 מ"ג) או להכניס גלולת פרוגסטרון תת עורית או משאבת מיני אוסמוטית. כדי להילחם בפרוגסטרון עודף, נדרשת זריקה תת עורית של אסטרוגן במינון נמוך (25 ng/100 μL) בזמן החזרת העוברים.
  13. שאו בזהירות את העכבר לכלוב התאוששות, ועקבו מקרוב במשך 15 דקות.
    הערה: בעלי החיים צריכים להתעורר במהירות; הקפד לפקח על הנשימה מקרוב עבור דפוסי נשימה נורמליים בבית החזה.

8. הליך ניסיוני: דצידואליזציה מלאכותית

  1. הורמון ראשוני לבעלי חיים עם 100 ng/100 μL אסטרדיול ביום 1, יום 2, ויום 3, לפי סעיף 3 (הכנת הורמונים: הזרקה תת עורית) 8 ימים לפני דצידואליזציה מלאכותית.
  2. הורמון ראשוני לבעלי חיים עם 5 ng/100 μL אסטרדיול ביום 7, יום 8 ויום 9, לפי סעיף 3 (הכנת הורמונים: הזרקה תת עורית) יומיים לפני דצידוקאליזציה מלאכותית.
    הערה: ההזרקה הסופית חייבת להתרחש לפחות 3 שעות (ומקסימום 4 שעות) לפני הליך הדצידואליזציה המלאכותית.
  3. בעלי חיים בעלי הורמון ראשוני עם גלולת פרוגסטרון תת-עורית או משאבה אוסמוטית זעירה (500 מיקרוגרם ליום), לפי סעיף 4, סעיף 5 וסעיף 8, יומיים לפני דצידוקאליזציה מלאכותית.
  4. הכינו את השטח לפי סעיף 1 (הכנה כירורגית).
  5. מרדימים את בעלי החיים לפי שלבים 2.1-2.2.
  6. בדוק את עומק ההרדמה עם רפלקס צביטת הבוהן. אם אין תגובת צביטת בוהן, החיה נמצאת במישור הכירורגי העמוק, וההליך יכול להמשיך.
  7. הניחו את העכבר במצב נוטה, הרימו את הזנב והכניסו לאט ספקולום בקוטר 6 מ"מ לנרתיק.
  8. תוך שמירה על אפו של בעל החיים בחרוט האף המרדים, מקם את פלג גופו התחתון של בעל החיים בין האצבע הראשונה והשנייה של היד הלא דומיננטית. השתמש באגודל כדי לדחוף בעדינות את הזנב כלפי מעלה כדי לשמור על פתח הנרתיק גלוי.
  9. מעבירים 20 מיקרוליטר שמן שומשום לקרן רחם אחת באמצעות קצה החזרת עוברים לא ניתוחי (מחובר לפיפטה של 20 מיקרוליטר).
    1. שמירה על גובה פיפטה עם פתח הנרתיק, להחדיר את הקצה לתוך הנרתיק דרך צוואר הרחם לתוך קרן הרחם. ברגע שהקצה נמצא בקרן הרחם, לחץ בעדינות את הקצה על משטח רירית הרחם (אם משתמשים בטכניקת הטיפול לעיל, תנועה זו תורגש כנגד האצבע השנייה), ולאט לאט מוציאים את השמן.
      הערה: יש לשמור על בוכנה פיפטה מדוכאת, להמתין 10 שניות כדי לוודא שכל השמן התפזר, ולהסיר לאט את קצה ההעברה תוך שמירה על הבוכנה מדוכאת.
  10. הסר את ספקולום מן הנרתיק.
  11. בזהירות לשאת את העכבר לכלוב ההתאוששות, ולפקח מקרוב במשך 15 דקות.
    הערה: בעלי החיים צריכים להתעורר במהירות. עקוב מקרוב אחר נשימתם לדפוסי נשימה תקינים של בית החזה.
  12. הגבילו את הטיפול בבעלי החיים, והחזיקו אותם בסביבה שקטה למשך 96 שעות לאחר ההליך.
    הערה: רעשים חזקים או שינויים פתאומיים במחזור האור והחושך שלהם ישפיעו על הצלחת ההליך. בזמן דיסקציה של רקמות, ניתן למדוד את מידת ההצלחה של הדצידואליזציה כיחס בין משקל הרחם למשקל הגוף. להליך הדצידואליזציה המלאכותית יש 80% הצלחה. לכן, אין לכלול בעלי חיים שאינם נפצעים, ולקחת זאת בחשבון בעת בחירת גודל הדגימה לניסויים.

9. הליך כירורגי: התאוששות לאחר ניתוח, מעקב ותיקוני קליפס

  1. אפשרו לבעלי החיים להתאושש מכריות חום חצי על חצי לילה לפני החזרתם לכלוב הביתי שלהם.
  2. לפקח על בעלי החיים מדי יום במשך 5 ימים לאחר הניתוח, תוך מתן תשומת לב רבה לאתר הפצע עבור סימנים של זיהום.
  3. בצע תיקון קליפס במידת הצורך.
    1. הכינו את השטח לפי סעיף 1 (הכנה כירורגית).
    2. מרדימים את בעלי החיים לפי שלבים 2.1-2.3.
    3. הסר את הקטע הקיים באמצעות מסיר קליפים אם הקטע עדיין קיים.
    4. יש למרוח קליפס כירורגי חדש, לפי שלבים 2.19-2.21.
  4. הסר את קטעי הניתוח 7 ימים לאחר הניתוח לפי שלבים 9.3.1-9.3.3 או כאשר בעל החיים נמצא הבא תחת הרדמה (כגון להחזרת עוברים, הליך דצידואליזציה מלאכותית, או זריקה תת עורית לאחר ניתוח).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

מודל מאופיין היטב של דצידואליזציה מלאכותית מתואר במאמר פרוטוקול זה (איור 1A). כאן, נקבות עכברות צעירות (בנות 8 שבועות) עברו כריתת שחלות כירורגית כמתואר בסעיף 1 ובסעיף 2. לאחר מכן העכברות נחו במשך שבועיים כדי להבטיח שהורמוני השחלות האנדוגניים יתפוגגו לפני שנתמכו בהורמונים אקסוגניים כמתואר בסעיפים 3-7 וסעיף 9. דצידואליזציה מלאכותית נגרמה על ידי הזרקה תוך נרתיקית של שמן שומשום, ולאחר מכן החיות נחו עד לאיסוף רקמות, כמתואר בסעיף 9. במחקר זה, דצידואליזציה מלאכותית בוצעה בעכבר...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

מאמר זה מספק הוראות שלב אחר שלב כיצד לבצע OVX ולספק הורמונים אקסוגניים למחקרים המתמקדים בהבנת תרומת הרחם להריון ולפוריות. שני פרוטוקולים מפורטים מסופקים על שני יישומים ניסיוניים של שיטות אלה, כולל ביצוע החזרת עוברים וגרימת דצידואליזציה באופן מלאכותי.

בעוד שביצוע OVX יכול להיות מאתגר בהתחלה - במיוחד עבור חוקרים חדשים למודלים של מכרסמים - זהו הליך פשוט יחסית לאחר שאומן ותורגל כראוי. השלבים העיקריים בהליכים כוללים מעקב צמוד אחר בעלי החיים בזמן שהם תחת הרדמה ולוודא שלא נותרה רקמת שחלה מאחור. בדגמי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים כי אין אינטרסים כלכליים או אחרים מתחרים.

תודות

עבודה זו התאפשרה באמצעות תמיכת התשתיות התפעוליות של ממשלת מדינת ויקטוריה והמועצה הלאומית לבריאות ומחקר רפואי של ממשלת אוסטרליה (NHMRC) IRIISS. עבודה זו נתמכה על ידי הפקולטה לרפואה, סיעוד ומדעי הבריאות באוניברסיטת מונאש מענק גישה ל- A.L.W. (Winship-PAG18-0343) כדי לגשת לפלטפורמת שירותי הרבייה של מונאש. א.ל.ו. נתמכת על ידי DECRA מימון DE21010037 ממועצת המחקר האוסטרלית (ARC). J.N.H. ו- L.R.A. נתמכים על ידי מלגת תוכנית הכשרת המחקר של ממשלת אוסטרליה. L.R.A. נתמכת על ידי מלגת הצטיינות בוגרי מונש. K.J.H. נתמך על ידי ARC Future Fellowship FT190100265.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
ALZET 1002 מיני משאבות אוסמוטיותBioScientific1002מספק 0.25 ומיקרו; ליטר לשעה למשך 14 ימים. השתמש בסעיף 7 (הליך ניסיוני - העברת עוברים).
ALZET 1003D מיני משאבות אוסמוטיות BioScientific1003Dמספק 1 ומיקרו; ליטר לשעה למשך 14 ימים. השתמש בסעיף 8 (נוהל ניסוי - דצידואליזציה מלאכותית).
קליפס ALZET רפלקס 7 מ"מBioScientific0009971ניתן להשתמש בקליפס רפלקס או בקליפס מישל לסגירת פצעים, בהתאם להעדפה
מוליך קליפ רפלקס ALZETBioScientific0009974ניתן להשתמש בקליפס רפלקס או בקליפס מישל לסגירת פצעים, בהתאם להעדפה
מסיר קליפ רפלקס ALZETBioScientific0009976ניתן להשתמש בקליפס רפלקס או בקליפס מישל לסגירת פצעים, בהתאם להעדפה
הזרקת BupivicainePfizerNAStock 0.5%. יש להשתמש ב-0.05% במי מלח
אסטרדיולסיגמאE8875
מלוקסיקםאיליוםNAמרכיב פעיל 0.5 מ"ג/מ"ל. השתמש ב-3.5 מ"ל לכל בקבוק מים בכלוב של 400 מ"ל, או כפי שהווטרינר של המוסד שלך רושם.
מישל קליפסדניאלסNS-000242
איטום רב תכליתיDow Corning732
מכשיר העברת עוברים לא כירורגי (NSET)ParaTechs60010מכיל ספקולום 6 מ"מ. לשימוש חד פעמי בלבד.
פרוגסטרוןסיגמאP0130מסיס באתנול. השתמש עבור  סעיף 3 (הכנת הורמונים - הזרקה תת עורית) ו  סעיף 4 (הכנת הורמונים - כדורים בשחרור איטי)
פרוגסטרוןסיגמאP7556מסיס במים. לשימוש בסעיף 5 (הכנת הורמונים - מיני משאבות אוסמוטיות)משחת
עיניים מרעננתאלרגןNA42.5% משקל/נפח פרפין נוזלי, 57.3% משקל/נפח פרפין לבן רך,
רימדיל קרפרופןZoetisNAמלאי 50 מ"ג/מ"ל. השתמש ב-1 מ"ג/מ"ל (במינון של 5 מ"ג/ק"ג)
צינורות גומיDow Corning508-008נשטף ב-100% אתנול וחתוך לחתיכות של 1 ס"מ. קוטר פנימי 1.57 מ"מ &   0.23 מ"מ; קוטר חיצוני 3.18 מ"מ &Plusmn; 0.23 מ"מ; קיר 0.81 מ"מ.
שמן שומשוםSigmaS3547
תפרי משי Sofsilk גודל 3-0CovidienGS-832
,

מקורות

  1. Szamatowicz, M. Assisted reproductive technology in reproductive medicine - Possibilities and limitations. Ginekologia Polska. 87 (12), 820-823 (2016).
  2. Evans, J., et al. Fertile ground: Human endometrial programming and lessons in health and disease. Nature Reviews. Endocrinology. 12 (11), 654-667 (2016).
  3. Norwitz, E. R., Schust, D. J., Fisher, S. J. Implantation and the survival of early pregnancy. The New England Journal of Medicine. 345 (19), 1400-1408 (2001).
  4. Zinaman, M. J., Clegg, E. D., Brown, C. C., O'Connor, J., Selevan, S. G. Estimates of human fertility and pregnancy loss. Fertility & Sterility. 65 (3), 503-509 (1996).
  5. Kupka, M. S., et al. Assisted reproductive technology in Europe, 2010: Results generated from European registers by ESHRE†. Human Reproduction. 29 (10), 2099-2113 (2014).
  6. Gleicher, N., Kushnir, V. A., Barad, D. H. Worldwide decline of IVF birth rates and its probable causes. Human Reproduction Open. 2019 (3), (2019).
  7. Diaz-Gimeno, P., et al. A genomic diagnostic tool for human endometrial receptivity based on the transcriptomic signature. Fertility & Sterility. 95 (1), 50-60 (2011).
  8. Amin, J., et al. Personalized embryo transfer outcomes in recurrent implantation failure patients following endometrial receptivity array with pre-implantation genetic testing. Cureus. 14 (6), e26248(2022).
  9. Patel, J. A., Patel, A. J., Banker, J. M., Shah, S. I., Banker, M. R. Personalized embryo transfer helps in improving in vitro fertilization/ICSI outcomes in patients with recurrent implantation failure. Journal of Human Reproductive Sciences. 12 (1), 59-66 (2019).
  10. Khan, K. N., et al. Biological differences between functionalis and basalis endometria in women with and without adenomyosis. European Journal of Obstetrics, Gynecology, and Reproductive Biology. 203, 49-55 (2016).
  11. Richards, J. S., Ren, Y. A., Candelaria, N., Adams, J. E., Rajkovic, A. Ovarian follicular theca cell recruitment, differentiation, and impact on fertility: 2017 update. Endocrine Reviews. 39 (1), 1-20 (2018).
  12. Corciulo, C., et al. Pulsed administration for physiological estrogen replacement in mice. F1000Research. 10, 809(2021).
  13. Greaves, E., et al. A novel mouse model of endometriosis mimics human phenotype and reveals insights into the inflammatory contribution of shed endometrium. The American Journal of Pathology. 184 (7), 1930-1939 (2014).
  14. Griffiths, M. J., Alesi, L. R., Winship, A. L., Hutt, K. J. Development of an embryo transfer model to study uterine contributions to pregnancy in vivo in mice. Reproduction & Fertility. 3 (1), 10-18 (2022).
  15. Cousins, F. L., et al. Evidence from a mouse model that epithelial cell migration and mesenchymal-epithelial transition contribute to rapid restoration of uterine tissue integrity during menstruation. PLoS One. 9 (1), e86378(2014).
  16. Cousins, F. L., et al. Androgens regulate scarless repair of the endometrial "wound" in a mouse model of menstruation. FASEB Journal. 30 (8), 2802-2811 (2016).
  17. Fullerton, P. T., Monsivais, D., Kommagani, R., Matzuk, M. M. Follistatin is critical for mouse uterine receptivity and decidualization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (24), E4772-E4781 (2017).
  18. Rowland, R. R., Reyes, E., Chukwuocha, R., Tokuda, S. Corticosteroid and immune responses of mice following mini-osmotic pump implantation. Immunopharmacology. 20 (3), 187-190 (1990).
  19. Barton, B. E., et al. Roles of steroid hormones in oviductal function. Reproduction. 159 (3), R125-R137 (2020).
  20. Lee, J. E., et al. Autophagy regulates embryonic survival during delayed implantation. Endocrinology. 152 (5), 2067-2075 (2011).
  21. Hamatani, T., et al. Global gene expression analysis identifies molecular pathways distinguishing blastocyst dormancy and activation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (28), 10326-10331 (2004).
  22. Cui, L., et al. Transcervical embryo transfer in mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 53 (3), 228-231 (2014).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

דצידואליזציה מלאכותיתהעברת עוברהזרקת הורמונים חיצונייםזריקה תת-עוריתכדוריות פרוגסטרוןרגישות רירית הרחםקרן הרחם
שיטות לחקר תרומות הרחם לביסוס הריון במודל עכבר לכריתת שחלות
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.