מאמר שיטה

זיהוי וכימות של פפטיד הקשור לגן קלציטונין (CGRP) בפלזמה אנושית באמצעות בדיקת אימונוסורבנט מקושרת אנזים שונה

4K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/64775

⸱

16 ביוני 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Otolaryngology-Head & Neck Surgery, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Virginia Commonwealth University School of Medicine, 3Department of Oncology, The Sidney Kimmel Comprehensive Cancer Center, Johns Hopkins University School of Medicine, 4Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery, University of Michigan Medical School, 5Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery, The Ohio State University College of Medicine, 6ICTR Clinical Research Core Laboratory, Johns Hopkins University School of Medicine

במאמר זה

סיכום

נתונים שפורסמו בנוגע לריכוזי פפטיד הקשור לגן קלציטונין (CGRP) בפלזמה אנושית אינם עקביים. חוסר עקביות זה עשוי לנבוע מהיעדר מתודולוגיה מתוקננת ומתוקפת לכימות נוירופפטיד זה. במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול מאומת של בדיקת אימונוסורבנט מקושרת אנזימים (ELISA) לטיהור וכימות CGRP בפלזמה אנושית.

תקציר

פפטיד הקשור לגן קלציטונין (CGRP) הוא נוירופפטיד וזואקטיבי הממלא תפקיד משוער בפתופיזיולוגיה של מיגרנות, ועשוי להיות מועמד למצב של סמן ביולוגי. CGRP משתחרר מסיבים עצביים עם הפעלתו וגורם לדלקת נוירוגנית סטרילית ולהרחבת כלי דם עורקיים בכלי הדם המקבלים עצבוב טריגמינלי תוסס. נוכחותו של CGRP בכלי הדם ההיקפיים דרבנה חקירות לזהות ולכמת נוירופפטיד זה בפלזמה אנושית באמצעות בדיקות פרוטאומיות, כגון בדיקת אימונוסורבנט מקושרת אנזים (ELISA). עם זאת, זמן מחצית החיים של 6.9 דקות והשונות בפרטים הטכניים של פרוטוקולי הבדיקה, שלעתים קרובות אינם מתוארים במלואם, הניבו נתוני CGRP ELISA לא עקביים בספרות. כאן מוצג פרוטוקול ELISA שונה לטיהור וכימות CGRP בפלזמה אנושית. השלבים הפרוצדורליים כוללים איסוף והכנת דגימות, חילוץ באמצעות סורבנט קוטבי כאמצעי לטיהור, צעדים נוספים לחסימת קשירה לא ספציפית, וכימות באמצעות ELISA. יתר על כן, הפרוטוקול אומת עם ספייק והתאוששות ולינאריות של ניסויי דילול. פרוטוקול מאומת זה יכול לשמש באופן תיאורטי לכימות ריכוזי CGRP בפלזמה של אנשים לא רק עם מיגרנה, אלא גם עם מחלות אחרות שבהן CGRP עשוי לשחק תפקיד.

מבוא

פפטיד הקשור לגן קלציטונין (CGRP) הוא נוירופפטיד של 37 חומצות אמינו שנמצא בסיבים עצביים עם לוקליזציה פריווסקולרית, כמו גם ברקמות שאינן עצביות. שתי הצורות של CGRP, α ו-β-CGRP, חולקות יותר מ-90% הומולוגיה וחולקות תפקודים פיזיולוגיים; עם זאת, αCGRP נמצא במערכת העצבים המרכזית וההיקפית, בעוד βCGRP נמצא במערכת העצבים האנטרית 1,2. עם הפעלת nociceptor ואקסוציטוזה תלוית סידן, CGRP משתחרר מנוירונים, וגורם לדלקת נוירוגנית סטרילית המערבת הרחבת כלי דם עורקיים ואקסטרווזיה של חלבון פלזמה 3,4,5,6,7. מכאן, CGRP מופיע בכלי הדם שלאחר הנימים ועשוי להיות סמן ביולוגי למחלות הגורמות להפעלה נוסיספטיבית afferent, כגון מיגרנה 8,9,10,11. יש לציין כי CGRP היה מעורב גם ב- COVID-19 באמצעות תפקידו באנגיוגנזה ובאפנון חיסוני, ועשוי לחזות אבולוציה שלילית של מחלות12,13. לפיכך, פרוטוקול לכימות מדויק של CGRP בפלזמה אנושית יכול להיות בעל ערך רחב.

תשומת הלב הרבה ביותר הוקדשה אולי לתפקיד של CGRP במיגרנה. בהתבסס על מחקרים פרה-קליניים וקליניים, CGRP הוצג כסמן ביולוגי אפשרי למיגרנה וכיעד לטיפול 3,4,5,6,7,8,9,10. מחקרים מסוימים מצאו עלייה של CGRP בקבוצות עם מיגרנה אפיזודית ביחס למשתתפי הביקורת10,14,15. נראה כי ההצלחה של מעכבי CGRP בניסויים קליניים לטיפול במיגרנה מרמזת על CGRP מוגבר כגורם סיבתי למיגרנות. עם זאת, לא כל החוקרים אישרו תוצאות אלה16,17,18,19. יתר על כן, תפקידו של CGRP בסימפטומים שאינם כאבי ראש של מיגרנה טרם הובהר; העבודה הנוכחית הונעה על ידי הרצון להבין את התפקיד של CGRP בסימפטומים שיווי המשקל של מיגרנה.

נתוני בדיקת CGRP לא עקביים בספרות יכולים לנבוע מכמה סיבות. ראשית, זמן מחצית החיים של CGRP בכלי הדם ההיקפיים הוא 6.9 דקות 20, בשל הפעילות של פרוטאזות סרין 21, אנזימים מפרקים אינסולין ומטלופרוטאזות אחרות 22, אנדופפטידאזות ניטרליות 23, ואנזים ממיר אנדותלין-1 24. שנית, הפרטים הטכניים המשתנים של הבדיקות החיסוניות המשמשות לכימות CGRP אינם מתוארים במלואם במחקרים כאלה. לבסוף, חוסר הסטנדרטיזציה של מתודולוגיית החיסון מסבך את התמונה עוד יותר.

מאמר זה מתאר פרוטוקול שונה של בדיקת אימונוסורבנט מקושרת אנזים (ELISA) המאפשר טיהור וכימות מדויק של α ו- βCGRP בפלזמה אנושית. הנוגדנים של הערכה אינם צולבים עם עמילין, קלציטונין או חומר P. פרוטוקול זה עבר את ניסויי התיקוף הנדרשים, כגון ספייק ושחזור ולינאריות של דילול, שהנתונים עבורם מוצגים כאן. פרוטוקול CGRP ELISA כזה שעבר אימות לא תואר בעבר במלואו בספרות. פרוטוקול זה יכול לשמש לכימות CGRP בפלזמה אנושית בהקשר של מיגרנה, כמו גם קרדיולוגית2,25, דרמטולוגית 26, מיילדותית 27, ראומטולוגית28,29, שרירים ושלד 30,31, אנדוקרינית 32,33, ומחלות ויראליות12,13 שבהן CGRP היה מעורב.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

פרוטוקול זה פותח באמצעות דגימות פלזמה אנושיות מאנשים מוסכמים באישור מועצת הביקורת המוסדית של ג'ונס הופקינס (NA_00092491).

1. איסוף דוגמאות והכנתן

  1. לאסוף 5 מ"ל של דם שלם מן הווריד antecubital באמצעות שיטות venipuncture סטנדרטיות34 לתוך 6 מ"ל vacutainer ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA) צינור איסוף.
  2. הוסף 0.5 מ"ל של מעכב פרוטאז סרין תחרותי (10,000 KIU/mL) לצינור לאחר האיסוף כדי לחסום את הליזה של פפטיד המטרה. הפוך את הצינור 10 פעמים כדי לאפשר לאפרוטנין להתערבב כראוי עם הדם. לאחר מכן, אחסנו את הצינורות על קרח עד לשלב הבא.
  3. צנטריפוגה את הצינור ב 604 x גרם במשך 4 דקות ב 4 ° C בתוך 60 דקות של איסוף הדם.
  4. מורידים את חלק הפלזמה עם פיפטה ומעבירים ל 2 מ"ל קריובלים סטריליים עגולים למטה.
  5. מיד לאחסן את cryovials ב -80 ° C למשך עד שבועיים.

2. מיצוי דגימות הפלזמה

  1. מניחים מחסנית חילוץ בתוך צינור צנטריפוגה חרוטי 15 מ"ל כאשר הרכסים החיצוניים של המחסנית נתמכים על ידי הרכסים החיצוניים של הצינור.
  2. הפעל את המחסנית על ידי העברת 5 מ"ל תחילה של 100% מתנול ולאחר מכן 10 מ"ל של מים טהורים במיוחד דרך המחסנית.
    1. כאשר נוזל מועבר דרך המחסנית באמצעות זרימה מונעת כוח הכבידה, הוא ייאסף בצינור.
    2. יש לזרוק את עודפי הנוזל כשהם מצטברים כדי להבטיח שהנוזל לא יבלע את המחסנית.
    3. ודא שהמחסנית אינה מתייבשת במהלך הניסוי.
  3. לדלל 250 μL של פלזמה עם 750 μL של 4% חומצה אצטית.
  4. העבר את 1 מ"ל של פלזמה ותמיסת חומצה אצטית באיטיות דרך המחסנית.
    הערה: שלב זה אמור להימשך כ-30 שניות באמצעות זרימה מונעת כבידה עבור כל מיליליטר שעובר.
  5. שטוף את המחסנית עם 10 מ"ל של 4% חומצה אצטית. כפי שנעשה בעבר, לזרוק את הנוזל העודף כפי שהוא מצטבר כדי להבטיח כי הנוזל לא לבלוע את המחסנית.
  6. לאחר שהטיפה האחרונה של חומצה אצטית משתחררת מהמחסנית, הסר את המחסנית מהצינור והנח אותה בצינור צנטריפוגה חרוטי חדש של 15 מ"ל.
  7. הכינו תמיסה ביחס 10:1 של 100% מתנול ו-4% חומצה אצטית על ידי ערבוב של 2.7 מ"ל של 4% חומצה אצטית ו-0.3 מ"ל של 100% מתנול. השתמש באפשרות זו כדי להפתיע את ה- CGRP על-ידי העברת פתרון זה דרך המחסנית 1 מ"ל בכל פעם. הפסקה של 25 דקות בין כל מיליליטר של תמיסה עבר. אל תזרקו את ה-eluent.
  8. הצינור יכיל 3 מ"ל של הנוזל המדולל 25 דקות לאחר שהמיליליטר האחרון של תמיסת המתנול והחומצה האצטית עבר. מניחים כל 1 מ"ל של המוציא לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה 1.7 מ"ל.
    הערה: פעולה זו אמורה להניב שלושה צינורות מיקרו-צנטריפוגות מכל מחסנית.
  9. מקם כל צינור בצנטריפוגה קטנה למשך שנייה אחת כדי להבטיח שכל הנוזל נמצא בתחתית כל צינור.
  10. יבש את כל הדגימות על ידי צנטריפוגת ואקום ב 4 ° C (מוגדר לפעולת רכז, עבור תמיסות מימיות, ב 1,400 סל"ד; כוח G משתנה בהתאם למיקום של צינורות ולכן נע בין 130-250 x גרם).
    הערה: הזמן שייקח לצנטריפוגת הוואקום לייבש את הדגימות יהיה תלוי בסוג צינור המיקרוצנטריפוגה שבו נעשה שימוש.
  11. מיד לפני שתמשיך להליך הבדיקה (שלב 4.1), צור מחדש את הדגימה שיובשה בעבר עם מאגר אנזים חיסוני (EIA) (ראה טבלת חומרים) מופשר לטמפרטורת החדר (RT) או 20 ° C.
    הערה: נפח מאגר EIA המשמש לבנייה מחדש של הדגימה המיובשת צריך להיות שווה לנפח הדגימה המקורי, או 250 μL.

3. הכנת צלחת ELISA - חסימה להגבלת קשירה לא ספציפית

  1. הוסיפו 250 μL של חיץ חוסם מלח חוצץ טריס (TBS)/ג'לטין דגים לכל באר בצלחת.
  2. מניחים יריעת כיסוי מעל הצלחת ודגרים במשך שעתיים ב-RT.
  3. הסר את דף השער ורוקן את הצלחת על ידי היפוך או שאיפה באמצעות פיפטה רב ערוצית. לאחר מכן, כתם את הצלחת על מגבת נייר כדי להשליך כל זכר של נוזל.
  4. יבש את הצלחת על ידי השארת הצלחת במכסה מנוע זרימה למינרית למשך 10 דקות.
  5. לאחר שהצלחת יבשה באופן ניכר, הניחו אותה בשקיק רדיד אלומיניום אטום עם שקיק מייבש ג'ל סיליקה ואחסנו את השקית בטמפרטורה של -20°C למשך 24 שעות.
    הערה: יש להשתמש בצלחות תוך 4 שבועות מרגע הדגירה.

4. לפני הליך הבדיקה

  1. הכן ריאגנטים (מאגר EIA, תקן CGRP, בקרת איכות CGRP, עוקב CGRP, מאגר שטיפה) בהתאם להוראות הערכה. הכינו את המגיב של אלמן רק לאחר סיום תקופת הדגירה של 16-20 שעות.
  2. הפשיר את כל הדגימות והריאגנטים ל- RT לפני ביצוע שאר הפרוטוקול.

5. הליך הבדיקה

  1. יש לשטוף כל באר בצלחת החסומה חמש פעמים באמצעות חיץ כביסה שסופק על ידי הערכה (300 מיקרוליטר/באר). עבור כל שטיפה, יש להשהות 30 שניות לאחר הנחת חיץ השטיפה בבארות, ולאחר מכן לזרוק את הנוזל או לשאוף באמצעות פיפטה רב ערוצית.
  2. לאחר השטיפה הסופית, הסר את כל החיץ מהבארות על ידי היפוך (היפוך הצלחת כדי להוציא את הנוזל בתוך בארות) או שאיפה באמצעות פיפטה רב ערוצית. כתם את הטיפות האחרונות על מגבת נייר והקש על הצלחת ההפוכה עד שכל הנוזלים יוסרו באופן גלוי מהבארות.
  3. הקצו לפחות שתי בארות ללא ריאגנטים או חיץ כדי להיקרא בארות "ריקות". לאחר מכן, הקצו לפחות שתי בארות אחרות לכריכה לא ספציפית (NSB).
  4. יש לפזר 100 μL של חיץ EIA לכל באר NSB.
  5. יש להוציא 100 μL של תקני CGRP בשכפול לבארות מתאימות.
  6. יש להוציא 100 μL של דגימות (שהורכבו מחדש במאגר EIA) ובקרת איכות בשכפול לבארות מתאימות.
  7. יש להוציא 100 מיקרוליטר של נותב CGRP (נוגדן אנטי-CGRP המחובר לאצטילכולין אסטראז) לכל באר המכילה NSB, תקני CGRP, דגימות ובקרת איכות. אל תחלק נותב לבארות "ריק".
  8. מכסים את הצלחת באמצעות יריעת כיסוי שקופה, אוטמים כל באר כך שהדגימות והריאגנטים בכל באר לא יתאדו באופן משמעותי. לדגור על הצלחת במשך 16-20 שעות ב 4 מעלות צלזיוס.
  9. לאחר השלמת הדגירה, יש להרכיב מחדש את מגיב אלמן בהתאם להוראות הערכה.
  10. הפוך את הצלחת כדי להסיר את כל הנוזלים. יש לשטוף כל באר (כמתואר לעיל) שלוש פעמים עם 300 μL של חיץ כביסה.
  11. לאחר השטיפה השלישית מוציאים את הנוזל מהצלחות, מניחים את הצלחת על צלחת שייקר ומנערים במהירות 120 סל"ד למשך 2 דקות.
  12. שוטפים את הצלחת שלוש פעמים נוספות. לאחר השטיפה הסופית, הסר את כל החיץ מהבארות על ידי היפוך או שאיפה באמצעות פיפטה רב ערוצית. כתם את טיפות הנוזל האחרונות על מגבת נייר והקש על הצלחת ההפוכה עד שכל הנוזל יוסר באופן גלוי מהבארות.
    הערה: ייתכן שלא יהיה צורך בשלוש הכביסות הנוספות המתוארות בשלב זה אם משתמשים במכונת כביסה מיקרו-צלחות של ELISA.
  13. יש לפזר 200 מיקרוליטר של מגיב אלמן לכל באר (לא כולל בארות "ריק").
  14. כסו את הצלחת ביריעת כיסוי חדשה ועטפו אותה ברדיד אלומיניום כדי למנוע חשיפה לאור. לדגור בחושך ב RT במשך 1 שעה.
  15. ודא שאין נוזל בצד האחורי של הצלחת שעלול לבלבל את קריאת הספקטרופוטומטר על ידי ניגוב החלק האחורי במגבת נייר יבשה.
  16. קרא את הלוח לספיגה של 405 ננומטר (צבע צהוב).

6. ניתוח נתונים

  1. חשב את הספיגה הממוצעת עבור כל "ריק", NSB, תקן, בקרת איכות, ואת הדגימות.
  2. הפחת את ערכי הספיגה הממוצעת של NSB מערכי התקן, בקרת האיכות וספיגת הדגימה.
  3. ספיגת העלילה על ציר ה-y והריכוז על ציר ה-x. בניית עקומה סטנדרטית באמצעות מודל רגרסיה לוגיסטית בן ארבעה פרמטרים.
  4. לאחר בניית העקומה, השתמש במשוואת העקומה כדי לקבוע את ריכוזי האינטרפולציה עבור בקרת איכות ודגימות, שניתן לקרוא על ציר x.
    הערה: העקומה הסטנדרטית מאומתת רק אם ריכוז האינטרפולציה המחושב עבור בקרת האיכות הוא בטווח של 25% מהריכוז הצפוי (בדרך כלל 125 pg/mL, אך ראה את התווית של בקבוקון בקרת האיכות).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

ישנם מספר שלבים מרכזיים בפרוטוקול שיש להדגיש. ראשית, יש להוסיף אפרוטינין, מעכב פרוטאז סרין, לדגימות דם שלמות מיד עם איסופו כדי למנוע פירוק אנזימטי נוסף של CGRP. הודגם כי פרוטאזות סרין ממלאות תפקיד במטבוליזם של CGRP, ומחקר קודם השתמש גם באפרוטינין לכימות CGRP בבני אדם21,35. אם לא נעשה שימוש במעכבי פרוטאזות, והכנת הדגימה אורכת יותר מ-60 דקות, ניתן לצפות לירידה ברמות CGRP בעת ביצוע ELISA. שנית, מיצוי פאזה מוצקה לפני ELISA מרכז CGRP ב eluent ומבטל מולקולות שעלולות לה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

מאמר זה מתאר פרוטוקול מאומת המאפשר זיהוי וכימות של CGRP בפלזמה אנושית. פרוטוקול זה סונתז לאחר שנמצא כי ערכות CGRP ELISA מסחריות אינן מכמתות במדויק מולקולה זו. לאחר קביעת פרוטוקול הכנת דגימה ועקומה סטנדרטית תקפה, ספייק והתאוששות ולינאריות של ניסויי דילול הראו כי אחוז המחלימים היה נמוך בהרבה מהצפוי. תוצאות דומות נמצאו בערכת CGRP ELISA מסחרית אחרת (טבלה 4). לשם השוואה, ההתאוששות הסטנדרטית המקובלת היא 80-120%36. תוצאות אלה עשויות להצביע על נוכחות של פעילות פרוטאז המשפילה CGRP

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין גילויים נוספים להוסיף.

תודות

ברצוננו להודות לרוברט נ' קול, לורן ר' דוויין ומרקוס איגלסיאס על הדיונים המועילים שלהם בנוגע לפרוטוקול זה. זה נתמך בחלקו על ידי מימון מהאגודה האמריקאית לאף אוטולוגיה (מענק מלגה, PSK), הקרן האמריקאית לחקר השמיעה (90066548/90072266, JPC), והמרכז הלאומי לקידום מדעי התרגום (NCATS), מרכיב של המכונים הלאומיים לבריאות (NIH), ומפת הדרכים של NIH למחקר רפואי (UL1 TR003098, NSF). תוכן הפרסום הוא באחריותם הבלעדית של המחברים ואינו מייצג בהכרח את ההשקפה הרשמית של ICTR ג'ונס הופקינס, NCATS או NIH.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
צינור מיקרוצנטריפוגה Safeseal 1.7 מ"לSorenson Bioscience, Inc.11510
99% מתנולThermoFisher ScientificL13255.0F
צינור צנטריפוגה חרוטי 15 מ"לFalcon14-959-49B
2 מ"ל תחתית עגולה קריוביאלית סטריליתCRYO. S122263
4% חומצה אצטיתThermoFisher Scientific035572.K2
6.0 מ"ל ואקוטיינר צינור איסוף EDTABD367863
Allegra 64R צנטריפוגה שולחניתבקמן קולטר, בע"
AprotininVWR76344-814
CGRP (אנושי) ערכת ELISABertin BioreagentA05481
מלאי CGRPBertin Bioreagent
EIA BufferBertin BioreagentA07000
Ellman'sReagent Bertin BioreagentA09000_49+1
פיפטות רב-ערוציותThermoFisher Scientific4661180N
אואזיס HLB 3 סמ"ק מחסניות VacWatersWAT094226
Orbital ShakerBellco7744-01010
מיקרופיפטות מדויקותThermoFisher ScientificF144055MG
SpectraMax M Series Multi-Mode Microplate קוראהתקנים מולקולרייםמספר חלק M2
TBS/ ג'לטיןדגים Bioworld, מבית Fischer Scientific50-199-167
מים טהורים במיוחד ELISAGrade Bertin BioreagentA07001
Vacufuge plus - רכז צנטריפוגותEppendorf22820109
Wash BufferBertin BioreagentA17000
מ367586

מקורות

  1. Russell, F. A., King, R., Smillie, S. -J., Kodji, X., Brain, S. D. Calcitonin gene-related peptide: physiology and pathophysiology. Physiological Reviews. 94 (4), 1099-1142 (2014).
  2. Brain, S. D., Grant, A. D. Vascular actions of calcitonin gene-related peptide and adrenomedullin. Physiological Reviews. 84 (3), 903-934 (2004).
  3. Edvinsson, L., Ekman, R., Jansen, I., McCulloch, J., Uddman, R. Calcitonin gene-related peptide and cerebral blood vessels: distribution and vasomotor effects. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 7 (6), 720-728 (1987).
  4. Donnerer, J., Stein, C. Evidence for an increase in the release of CGRP from sensory nerves during inflammation. Annals of the New York Academy of Sciences. 657, 505-506 (1992).
  5. Goadsby, P. J., Edvinsson, L., Ekman, R. Release of vasoactive peptides in the extracerebral circulation of humans and the cat during activation of the trigeminovascular system. Annals of Neurology. 23 (2), 193-196 (1988).
  6. Markowitz, S., Saito, K., Moskowitz, M. A. Neurogenically mediated leakage of plasma protein occurs from blood vessels in dura mater but not brain. The Journal of Neuroscience. 7 (12), 4129-4136 (1987).
  7. Saito, K., Markowitz, S., Moskowitz, M. A. Ergot alkaloids block neurogenic extravasation in dura mater: proposed action in vascular headaches. Annals of Neurology. 24 (6), 732-737 (1988).
  8. Lassen, L. H., et al. CGRP may play a causative role in migraine. Cephalalgia. 22 (1), 54-61 (2002).
  9. Cady, R. K., Vause, C. V., Ho, T. W., Bigal, M. E., Durham, P. L. Elevated saliva calcitonin gene-related peptide levels during acute migraine predict therapeutic response to rizatriptan. Headache. 49 (9), 1258-1266 (2009).
  10. Cernuda-Morollón, E., et al. Interictal increase of CGRP levels in peripheral blood as a biomarker for chronic migraine. Neurology. 81 (14), 1191-1196 (2013).
  11. Messlinger, K. The big CGRP flood-sources, sinks and signalling sites in the trigeminovascular system. The Journal of Headache and Pain. 19, 22(2018).
  12. Ochoa-Callejero, L., et al. Circulating levels of calcitonin gene-related peptide are lower in COVID-19 patients. Journal of the Endocrine Society. 5 (3), (2021).
  13. Rizzi, M., et al. CGRP plasma levels correlate with the clinical evolution and prognosis of hospitalized acute COVID-19 patients. Viruses. 14 (10), 2123(2022).
  14. Goadsby, P. J., Edvinsson, L., Ekman, R. Vasoactive peptide release in the extracerebral circulation of humans during migraine headache. Annals of Neurology. 28 (2), 183-187 (1990).
  15. Sarchielli, P., et al. Clinical-biochemical correlates of migraine attacks in rizatriptan responders and non-responders. Cephalalgia. 26 (3), 257-265 (2006).
  16. Greco, R., et al. Plasma levels of CGRP and expression of specific microRNAs in blood cells of episodic and chronic migraine subjects: towards the identification of a panel of peripheral biomarkers of migraine. The Journal of Headache and Pain. 21 (1), 122(2020).
  17. Tvedskov, J. F., et al. No increase of calcitonin gene-related peptide in jugular blood during migraine. Annals of Neurology. 58 (4), 561-568 (2005).
  18. Pellesi, L., et al. Plasma levels of CGRP during a 2-h infusion of VIP in healthy volunteers and patients with migraine: An exploratory study. Frontiers in Neurology. 13, 871176(2022).
  19. Kruuse, C., Iversen, H. K., Jansen-Olesen, I., Edvinsson, L., Olesen, J. Calcitonin gene-related peptide (CGRP) levels during glyceryl trinitrate (GTN)-induced headache in healthy volunteers. Cephalalgia. 30 (4), 467-474 (2010).
  20. Kraenzlin, M. E., Ch'ng, J. L., Mulderry, P. K., Ghatei, M. A., Bloom, S. R. Infusion of a novel peptide, calcitonin gene-related peptide (CGRP) in man. Pharmacokinetics and effects on gastric acid secretion and on gastrointestinal hormones. Regulatory Peptides. 10 (2-3), 189-197 (1985).
  21. Brain, S. D., Williams, T. J. Substance P regulates the vasodilator activity of calcitonin gene-related peptide. Nature. 335 (6185), 73-75 (1988).
  22. Kim, Y. -G., Lone, A. M., Nolte, W. M., Saghatelian, A. Peptidomics approach to elucidate the proteolytic regulation of bioactive peptides. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (22), 8523-8527 (2012).
  23. Katayama, M., et al. Catabolism of calcitonin gene-related peptide and substance P by neutral endopeptidase. Peptides. 12 (3), 563-567 (1991).
  24. Hartopo, A. B., et al. Endothelin-converting enzyme-1 gene ablation attenuates pulmonary fibrosis via CGRP-cAMP/EPAC1 pathway. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 48 (4), 465-476 (2013).
  25. Mair, J., et al. Plasma CGRP in acute myocardial infarction. Lancet. 335 (8682), 168(1990).
  26. Antúnez, C., et al. Calcitonin gene-related peptide modulates interleukin-13 in circulating cutaneous lymphocyte-associated antigen-positive T cells in patients with atopic dermatitis. The British Journal of Dermatology. 161 (3), 547-553 (2009).
  27. Gangula, P. R., et al. Pregnancy and steroid hormones enhance the vasodilation responses to CGRP in rats. The American Journal of Physiology. 276 (1), H284-H288 (1999).
  28. Hernanz, A., Medina, S., de Miguel, E., Martín-Mola, E. Effect of calcitonin gene-related peptide, neuropeptide Y, substance P, and vasoactive intestinal peptide on interleukin-1beta, interleukin-6 and tumor necrosis factor-alpha production by peripheral whole blood cells from rheumatoid arthritis and osteoarthritis patients. Regulatory Peptides. 115 (1), 19-24 (2003).
  29. Takeba, Y., Suzuki, N., Kaneko, A., Asai, T., Sakane, T. Evidence for neural regulation of inflammatory synovial cell functions by secreting calcitonin gene-related peptide and vasoactive intestinal peptide in patients with rheumatoid arthritis. Arthritis and Rheumatism. 42 (11), 2418-2429 (1999).
  30. Ahmed, M., Srinivasan, G. R., Theodorsson, E., Schultzberg, M., Kreicbergs, A. Effects of surgical denervation on substance P and calcitonin gene-related peptide in adjuvant arthritis. Peptides. 16 (4), 569-579 (1995).
  31. Neugebauer, V., Rümenapp, P., Schaible, H. G. Calcitonin gene-related peptide is involved in the spinal processing of mechanosensory input from the rat's knee joint and in the generation and maintenance of hyperexcitability of dorsal horn-neurons during development of acute inflammation. Neuroscience. 71 (4), 1095-1109 (1996).
  32. Wang, L. H., et al. Serum levels of calcitonin gene-related peptide and substance P are decreased in patients with diabetes mellitus and coronary artery disease. The Journal of International Medical Research. 40 (1), 134-140 (2012).
  33. Zelissen, P. M., Koppeschaar, H. P., Lips, C. J., Hackeng, W. H. Calcitonin gene-related peptide in human obesity. Peptides. 12 (4), 861-863 (1991).
  34. World Health Organization. WHO Guidelines on Drawing Blood: Best Practices in Phlebotomy. 3, Blood-sampling systems. World Health Organization. , Geneva. (2010).
  35. Raffaelli, B., et al. Plasma calcitonin gene-related peptide (CGRP) in migraine and endometriosis during the menstrual cycle. Annals of Clinical and Translational Neurology. 8 (6), 1251-1259 (2021).
  36. Andreasson, U., et al. A practical guide to immunoassay method validation. Frontiers in Neurology. 6, 179(2015).
  37. Messlinger, K., et al. CGRP measurements in human plasma-a methodological study. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 41 (13), 1359-1373 (2021).
  38. Sakamoto, S., et al. Enzyme-linked immunosorbent assay for the quantitative/qualitative analysis of plant secondary metabolites. Journal of Natural Medicines. 72 (1), 32-42 (2018).
  39. Lee, J. -E., Kim, S. Y., Shin, S. -Y. Effect of repeated freezing and thawing on biomarker stability in plasma and serum samples. Osong Public Health and Research Perspectives. 6 (6), 357-362 (2015).
  40. Fan, P. -C., Kuo, P. -H., Lee, M. T., Chang, S. -H., Chiou, L. -C. Plasma calcitonin gene-related peptide: A potential biomarker for diagnosis and therapeutic responses in pediatric migraine. Frontiers in Neurology. 10, 10(2019).
  41. Raffaelli, B., et al. Change of CGRP plasma concentrations in migraine after discontinuation of CGRP-(receptor) monoclonal antibodies. Pharmaceutics. 15 (1), 293(2023).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

CGRPELISA

מאמרים קשורים