Method Article

פיתוח מהיר של מעגלי זיהוי מצב התא עם Poly-Transfection

DOI:

10.3791/64793

⸱

February 24th, 2023

 ,  ,  , 
1Department of Biological Engineering, Massachusetts Institute of Technology, 2School of Biological Engineering, University of British Columbia, 3Department of Electrical Engineering and Computer Science, Massachusetts Institute of Technology

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מעגלים גנטיים מורכבים גוזלים זמן רב כדי לתכנן, לבדוק ולמטב. כדי להקל על תהליך זה, תאי יונקים נדבקים באופן המאפשר בדיקה של סטויכיומטריה מרובים של רכיבי מעגל בבאר אחת. פרוטוקול זה מתאר את השלבים לתכנון ניסויים, טרנספקציה וניתוח נתונים.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מעגלים גנטיים של יונקים הוכיחו את הפוטנציאל לחוש ולטפל במגוון רחב של מצבי מחלה, אך אופטימיזציה של רמות רכיבי המעגלים נותרה מאתגרת ודורשת עבודה. כדי להאיץ את התהליך הזה, המעבדה שלנו פיתחה פולי-טרנספקציה, הרחבה בעלת תפוקה גבוהה של טרנספקציה מסורתית של יונקים. בפולי-טרנספקציה, כל תא באוכלוסייה הנגועה מבצע למעשה ניסוי שונה, בודק את התנהגות המעגל במספרי העתקי דנ"א שונים ומאפשר למשתמשים לנתח מספר רב של סטויכיומטריה בתגובה חד-סירית. עד כה הודגמו פולי-טרנספקציות הממטבות את היחסים של מעגלים תלת-רכיביים בבאר תאים אחת; באופן עקרוני, אותה שיטה יכולה לשמש לפיתוח מעגלים גדולים עוד יותר. ניתן ליישם בקלות תוצאות פולי-טרנספקציה כדי למצוא יחסים אופטימליים בין דנ"א לטרנספקט משותף עבור מעגלים חולפים או כדי לבחור רמות ביטוי עבור רכיבי מעגלים ליצירת קווי תאים יציבים.

כאן, אנו מדגימים את השימוש בפולי-טרנספקציה כדי לייעל מעגל בן שלושה רכיבים. הפרוטוקול מתחיל בעקרונות תכנון ניסיוני ומסביר כיצד פולי-טרנספקציה מתבססת על שיטות מסורתיות של קו-טרנספקציה. לאחר מכן, poly-transfection של תאים מתבצעת ואחריו cytometry זרימה כמה ימים מאוחר יותר. לבסוף, הנתונים מנותחים על ידי בחינת פרוסות של נתוני ציטומטריית זרימה של תא בודד המתאימים לתת-קבוצות של תאים עם יחסי רכיבים מסוימים. במעבדה, פולי-טרנספקציה שימשה לאופטימיזציה של מסווגי תאים, בקרי משוב והזנה, מוטיבים דו-יציבים ורבים אחרים. שיטה פשוטה אך רבת עוצמה זו מאיצה את מחזורי התכנון של מעגלים גנטיים מורכבים בתאי יונקים.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תחום הביולוגיה הסינתטית של יונקים התקדם במהירות, מפיתוח חלקים פשוטים של חישה ותגובה בקווי תאים בתרבית ועד אופטימיזציה של רשתות גנים מורכבות כדי להתמודד עם אתגרים בעולם האמיתי באבחון ובטיפול1. מעגלים מתוחכמים אלה מסוגלים לחוש קלט ביולוגי מפרופילי מיקרו-רנ"א, דרך ציטוקינים ועד תרופות של מולקולות קטנות, וליישם מעגלי עיבוד לוגיים הכוללים טרנזיסטורים, מסנני פסים, מתגי החלפה ומתנדים. הם גם הראו תוצאות מבטיחות במודלים של בעלי חיים של מחלות כמו סרטן, דלקת פרקים, סוכרת, ועודרבים 1,2,3,4,5. עם זאת, ככל שהמורכבות של מעגל גדלה, אופטימיזציה של הרמות של כל אחד ממרכיביו הופכת מאתגרת יותר ויותר.

סוג אחד שימושי במיוחד של מעגל גנטי הוא מסווג תאים, אשר ניתן לתכנת לחוש ולהגיב למצבים תאיים. ייצור סלקטיבי של תפוקות חלבון או RNA במצבים תאיים ספציפיים הוא כלי רב עוצמה להנחיה ותכנות התמיינות של תאים ואורגנואידים, לזהות ולהשמיד תאים חולים ו / או סוגי תאים לא רצויים, ולווסת את תפקודם של תאים טיפוליים 1,2,3,4,5 . עם זאת, יצירת מעגלים בתאי יונקים שיכולים לסווג במדויק מצבי תאים ממספר מיני רנ"א תאיים ו/או חלבונים הייתה מאתגרת ביותר.

אחד השלבים הגוזלים זמן רב ביותר בפיתוח מעגל סיווג תאים הוא לייעל את רמות הביטוי היחסי של גנים המרכיבים רכיבים בודדים, כגון חיישנים וגורמי עיבוד, בתוך המעגל. כדי להאיץ את אופטימיזציה של מעגלים ולאפשר בנייה של מעגלים מתוחכמים יותר, עבודה אחרונה השתמשה במידול מתמטי של מעגלים מסווגי תאים ומרכיביהם כדי לחזות הרכבים וטופולוגיות אופטימליים 6,7. בעוד שזה הראה תוצאות חזקות עד כה, ניתוח מתמטי מוגבל על ידי הצורך לאפיין באופן שיטתי את התנהגות הקלט-פלט של גנים המרכיבים במעגל, אשר גוזל זמן. יתר על כן, מספר עצום של בעיות תלויות הקשר יכולות להופיע במעגלים גנטיים מורכבים, ולגרום להתנהגות של מעגל מלא להתריס נגד תחזיות המבוססות על אפיונים של חלקים בודדים 8,9.

כדי לפתח ולבדוק במהירות רבה יותר מעגלים מורכבים של יונקים כגון מסווגי מצב תאים, המעבדה שלנו פיתחה טכניקה הנקראת poly-transfection10, אבולוציה של פרוטוקולי טרנספקציה משותפת של פלסמיד. בטרנספקציה משותפת, מיני דנ"א פלסמידים מרובים מורכבים יחד עם מגיב שומנים או פולימר טעון חיובית, ואז מועברים לתאים באופן מתואם (איור 1A). בפולי-טרנספקציה, פלסמידים מורכבים בנפרד עם המגיב, כך שהדנ"א מכל קומפלקס טרנספקציה מועבר לתאים באופן דה-קורלציה (איור 1B). באמצעות שיטה זו, תאים בתוך האוכלוסייה הנגועה נחשפים לשילובים רבים של יחסים של שני מטעני דנ"א או יותר הנושאים רכיבי מעגל שונים.

כדי למדוד את היחסים בין רכיבי המעגלים המועברים לכל תא, כל קומפלקס טרנספקציה בתוך פולי-טרנספקציה מכיל כתב פלואורסצנטי מבוטא באופן קונסטיטוטיבי המשמש כפרוקסי לקליטה תאית של המכלול. דנ"א מילוי שאינו מכיל יסודות הפעילים בתוך תא יונק משמש לכוונון הכמות היחסית של רכיבי הכתב הפלואורסצנטי והמעגלים המועברים לתא בקומפלקס טרנספקציה יחיד ונדון ביתר פירוט בדיון. דוגמה לדנ"א מילוי המשמש במעבדת וייס הוא פלסמיד המכיל רצף טרמינטור, אך ללא פרומוטור, רצף קידוד וכו'. לאחר מכן ניתן להשוות תאים עם יחסים שונים של רכיבי מעגל כדי למצוא יחסים אופטימליים לתפקוד מעגל הגנים. זה בתורו מניב תחזיות שימושיות לבחירת מקדמים ורכיבי מעגל אחרים כדי להשיג רמות ביטוי גנים אופטימליות בעת שילוב רכיבי מעגל לווקטור יחיד לאינטגרציה גנטית (למשל, לנטיוירוס, טרנספוזון או משטח נחיתה). לכן, במקום לבחור יחסים בין רכיבי מעגל בהתבסס על אינטואיציה או באמצעות תהליך ניסוי וטעייה הגוזל זמן, פולי-טרנספקציה מעריכה מגוון רחב של סטויכיומטריה בין חלקים גנטיים בתגובה חד-סירית.

במעבדה שלנו, פולי-טרנספקציה אפשרה אופטימיזציה של מעגלים גנטיים רבים, כולל מסווגי תאים, בקרי משוב והזנה, ומוטיבים דו-יציבים. שיטה פשוטה אך רבת עוצמה זו מאיצה באופן משמעותי את מחזורי התכנון של מעגלים גנטיים מורכבים בתאי יונקים. פולי-טרנספקציה שימשה מאז לאפיון מספר מעגלים גנטיים כדי לחשוף את פונקציות העברת הקלט-פלט הרב-ממדיות שלהם ברזולוציה גבוהה 10, לייעל טופולוגיית מעגל חלופית עבור סיווג מצב התא11, ולהאיץ פרויקטים שונים שפורסמו12,13 ומתמשכים.

כאן אנו מתארים ומתארים את זרימת העבודה לשימוש בפולי-טרנספקציה כדי למטב במהירות מעגל גנטי (איור 2). הפרוטוקול מראה כיצד להפיק נתוני פולי-טרנספקציה באיכות גבוהה ולהימנע ממספר שגיאות נפוצות בפרוטוקול הפולי-טרנספקציה ובניתוח הנתונים (איור 3). לאחר מכן הוא מדגים כיצד להשתמש בפולי-טרנספקציה כדי לאפיין רכיבי מעגלים פשוטים, ותוך כדי כך, למדוד תוצאות פולי-טרנספקציה כנגד קו-טרנספקציה (איור 4). לבסוף, התוצאות של פולי-טרנספקציה מראות אופטימיזציה של מעגל מסווג הסרטן (איור 5).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: טבלה 1 וטבלה 2 משמשות כהפניות משמעותיות לפרוטוקול זה. טבלה 1 מציגה קנה מידה של מגיבים עבור תגובות, וטבלה 2 מציגה אריתמטיקה של יחס דנ"א עבור דוגמה לפולי-טרנספקציה המתוארת בפרוטוקול (המחצית העליונה) ולניסוי המשך אפשרי (המחצית התחתונה).

1. הכנת תאים לטרנספקציה

  1. יש לוודא כי תרבית תאי הכליה העוברית האנושית (HEK293) היא 60%-80% חופפת לפני תחילת הפרוטוקול. כדי לעשות זאת, זרע 1 x 106 תאים בתרבית רקמה 100 מ"מ x 15 מ"מ צלחת פטרי יומיים לפני, לדגור ב 37 ° C עם 5% CO2.
    הערה: למרות שהפרוטוקול שלנו מתמקד בתאי HEK293, ניתן להחליף סוגי תאים אחרים.
  2. הכן את המדיה והתאים לטרנספקציות כמתואר להלן.
    1. יש לחמם מראש לפחות 20 מ"ל של תמיסה של מדיום הנשר המעובד של דולבקו (DMEM) עם 10% נסיוב בקר עוברי (FBS) ו-1% חומצות אמינו לא חיוניות (NEAA; ראו טבלת חומרים) עד 37°C. לחמם מראש לפחות 2.4 מ"ל של טריפסין ו 2.4 מ"ל של מלוחים חוצצים פוספט (PBS) ל 37 ° C גם כן. טרום חם מופחת סרום בינוני ~ 16 ° C.
      הערה: כל עבודת תרבית רקמות צריכה להתבצע בזהירות בארון בטיחות ביולוגית.
  3. השהה מחדש את התאים בתמיסת DMEM כמתואר להלן.
    1. לשאוף ולהיפטר מהתקשורת הנוכחית. יש לפזר 2 מ"ל PBS על תרבית התאים HEK293 כדי לשטוף את התאים. לשאוף ולהיפטר PBS.
    2. יש לפזר 2 מ"ל טריפסין על תרבית התאים HEK293. מניחים את צלחת הפטרי באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות או עד שהתאים כבר לא נצמדים לצלחת. החזירו את הצלחת לארון הבטיחות הביולוגית ודללו את תמיסת התא על ידי ניפוק 8 מ"ל של תמיסת DMEM לצלחת.
    3. מערבבים את התמיסה על ידי פיטום עדין למעלה ולמטה מספר פעמים. שואפים את כל המדיה ומניחים אותה בצינור חרוטי של 15 מ"ל.
  4. צנטריפוגה את התאים ב 300 x גרם במשך 3 דקות כדי להניע אותם. לשאוף את התקשורת (נזהר לא לשאוף את התאים) ולהשליך אותה. להשעות מחדש את התאים ב 5 מ"ל של תמיסת DMEM, ערבוב על ידי pipeting בעדינות למעלה ולמטה.
  5. הערך את ריכוז התאים הנוכחי באמצעות מונה תאים אוטומטי (המופיע בטבלת החומרים). זרעו שש בארות (בדוגמה זו) בצלחת בת 24 בארות עם 1 x 105 תאים (לצפיפות זריעה של 50,000 תאים לסמ"ק2).
  6. הוסף את תמיסת ה- DMEM עד 500 μL (הוסף תחילה תמיסת DMEM לבארות), ולאחר מכן תייג באר אחת לכל טיפול באופן הבא: ללא בקרת צבע, בקרת mKO2, בקרת TagBFP, בקרת NeonGreen, בקרת כל הצבעים ופולי-טרנספקציה 1. בארות הבקרה TagBFP, mKO2 ו-NeonGreen הן בקרות צבע יחיד עבור כל החלבונים הפלואורסצנטיים הכלולים בפולי-טרנספקציה.

2. ביצוע טרנספקציה

  1. הכינו צינורות לכל צבר DNA. הניחו בצד צינורות מיקרוצנטריפוגות בנפח 1.5 מ"ל ותייגו את הצינורות כך: ללא בקרת צבע, בקרת mKO2, בקרת TagBFP, בקרת NeonGreen, כל בקרת הצבע, תערובת פולי-טרנספקציה 1 ומיקס פולי-טרנספקציה 2.
    1. הוסף 36 μL של מדיום סרום מופחת לבקרת ללא צבע, בקרת mKO2, בקרת TagBFP, בקרת NeonGreen וכל צינורות בקרת הצבע. הוסף 18 μL של מדיום סרום מופחת לכל אחת מתערובת poly-transfection 1 ו- poly-transfection mix 2 tubes.
      הערה: ההנחה היא שריכוזי הפלסמיד הם 150 ננוגרם/מיקרוליטר.
    2. הוסף 600 ng של פלסמיד מילוי לצינור הבקרה ללא צבע. הוסף 300 ng של mKO2 ו- 300 ng של פלסמיד מילוי לצינור בקרת הצבע mKO2. הוסף 300 ng של TagBFP ו- 300 ng של פלסמיד מילוי לצינור בקרת הצבע TagBFP.
    3. הוסף 300 ng של פלסמיד NeonGreen מכונן ו 300 ng של פלסמיד מילוי לצינור בקרת צבע NeonGreen. הוסף 100 ng כל אחד של mKO2, TagBFP ו- NeonGreen המכונן, כמו גם 300 ng של פלסמיד מילוי, לצינור הבקרה של כל הצבעים.
    4. הוסף 150 ng של mKO2 לשפופרת Poly-transfection Mix 1. הוסף 75 ng של כתב NeonGreen פלסמיד ו 75 ng של פלסמיד מילוי לתערובת poly-transfection 1 צינור.
    5. הוסף 150 ng של TagBFP לצינור poly-transfection mix 2. הוסף 75 ng של פלסמיד L7ae ו 75 ng של פלסמיד מילוי לתערובת poly-transfection תערובת 2 צינור.
  2. צור את תערובת האב של הטרנספקציה בצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל על-ידי שילוב של 216 מיקרוליטר של תווך סרום מופחת עם 9.48 מיקרוליטר של מגיב טרנספקציה (ראה טבלה 1 עבור יחסי ריאגנטים וקנה מידה של תגובה). מערבבים היטב על ידי פיטום למעלה ולמטה, ומניחים בצד.
  3. הוסף 1.58 μL של מגיב משפר לכל אחד מפקדי ללא צבע, בקרת צבע יחידה וכל צינורות בקרת הצבע. הוסף 79 μL של מגיב משפר לכל אחד צינורות תערובת poly-transfection. מערבבים כל צינור בנפרד על ידי פיפטינג נמרץ.
  4. הוסף את תערובת האב של הטרנספקציה לכל צינור המכיל DNA.
    1. הוסף 37.58 μL של תערובת מאסטר טרנספקציה לכל אחד מפקדי ללא צבע, בקרת צבע יחידה וכל צינורות בקרת הצבע. מערבבים כל צינור בנפרד על ידי פיפטינג נמרץ.
    2. הוסף 18.79 μL של תערובת מאסטר transfection לכל אחד מצינורות תערובת poly-transfection. מערבבים כל צינור בנפרד על ידי פיפטינג נמרץ.
  5. מוציאים את תערובות הטרנספקציה לתוך הבארות.
    1. פיפטה 65.97 μL של כל תערובת transfection עבור צבע ללא צבע, צבע יחיד, וכל פקדי צבע לתוך הבארות המתאימות.
    2. פיפטה 32.98 μL של פולי-טרנספקציה מערבבים 1 לתוך באר הפולי-טרנספקציה ומערבלים את הצלחת במהירות אך בעדינות בתבנית הספרה שמונה הדוקה לאורך משטח שטוח כדי לפזר את הקומפלקסים ביעילות. לאחר מכן, פיפטה 32.98 μL של poly-transfection לערבב 2 לתוך אותה באר poly-transfection ולערבל את הצלחת באותו אופן.
  6. מניחים את הצלחת באינקובטור ב 37 ° C, עם 5% CO2 וללא טלטול, לתקופה של 48 שעות.
    הערה: כדי להגדיל את כדאיות התא, ניתן להחליף את המדיה התאית כל 6 שעות לאחר הטרנספקציה (אם כי זה לא תמיד הכרחי, ועם תאי HEK293 ונגזרותיו, יש להיזהר לא לנתק את התאים מהצלחת בעת שינוי המדיה).
מגיבכמותשינוי גודל
מדיום מופחת בסרום לתערובת DNA36 μL לכל צינור בקרה, 18 μL לכל צינור poly-transfection0.05 μL DNA מופחת בסרום בינוני/טבעי לכל צינור, עם נפח נוסף של 10-20% לטיפול בצנרת
דנ א300-600 ננוגרם לכל צינור
P30001.58 μL לכל צינור בקרה, 0.79 μL לכל צינור poly-transfection0.0022 μL P3000/ng DNA לכל צינור, עם תוספת של 10-20%
מדיום סרום מופחת לתערובת מאסטר Lipo36 μL לכל צינור בקרה, 18 μL לכל צינור poly-transfection0.05 μL הפחית את הדנ"א הבינוני/טבעי הכולל בסרום, עם נפח נוסף של 10-20% כדי להסביר את הפיפטינג
מגיב טרנספקציה ומשפר1.58 μL לכל צינור בקרה, 0.79 μL לכל צינור poly-transfection0.0022 μL Lipofectamine 3000/ng DNA, עם 10-20% תוספת

טבלה 1: קנה מידה מגיב עבור טרנספקציות. הטבלה מציינת את היחס הנכון של מגיב שיש לכלול עבור כמות הדנ"א הכלולה בבאר יחידה. זה יכול לשמש כדי לשנות את קנה המידה של תגובות ביעילות וליצור תערובות אב. כמויות של מגיב הוגדלו כדי לכלול עודף של 20%.

3. הכנת תאים לציטומטריית זרימה

  1. מראש לחמם לפחות 4.2 מ"ל של פתרון DMEM ל 37 ° C. טרום חם לפחות 4.2 מ"ל של טריפסין ו 4.2 מ"ל של PBS עד 37 ° C. שמור על תמיסת חיץ מיון תאים המופעלת על ידי פלואורסצנטיות (FACS) ב- 4 ° צלזיוס עד שהיא מוכנה לשימוש.
  2. השהה מחדש את התאים בתמיסת החיץ FACS (PBS בתוספת 1% BSA, 5 mM ethylenediaminetetraacetic acid [EDTA] ו-0.1% נתרן אזיד [NaN3], כדי להפחית גושים; ראה טבלת חומרים) כמתואר להלן.
    1. לשאוף ולהשליך את המדיה הנוכחית בכל באר. יש לפזר 5 מ"ל של PBS לתוך כל באר כדי לשטוף את התאים. לשאוף ולהיפטר PBS.
    2. יש להוציא 5 מ"ל טריפסין לכל באר. מניחים את הצלחת באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות, או עד שהתאים כבר לא נצמדים למנה. החזר את הצלחת לארון הבטיחות הביולוגית ודלל את תמיסות התאים על ידי חלוקת 5 מ"ל של תמיסת DMEM לכל באר.
    3. עבור כל באר, לערבב את הפתרון על ידי pipeting בעדינות למעלה ולמטה מספר פעמים. עבור כל באר, לשאוף את כל התקשורת ומניחים אותו בצינור חרוטי 15 מ"ל.
  3. צנטריפוגה את התאים ב 300 x גרם במשך 3 דקות כדי להניע אותם. לשאוף את התקשורת, להיזהר לא לשאוף את התאים ולהשליך אותו. בכל צינור, להשהות מחדש את התאים ב 5 מ"ל של תמיסת חיץ FACS, ערבוב על ידי pipeting בעדינות למעלה ולמטה.
  4. מעבירים כל תמיסת תרחיף תאים דרך מסננת (להסרת גושים) לצינורות חרוטיים ציטומטריית זרימה נפרדים. שמור צינורות אלה על קרח לא יותר מ 1 שעה, ולבצע ציטומטריה זרימה בהקדם האפשרי.

4. ביצוע ציטומטריית זרימה

הערה: הפעלת ציטומטר זרימה דורשת הכשרה מתאימה וידע במשימות הדרושות. מכיוון שתוכנה וציוד עשויים להשתנות ויש להדריך משתמשים באופן כללי, סעיף זה מתייחס לפעולות ספציפיות שכדאי לבצע.

  1. ראשית, בדקו את התאים הנגועים בבקרת פלסמיד המילוי (ללא בקרת צבע) כדי לבחור מאפייני תאים ולהימנע מחריגות (כולל אגרגטים, פסולת וכו '). אמנם ישנם שילובים רבים של פרמטרים להבחנה בין תאים, אך השתמש בשלוש האפשרויות הכלליות הבאות כדרך טובה להמחיש תכונות מבחינות.
    1. הסתכל על אזור הפיזור הצדדי (יומן רישום או קנה מידה ליניארי לפי העדפה/סוג תא) לעומת אזור הפיזור קדימה (קנה מידה ליניארי).
    2. הסתכלו על גובה הפיזור הצדדי (סולם היומן) לעומת רוחב הפיזור הצדדי (קנה מידה ליניארי).
    3. הסתכל על רוחב הפיזור קדימה (קנה מידה ליניארי) לעומת גובה הפיזור קדימה (קנה מידה ליניארי).
  2. לאחר מכן, התבונן בפקדי הצבע היחיד. השתמש בבקרת כל הצבעים כדי לכוונן את מתחי המכשיר, כך שהאותות מכל חלבון פלואורסצנטי מנורמלים ליחידות שרירותיות שוות ערך (a.u.) של פלואורסצנטיות. לאחר מכן, הפעל את פקדי הצבע היחיד עבור כל חלבון פלואורסצנטי, המשמשים לקביעת מטריצת הפיצוי, ומאפשרים תיקון דימום.
    הערה: באופן אידיאלי, הטווח הדינמי המלא של ערכי הפלואורסצנטיות אמור להיות גלוי. נורמליזציה נוספת של אותות חלבון פלואורסצנטי יכולה להיעשות באמצעות המרה ליחידות סטנדרטיות (למשל, מולקולות של פלואורסצאין שווה ערך [MEFLs; ראו Beal et al.15]). כדי לאפשר המרת MEFL במהלך ניתוח, הפעל חרוזי כיול קשת. כיול כזה שימושי גם להפחתת שונות האות ממכשיר למכשיר ומהשתנות האות היומיומית16.
  3. הפעל את צינור הדגימה poly-transfection.
    הערה: במידת האפשר, מומלץ להריץ תאים בגודל 1,000 x 10^ (^ = תערובות), מכיוון שיש לחלק את הפולי-טרנספקציות בממדים גבוהים יותר לפחים נוספים במהלך הניתוח, וכל סל זקוק למספיק תאים (באופן אידיאלי >10) כדי לבצע השוואות מובהקות סטטיסטית.

5. ביצוע ניתוח לאחר הניסוי

  1. בתחילה, השתמש בנתונים מהפקדים (ואם רלוונטי, החרוזים) כדי להבטיח תוצאות מדויקות. השתמש באחד מכלי התוכנה הזמינים כדי לבצע gating תאים חיים (באמצעות שערים שתוארו לעיל), פיצוי ותיקון autofluorescence.
    הערה: בדרך כלל אנו משתמשים בקוד MATLAB מותאם אישית (לדוגמה, https://github.com/jonesr18/MATLAB_Flow_Analysis או Cytoflow17), הכולל גם ממשק משתמש גרפי וגם ספריית Python המתאימה לשלב העיבוד המוקדם ולניתוח פולי-טרנספקציה.
שיטתמורכבng סמן פלואורסצנטיng L7ae (שבר)ng כתב (שבר)ng מילוי DNA (שבר)סה"כ (ng)
פולי-טרנספקציה 1600
→115075 (½)75 (½)300
→215075 (½)75 (½)300
פולי-טרנספקציה 2600
→115025 (1/6)125 (5/6)300
→2150125 (5/6)25(1/6)300

טבלה 2: כמויות דנ"א עבור פולי-טרנספקציה שהודגמו בפרוטוקול, וניסוי מעקב לדוגמה עם יחסי פלסמיד מכווננים. החצי העליון של הטבלה מראה את הרכב הפלסמידים המשמשים בניסוי פולי-טרנספקציה פשוט. המחצית התחתונה מציגה את הרכבו של ניסוי מעודכן המתאים את יחסי הפלסמיד לתת-דגימה טובה יותר של מרחב ריכוז היפותטי, שבו אפנן ביטוי הגנים נמצא ביחס אופטימלי יותר של 1:5 ביחס למדווח שלו, מה שמניב יותר תאים נגועים לדגום סביב יחס זה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

באיור 1 אנו משווים קו-טרנספקציה לפולי-טרנספקציה. בטרנספקציה משותפת, כל הפלסמידים מועברים באותה תערובת טרנספקציה, והתוצאה היא מתאם גבוה בין כמות כל פלסמיד שכל תא בודד מקבל (איור 1A). בעוד שמספר הפלסמידים הכולל המועבר לכל תא משתנה באופן משמעותי, הפלואורסצנטיות של שני חלבוני הדיווח בתאים בודדים באוכלוסייה מתואמת היטב, מה שמצביע על כך ששני הפלסמידים מועברים יחד ביחס קבוע למדי. תאים נגועים עשויים לספוג קומפלקסים מעטים או רבים, אך מכיוון שלכל קומפלקס יש כמויות מתואמות...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שיטות אב טיפוס מהירות כגון תכנון בעזרת מחשב (CAD), breadboarding והדפסה תלת-ממדית חוללו מהפכה בתחומי המכניקה, החשמל וההנדסה האזרחית. היכולת לחפש במהירות פתרונות אפשריים רבים לאתגר נתון מאיצה מאוד את ההתקדמות בתחום. אנו מאמינים כי פולי-טרנספקציה היא טכנולוגיה מקבילה להנדסה ביולוגית, המאפשרת אב טיפוס מהיר של מעגלים גנטיים. בנוסף, טכנולוגיות אב טיפוס מהירות אחרות דורשות איטרציה רציפה מעשית של פתרונות אפשריים מרובים, בעוד שפולי-טרנספקציה מסוגלת לחקור פתרונות רבים בו זמנית. פולי-טרנספקציה מאפשרת לבדוק מספר רב של שילובים של יח...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ר.ו. הוא מייסד שותף של Strand Therapeutics ו-Replay Bio; ר.ו. ור.ג. הגישו פטנט זמני הקשור למסווג סוג תא.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ברצוננו להודות לחברי מעבדת וייס לשעבר שהובילו או תרמו לפיתוח שיטת הפולי-טרנספקציה ויישומה על מסווגי תאים: ג'רמי גאם, בר דיאנדרת' וג'ין הא; חברי מעבדה נוספים של וייס שתרמו לפיתוח/אופטימיזציה נוספים של השיטה: וונלונג שו, ליי וואנג וכריסטיאן קובה-סמאניגו; פרופ' ג'וש לאונרד וחברי הקבוצה, כולל פטריק דונהיו והיילי אדלשטיין, על בדיקת פולי-טרנספקציה ומתן משוב; ופרופ' ניקה שכיבה, שהזמינה את כתב היד הזה ונתנה משוב. ברצוננו להודות גם למכונים הלאומיים לבריאות [R01CA173712, R01CA207029, P50GM098792]; הקרן הלאומית למדע [1745645]; מענק תמיכה (ליבה) של מרכז הסרטן [P30CCA14051, בחלקו] מה- NCI, ומהמכונים הלאומיים לבריאות [P50GM098792] למימון עבודה זו.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
15 מ"ל צינורות חרוטיים של קורנינג פלקוןThermoFisher Scientific14-959-53A
צלחת פטרי 24 בארותכל חברה לבחירה(לא פירוגני, סטרילי, RNase, DNase, DNA וללא פירוגן)
סרום בקר אלבומיןNEBB9000S
צנטריפוגהכל חברה לבחירהמסוגלת לחשוף צינורות פלקון 15 מ"ל ל -300 rcf
Countess 3 מונה תאים אוטומטיThermoFisher ScientificAMQAX2000
שקופיות תא ספירת תאים של רוזנתThermoFisher ScientificC10228
Cytoflowחבילתhttps://cytoflow.readthedocs.io/en/stable/# 
DMEMVWR10-013-CVהשתמש במדיה הנכונה עבור סוג התא שלך
EDTA ThermoFisher Scientific03690-100ML
סרום בקר עובריSigma AldrichF4135
תאי HEKATCCCRL-1573השתמש בסוג התא הרלוונטי לניסויים שלך. תאי HEK נוטים לעבור ביעילות רבה.
תאי HeLaATCCCRL-12401השתמש בסוג התא הרלוונטי לניסויים שלך.
משפר Lipofectamine 3000 ו- P3000ThermoFisher ScientificL3000001השתמש במגיב הנכון לסוג התא שלך; מגיב טרנספקציה ומשפר
LSRFציטומטר זרימהBD BiosciencesN/A
MEM תמיסת חומצות אמינו לא חיוניותGibco11140050
צינורות מיקרוצנטריפוגה, 1.5 מ"לכל חברה לבחירה
Opti-MEMThermoFisher Scientific31985070סרום מופחת בינוני
פוספט חוצץ מלחThermoFisher Scientific70011044
חרוזי כיול קשתSpherotechURCP-100-2H
נתרן אזידסיגמא אולדריץ'S2002
טריפסיןVWR25-053-CI
תוכנה לא מסחרית

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Prochazka, L., Benenson, Y., Zandstra, P. W. Synthetic gene circuits and cellular decision-making in human pluripotent stem cells. Current Opinion in Systems Biology. 5, 93-103 (2017).
  2. Sayeg, M. K., et al. Rationally designed microRNA-based genetic classifiers target specific neurons in the brain. ACS Synthetic Biology. 4 (7), 788-795 (2015).
  3. Zhen, X., Wroblewska, L., Prochazka, L., Weiss, R., Benenson, Y. Multi-Input RNAi-based logic circuit for identification of specific cancer cells. Science. 333 (6047), 1307-1311 (2011).
  4. Nissim, L., et al. Synthetic RNA-based immunomodulatory gene circuits for cancer immunotherapy. Cell. 171 (5), 1138-1150 (2017).
  5. Nissim, L., Bar-Ziv, R. H. A tunable dual-promoter integrator for targeting of cancer cells. Molecular Systems Biology. 6, 444(2010).
  6. Mohammadi, P., Castel, S. E., Brown, A. A., Lappalainen, T. Quantifying the regulatory effect size of cis-acting genetic variation using allelic fold change. Genome Research. 27 (11), 1872-1884 (2017).
  7. Prochazka, L., et al. Discrete-to-analog signal pluripotent stem cells conversion in human. BioRxiv. , (2021).
  8. Del Vecchio, D. Modularity, context-dependence, and insulation in engineered biological circuits. Trends in Biotechnology. 33 (2), 111-119 (2015).
  9. Shakiba, N., Jones, R. D., Weiss, R., Del Vecchio, D. Context-aware synthetic biology by controller design: Engineering the mammalian cell. Cell Systems. 12 (6), 561-592 (2021).
  10. Gam, J. J., DiAndreth, B., Jones, R. D., Huh, J., Weiss, R. A 'poly-transfection' method for rapid, one-pot characterization and optimization of genetic systems. Nucleic Acids Research. 47 (18), 106(2019).
  11. Jones, R. D., et al. Robust and tunable signal processing in mammalian cells via engineered covalent modification cycles. Nature Communications. 13 (1), 1720(2022).
  12. Jones, R. D., et al. An endoribonuclease-based feedforward controller for decoupling resource-limited genetic modules in mammalian cells. Nature Communications. 11 (1), 5690(2020).
  13. DiAndreth, B., Wauford, N., Hu, E., Palacios, S., Weiss, R. PERSIST platform provides programmable RNA regulation using CRISPR endoRNases. Nature Communications. 13 (1), 2582(2022).
  14. Frei, T., et al. Characterization and mitigation of gene expression burden in mammalian cells. Nature Communications. 11 (1), 4641(2020).
  15. Beal, J., Weiss, R., Yaman, F., Adler, A., Davidsohn, N. A method for fast, high-precision characterization of synthetic biology devices. Computer Science and Artificial Intelligence Laboratory Technical Report. Massachusetts institute of technology. , Cambridge. MIT-CSAIL-TR-2012-008 (2012).
  16. Beal, J., et al. Meeting measurement precision requirements for effective engineering of genetic regulatory networks. ACS Synthetic Biology. 11 (3), 1196-1207 (2022).
  17. Teague, B. Cytoflow: A Python toolbox for flow cytometry. bioRxiv. , (2022).
  18. Ferreira, J. P., Overton, K. W., Wang, C. L. Tuning gene expression with synthetic upstream open reading frames). Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (28), 11284-11289 (2013).
  19. Michaels, Y. S., et al. Precise tuning of gene expression levels in mammalian cells. Nature Communications. 10 (1), 818(2019).
  20. Saito, H., et al. Synthetic translational regulation by an L7Ae-kink-turn RNP switch. Nature Chemical Biology. 6 (1), 71-78 (2010).
  21. Wroblewska, L., et al. Mammalian synthetic circuits with RNA binding proteins for RNA-only delivery. Nature Biotechnology. 33 (8), 839-841 (2015).
  22. Wagner, T. E., et al. Small-molecule-based regulation of RNA-delivered circuits in mammalian cells. Nature Chemical Biology. 14 (11), 1043-1050 (2018).
  23. Sekuklu, S. D., Donoghue, M. T. A., Spillane, C. miR-21 as a key regulator of oncogenic processes. Biochemical Society Transactions. 37, 918-925 (2009).
  24. Stanton, B. C., et al. Genomic mining of prokaryotic repressors for orthogonal logic gates. Nature Chemical Biology. 10 (2), 99-105 (2014).
  25. Stanton, B. C., et al. Systematic transfer of prokaryotic sensors and circuits to mammalian cells. ACS Synthetic Biology. 3 (12), 880-891 (2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Poly TransfectionGenetic CircuitsCell State IdentificationMammalian CellsFlow CytometryCo TransfectionDNA Ratio OptimizationFluorescent ReportersCell ClassifierSynthetic Biology

Related Articles