מוצג פרוטוקול לבידוד והעשרה נוחים ובעלי תפוקה גבוהה של גבעול קפיטט בלוטי וטריכומות ססיל מקנאביס סאטיבה. הפרוטוקול מבוסס על מיצוי יבש ללא חיץ של טריכומות באמצעות חנקן נוזלי בלבד, קרח יבש ומסננות ניילון ומתאים למיצוי RNA וניתוח שעתוק (transcriptomic analysis).
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
בידוד לא מימי והעשרה של גבעול קפיטט בלוטי וטריכומות ססילה מקנאביס סאטיבה
במאמר זה
סיכום
תקציר
מאמר זה מציג פרוטוקול לבידוד והעשרה נוחים ובעלי תפוקה גבוהה של גבעול קפיטט בלוטי וטריכומות ססיליות מקנאביס סאטיבה. המסלולים הביוסינתטיים למטבוליזם של קנבינואידים וטרפנים נדיפים ממוקמים בעיקר בטריכומות הקנאביס , וטריכומות מבודדות מועילות לניתוח תעתיק. הפרוטוקולים הקיימים לבידוד טריכומות בלוטות לאפיון שעתוק אינם נוחים ומספקים ראשי טריכומות פגומים וכמות נמוכה יחסית של טריכומות מבודדות. יתר על כן, הם מסתמכים על מכשירים יקרים ואמצעי בידוד המכילים מעכבי חלבון כדי למנוע פירוק RNA. הפרוטוקול הנוכחי מציע לשלב שלושה שינויים נפרדים כדי להשיג כמות גדולה של גבעול קפיטט בלוטי מבודד וטריכומות ססיליות מתפרחות נקביות בוגרות של C. sativa ועלי מניפה, בהתאמה. השינוי הראשון כרוך בהחלפת חנקן נוזלי באמצעי הבידוד הקונבנציונלי כדי להקל על מעבר הטריכומות דרך המיקרו-מסננות. השינוי השני כרוך בשימוש בקרח יבש כדי לנתק את הטריכומות ממקור הצמח. השינוי השלישי כרוך בהעברת החומר הצמחי ברציפות דרך חמש מיקרו-מסננות בגודל נקבוביות הולך ופוחת. הדמיה מיקרוסקופית הדגימה את יעילות טכניקת הבידוד עבור שני סוגי הטריכומות. בנוסף, איכות הרנ"א שהופק מהטריכומות המבודדות התאימה לניתוח שעתוק במורד הזרם.
מבוא
טריכומות בלוטות הן מבנים דמויי שיער הנמצאים בצמחים המכילים מטבוליטים שניוניים רבים1 ומייצגים בנק רב ערך של גנים ואנזימים ביוסינתטיים חדשים2. בקנאביס, הביוסינתזה של המטבוליטים המשניים החשובים, קנבינואידים3 וטרפנים4, ממוקמת בטריכומות. בהתחשב בתפקידם של הטריכומות בקביעת איכות הקנאביס הן לשימושים רפואיים והן לשימושים פנאי, המחקר של ביטוי גנים של טריכומות הוא מעניין. כדי לאפיין את הביטוי של גנים ספציפיים לטריכומות, יש לבודד תחילה את הטריכומות המעניינות. פרוטוקולי בידוד טריכומות תוארו לראשונה כבר בשנת 19925, וההתפתחויות האחרונות שלהם נסקרו לאחרונה2. באופן כללי, ניתן לחלק פרוטוקולים לחילוץ טריכומות בלוטות לאפיון שעתוק לשני שלבים עוקבים נפרדים. השלב הראשון כולל הפרדה פיזית יסודית של הטריכומות מרקמת הצמח. שלב זה יכול להתבצע על ידי שימוש בקרח יבש5, חרוזי זכוכית עם מכשיר מסחרי 6,7, טחינת החומר הצמחי כנגד מסננת רשת8, או ערבול רקמת הצמח בחיץ בידוד9. השלב השני כולל הפרדה מעודנת יותר של הטריכומות המעניינות משאריות הצמח המיקרוסקופי ו/או מסוגי הטריכומות האחרים. שלב זה יכול להתבצע באמצעות צנטריפוגה שיפוע צפיפות 8,10 או מסננות בגדלים שונים 7,9. בשל הרגישות הקיצונית של RNA ברקמות מעובדות לחומרים משפילים, שני שלבים עוקבים אלה מתבצעים בדרך כלל בתווך בידוד קר כקרח, לעתים קרובות בנוכחות מעכבי חלבון4.
פרוטוקולי בידוד טריכומות קונבנציונליים דורשים, בנוסף לטמפרטורות הקרות כקרח, כמויות גדולות של אמצעי בידוד כדי להבטיח הליך חילוץ יעיל. השילוב של רכיבים אלה גורם לתהליך בידוד מפרך וגוזל זמן המעכב תפוקה גבוהה. הצגת פרוטוקול בידוד טריכומות חלופי פשוט וידידותי למשתמש עשויה אפוא להועיל להיבטים שונים הקשורים לאפיון הטריכומות. המאמר הנוכחי נועד להציע פרוטוקול חלופי לבידוד טריכומות קפיטט גבעול ובלוטות ססיל מקנאביס סאטיבה על ידי שילוב ושילוב של מספר אלמנטים מהפרוטוקולים הקונבנציונליים. יסודות אלה כוללים קרח יבש5, העברת הטריכומות דרך מספר מיקרו-מסננות עם גודל נקבוביות קטן 7,9, והחלפת חנקן נוזלי (LN) בתווך הבידוד8.
החידוש של פרוטוקול בידוד הטריכומות הנוכחי, בהשוואה לפרוטוקולים קונבנציונליים, בא לידי ביטוי במספר דרכים. פרוטוקול זה נוח, שכן הוא אינו דורש רכיבים מסוכנים. ההליך יכול להתבצע במעבדה עם אמצעי זהירות מינימליים ומאפשר תפוקה גבוהה. החלפת LN במדיום בידוד הנוזלים הסטנדרטי מבטיחה את שלמות הטריכומות לאורך כל תהליך הבידוד, ומאפשרת ניתוח שעתוק עוקב. עם סובלימציה של LN וקרח יבש, הטריכומות המבודדות נותרות ללא שאריות מזיקות. יתר על כן, הנטייה של LN לסובלימציה בטמפרטורת החדר מאפשרת שימוש נדיב בו לאורך כל הפרוטוקול. לעומת זאת, שימוש בכמויות גדולות של אמצעי בידוד קונבנציונלי יוצר קשיים מעשיים בטיפול בו. לבסוף, הפרוטוקול מקטין את ההפרדה של תא הדיסק ממבנה הראש השביר הנותר של הטריכומה הבלוטתית, ומאפשר שמירה על תכולת מרחב הראש.
פרוטוקול זה מוצג בצורה מפורטת שלב אחר שלב שנועד לסייע לפרקטיקה הטכנית של בידוד טריכומות קפיטט בלוטות C. sativa. הפרוטוקול מספק זרימת עבודה ניתנת לניהול המביאה לטריכומות מבודדות עם ריכוז גבוה וטוהר המתאימים לאנליזה מולקולרית במורד הזרם.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
הערה: החומר הצמחי ששימש במחקר זה כלל ארבעה זנים של C. sativa ARO-Volcani (CS-11, CS-12, CS-13 ו-CS-14) שגודלו במרכז וולקני, ישראל, כמתואר במקום אחר11. טריכומות גבעולות קפיטט בלוטות בודדו מתפרחות פורחות בוגרות, וטריכומות ססיל קפיטט בלוטות בודדו מעלי מניפה גדולים מצמחי אם בוגרים שאינם פורחים. כל החומר הצמחי נקטף טרי ואוחסן מיד ב -80 מעלות צלזיוס.
אזהרה: קרח יבש ו-LN משמשים לאורך כל הפרוטוקול. חומרים אלה מסוכנים ביותר. הטריכומות המבודדות יכולות להכיל חלקיקי קרח יבש שיכולים ליצור לחץ גז מסוכן כאשר הם מוחדרים לצינורות אטומים; לכן, כל הכובעים צריכים להיות מנוקבים במחט. מומלץ מאוד להשתמש במשקפי מגן, ללבוש מעבדה מתאים וכפפות לטיפול בטמפרטורות נמוכות במיוחד.
1. הכנה להפרדה ראשונית של טריכומות מהחומר הצמחי
- מרסקים גוש קרח יבש לפתיתים קטנים ועדינים בעזרת פטיש וחפץ שטוח קשיח במיכל פלסטיק בנפח 5 ליטר.
- מסננים את פתיתי הקרח היבש הדק (קטן מ-5 מ"מ) מהקרח היבש הלא כתוש בעזרת מסננת גדולה (דרך נקבוביות קטנות מ-5 מ"מ) למיכל פלסטיק נוסף בנפח 5 ליטר. יוצקים כ-200 ס"מ3 (200 מ"ל) מפתיתי הקרח היבשים לתוך זכוכית זקופה בנפח 1 ליטר.
- מוסיפים עד 10 גרם של תפרחות C. sativa קפואות (מעתה והלאה מכונות חומר צמחי) על השכבה הראשונה של קרח יבש כתוש, ומכסים בשכבה נוספת של 200 ס"מ3 של קרח יבש כתוש דק.
- כסו את הפתח של זכוכית 1 ליטר בשתיים עד שלוש שכבות של כילה נגד יתושים של דלת מסך 1 מ"מ, והדקו אותה לצדדים החיצוניים של הזכוכית באמצעות גומיות (איור 1).
- יוצקים LN לתוך מיכל נירוסטה גדול בעל תחתית עגולה (ראה טבלת חומרים), שם ייאספו הטריכומות המבודדות.
- הכניסו רשת של 350 מיקרומטר למסננת קמח/מסננת כדי לכסות את רשת ניפוי הקמח מלמטה (איור 2). אם קיימת מסננת קמח עם טבעת פלסטיק ניתקת, הכניסו את הרשת בגודל 350 מיקרומטר כך שתהיה מאובטחת מתחת לרשת של מסננת הקמח. אם לא, הדקו את הרשת בגודל 350 מיקרומטר להיקף מסננת הקמח בעזרת גומיות.
- הניחו את מסננת הקמח מעל מיכל הנירוסטה הגדול בעל התחתית העגולה המלאה ב-LN (איור 3). ודא שרוחב המיכל עולה על זה של מסנן הקמח כדי למזער את אובדן המסה המנופה מחוץ למיכל הנירוסטה בתחתית העגולה.
2. הפרדת טריכומות מהחומר הצמחי
- נערו את ה-1 ליטר כשהפתח שלה מכוון כלפי מטה לכיוון מסננת הקמח כמו באמצעות שייקר מלח גדול (איור 4).
- הניחו בצד את הזכוכית בנפח 1 ליטר כל 2-3 דקות כדי לאפשר ניפוי של הקרח היבש הכתוש והחומר הצמחי שהצטבר על מסננת הקמח.
- לנפות את מסננת הקמח אופקית כדי להקל על המעבר של החומר הצמחי לתוך LN במיכל נירוסטה עגול למטה למטה.
- הוסף LN למיכל הנירוסטה וקרח יבש כתוש לכוס זכוכית 1 ליטר כאשר מפלסיהם נמוכים. לחדש את החומר הצמחי המשומש בכוס הזכוכית עם 10 גרם נוספים של חומר צמחי טרי כאשר החומר הצמחי על מסננת הקמח מתרוקן. החידוש בדרך כלל לא צריך לחזור על עצמו יותר מפעמיים.
- חזור על שלבים 2.1-2.4 עד לאיסוף כמות מספקת של טריכומות מועשרות במיכל הנירוסטה בתחתית העגולה. בדרך כלל, 20 גרם של חומר צמחי טרי מספיק עבור מיצוי RNA וניתוח תעתוק.
- ודא שיש חומר דמוי אבקה לבנה (המורכבת מפסולת צמחים, טריכומות בלוטות וקרח יבש כתוש) בתחתית מיכל הנירוסטה השקוע ב- LN. תצפית מיקרוסקופית תסייע לקבוע אם נאספה כמות מספקת של טריכומות; עם זאת, שלב זה עלול לחסום את זרימת הפרוטוקול. בדרך כלל, 10-20 גרם של חומר צמחי ראשוני מספיק עבור רוב הבידודים; עם זאת, ייתכנו הבדלים בצפיפות הטריכומות של הצמחים.
הערה: מנקודה זו, ניתן להשהות את הניסוי ולהפעיל אותו מחדש מאוחר יותר. אם משהה לזמן קצר, יש להוסיף כמויות מספיקות של LN כך שהטריכומות יישארו שקועות. לחלופין, ניתן לאסוף את הטריכומות ולאחסן אותן בטמפרטורה של 80°C למשך עד 3 חודשים לשימוש מאוחר יותר, כמתואר בשלב 5.
3. הפרדת טריכומות קפיטטות בלוטות (גבעול וססיל) מסוגי טריכומות אחרים, כגון טריכומות בולבוסיות וציסטוליות, ופסולת
- הוסיפו כמות קטנה של LN למיכל נירוסטה קטן ונקי בעל תחתית עגולה.
- קפלו פעמיים מסננת מיקרו בגודל 40X40 ס"מ עם רשת בגודל 150 מיקרומטר כדי לקבל קיפול בגודל 20X20 ס"מ, ופתחו אותה. ודאו שהוא דומה לצורה דמוית חרוט (איור 5).
- הצמידו את חרוט הרשת לקצה מיכל הנירוסטה בעל התחתית העגולה בעזרת סיכת כביסה אחת או שתיים, כך שהחלק הפתוח של החרוט זקוף וחלקו המחודד שקוע בחלקו ב-LN.
- שפכו בעדינות את ה-LN ואת החומר דמוי האבקה הלבנה משלב 2.6 לתוך חרוט המסננת הזעיר.
- יש למרוח בעדינות מברשת רחבה כדי לאסוף ולהעביר את שאריות החומר הצמחי מהמכל הראשון לתוך חרוט הרשת בגודל 150 מיקרומטר.
- מוסיפים עוד LN למיכל הראשון, וחוזרים על תנועת ההברשה עד שכל החומר הצמחי מועבר לחרוט המיקרו-מסננת.
- נתקו בזהירות את סיכת הכביסה ממכסה המיכל, ופתחו את חרוט המיקרו-מסננת כך שהטריכומות ממוקמות באמצע מסננת המיקרו הפתוחה. החזיקו את כל ארבע הפינות של המסננת הזעירה יחד, כך שהחלק האמצעי שמכיל את הטריכומות יישאר שקוע ב-LN (איור 6).
- בעודכם אוחזים בכל ארבע פינות המסננת הזעירה, טבלו ונערו בעדינות את המסננת הזעירה ב-LN במיכל הפלדה כאילו אתם מחדירים שקיק תה. המשך בתנועת טבילה/ניעור (אנכית ואופקית) למשך דקה אחת. יש פשרה בין איכות הבידוד לכמות. תנועות טבילה ארוכות יותר עלולות לגרום לכמויות גדולות יותר של טריכומות, אך דרגת הבידוד שלהן עשויה להיות נמוכה יותר. בסך הכל, דקה אחת מומלצת כמתאימה הן לאיכות והן לכמות.
הערה: תנועת ניפוי זו היא החלק הקריטי ביותר בפרוטוקול ויש לבצע אותה בהתאם. - אופציונלי: יש לגרוף את שאריות הצמחים הלא מנופות ואת הטריכומות הגדולות יותר (שעדיין שקועות ב-LN) העטופות במרכז המסננת הזעירה לתוך מבחנה של 13 מ"ל או 50 מ"ל, ולאחסן בטמפרטורה של -80°C לשימוש עתידי.
אזהרה: כדי למנוע הצטברות של גז בלחץ (מהקרח היבש ושאריות LN), נקב חור במכסה המבחנה באמצעות מחט מעוקרת. ניתן להחליף את הפקק לאחר הפחתת הלחץ, שזה בדרך כלל לאחר 24 שעות.
4. העברת טריכומות דרך מסננות זעירות של גודל נקבוביות הולך ופוחת
- העבירו את הטריכומות המסוננות השקועות ב-LN בתחתית מיכל הנירוסטה הקטן בעל התחתית העגולה ברצף דרך מיקרו-מסננות עם גודל נקבוביות הולך וקטן (105 מיקרומטר, 80 מיקרומטר, 65 מיקרומטר ו-50 מיקרומטר), באותו אופן שהוצג בשלב 3.
5. איסוף הטריכומות הרצויות
- מוציאים את הטריכומות הרצויות השקועות ב-LN ועטופות במיקרו-מסננת בגודל 50 מיקרומטר בעזרת כף מקוררת מראש (ב-LN). מניחים אותם על צלחת נקייה.
הערה: בשלב בידוד סופי זה, הטריכומות הרצויות נאספות מהמסננת. - העבירו במהירות את הטריכומות דמויות האבקה לתוך צינור 1.5 מ"ל שכותרתו מקורר מראש באמצעות מרית מקוררת מראש או כף מדידה המוחדרת לתוך הצינורית (איור 7). אחסן את הצינורות מיד ב -80 ° C למחקרים נוספים.
הערה: תרשים זרימת עבודה סכמטי המתאר את פרוטוקול הבידוד כולו מוצג באיור 8.
6. תצפית וניתוח של הטריכומות המטוהרות
- הניחו כמות קטנה (10 מ"ג) של טריכומות מבודדות על מגלשת מיקרוסקופ באמצעות מרית מקוררת מראש (באמצעות LN). מוסיפים טיפת מים, ומתבוננים ישירות במיקרוסקופ אור ללא כתמים. הערך את דרגת הבידוד והזיהום הכוללת באמצעות הגדלות נמוכות (פי 10) וגבוהות (פי 40). ההעשרה נאמדת חזותית על ידי הכמות היחסית של טריכומות ביחס לרקמה שאינה טריכומה, כפי שניתן לראות באיור 9.
- לבצע מיצוי RNA וניתוח איכות מ 50 מ"ג של C. sativa בלוטות מבודדות גבעול קפיטט וטריכומות sessile.
הערה: ערכת מיצוי מסחרית (ראה טבלת חומרים) המשתמשת באסטרטגיה מבוססת פולי-A של טיהור mRNA שימשה למיצוי RNA.- יש להשהות מחדש 50 מ"ג מהטריכומות המבודדות בתמיסת הליזיס, מערבולת למשך 30 שניות, לבצע סוניקציה ביחידת ניקוי על-קולית קרה כקרח במהירות 35 קילוהרץ למשך 5 דקות, ולחלץ את ה-mRNA מהדגימות בהתאם לפרוטוקול היצרן (ראה טבלת חומרים).
- כדי להעריך את שלמות הרנ"א המופק מהטריכומות, יש לקבוע את ריכוז הרנ"א, את הכמות הכוללת ואת ערכי מספר שלמות הרנ"א (RIN) באמצעות מערכת מעבדה על שבב (ראו טבלת חומרים).
- בצע ניתוח RNAseq של שברי הטריכומה (אופציונלי). ניתוח RNAseq וניתוח ביואינפורמטיקה של קריאות רציפות יכול להתבצע על ידי שירותי מיקור חוץ סטנדרטיים
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
השינוי העיקרי הכלול בפרוטוקול זה בהשוואה לפרוטוקולי בידוד טריכומות קונבנציונליים הוא החלפת אמצעי הבידוד הסטנדרטי ב- LN. השימוש ב- LN כאמצעי בידוד מאפשר זרימת עבודה רגועה, מכיוון שכל עוד הדגימות שקועות ב- LN, לא סביר שתתרחש השפלה מטבולית. יתר על כן, מכיוון שהפרוטוקול נמנע מהרכיבים המסוכנים (כלומר, חומצה aurintricarboxylic ו- β-mercaptoethanol) המשמשים במדיום בידוד טריכומה מסורתי, העבודה אינה מוגבלת למכסה מנוע כימי. עם זאת, חשוב לנקוט באמצעי הזהירות הדרושים בעת הטיפול בקרח יבש ו- LN.
כדי להעריך ...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
בהשוואה לפרוטוקולי בידוד הטריכומות הקיימים כיום, שני שינויים עיקריים מתוארים בפרוטוקול הנוכחי. אלה כוללים ניתוק של הטריכומות מהחומר הצמחי באמצעות קרח יבש בשלב הראשוני והחלפת LN בתווך החיץ הנוזלי הנפוץ. השינוי הראשון לטיהור טריכומות C. sativa מבוסס על פרוטוקול מוקדם יותר שהציג שימוש בקרח יבש כתוש כדי לנתק את הטריכומות מדוקרניום5. בעוד שפרוטוקולי בידוד טריכומות מסורתיים משתמשים בדרך כלל במבחנה קטנה (50 מ"ל), במחקר זה נעשה שימוש בכד זכוכית 1 ליטר עם כמות נדיבה של קרח יבש כתוש, המאפשר עיבוד נ...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין ניגודי עניינים.
תודות
המחברים מודים על תמיכה כספית מחברת CannabiVar Ltd. כל החומר הצמחי סופק בנדיבות על ידי פרופ' חיננית קולטאי ממרכז וולקני.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| ביו-אנלייזר RNA Pico 6000 שבב | Agilent, גרמניה | מספר הזמנה מחדש 5067-1513 | מערכת מעבדה על שבב |
| Transsonic-310 | Elma, גרמניה | D-78224 | יחידת ניקוי אולטרסאונד |
| ערכת הכנה לדוגמא של TruSeq RNA v2 | Illumina, ארה"ב | RS-122-2001 | הכנת דגימה לספריית ריצוף RNA |
| ערכת RNA כוללת של צמח ספקטרום | סיגמא-אולדריץ', ארה"ב | RNA כוללת של צמח | STRN50-1KT |
| מסננת מיקרו ניילון בגודל רשת של 350 ומיקרו; m (40X40 ס"מ או יותר מהיקף מסננת הקמח) | Sinun Tech, ישראל | r0350n350210 | ניילון צמצם מסך |
| מיקרו-מסננת ניילון עם גודל רשת של 150 ומיקרו; מטר (גודל 30X30 ס"מ) | סינון טק, ישראל | r0150n360465 | ניילון צמצם מסך |
| מיקרו-מסננת ניילון עם גודל רשת o 105 ומיקרו; מטר (גודל 30X30 ס"מ) | סינון טק, ישראל | r0105n320718 | ניילון צמצם מסך |
| מיקרו-מסננת ניילון עם גודל רשת o 80 ומיקרו; מטר (גודל 30X30 ס"מ) | סינון טק, ישראל | r0080n370465 | ניילון צמצם מסך |
| מיקרו-מסננת ניילון עם גודל רשת o 65 ומיקרו; מטר (גודל 30X30 ס"מ) | סינון טק, ישראל | r0065n340715 | ניילון צמצם מסך |
| מיקרו-מסננת ניילון עם גודל רשת o 50 ומיקרו; מטר (גודל 30X30 ס"מ) | סינון טק, ישראל | r0080n370465 | ניילון צמצם מסך |
| עד 10 גרם חומר צמחי קפוא (מאוחסן ב-80 oC או חנקן נוזלי) | |||
| כפפות מתאימות לטיפול בטמפרטורות | |||
| משקפי | |||
| דלת מסך 1 מ"מ (יתוש) רשת (רצועה של 30X100 ס"מ) | |||
| מסננת גדולה (מסננת) עם חורים כ-5 מ"מ | |||
| זכוכית 1 ליטר | |||
| 1 גוש קרח יבש (0.5-1 ק"ג) | |||
| פטיש וחפץ | |||
| שני מיכלי | |||
| גומיות | |||
| קמח גדולה או מסננת מסננת - רצוי אחת עם טבעת פלסטיק ניתנת להסרה בהיקף | |||
| כמה מיכלי נירוסטה תחתונים עגולים גדולים וקטנים. אחד מהם צריך להיות גדול מהיקף מסננת הקמח (בקוטר של כ-40 ס"מ), כדי למזער את אובדן המסה המנופה מחוץ למיכל | |||
| כף נירוסטה, מרית וסקופולה | |||
| צלחת | |||
| נקייה | |||
| מספר אטבי כביסהצינורות 1.5 מ"ל מקוררים מראש (באמצעות חנקן נוזלי) עם חורים שננעצו על המכסה בעזרת מחט | |||
| שני מיכלי חנקן | |||
| מכחול |
מקורות
- Schilmiller, A. L., Last, R. L., Pichersky, E. Harnessing plant trichome biochemistry for the production of useful compounds. Plant Journal for Cell & Molecular Biology. 54 (4), 702-709 (2008).
- Liu, Y., Jing, S. X., Luo, S. H., Li, S. H. Non-volatile natural products in plant glandular trichomes: chemistry, biological activities and biosynthesis. Natural Product Reports. 36 (4), 626-665 (2019).
- Fairbairn, J. W. The trichomes and glands of Cannabis sativa L. UN Bulletin on Narcotics. 23, 29-33 (1972).
- Booth, J. K., Page, J. E., Bohlmann, J. Terpene synthases from Cannabis sativa. PLoS One. 12 (3), 0173911(2017).
- Yerger, E. H., et al. A rapid method for isolating glandular trichomes. Plant Physiology. 99 (1), 1-7 (1992).
- Gershenzon, J., Maffei, M. M., Croteau, R. Biochemical and histochemical localization of monoterpene biosynthesis in the glandular trichomes of spearmint (Mentha spicata). Plant Physiology. 89 (4), 1351-1357 (1989).
- Gershenzon, J., et al. Isolation of secretory cells from plant glandular trichomes and their use in biosynthetic studies of monoterpenes and other gland products. Analytical Biochemistry. 200 (1), 130-138 (1992).
- Conneely, L. J., Mauleon, R., Mieog, J., Barkla, B. J., Kretzschmar, T. Characterization of the Cannabis sativa glandular trichome proteome. PLoS One. 16 (4), 0242633(2021).
- Liu, Y., Zhu, P., Cai, S., Haughn, G., Page, J. E. Three novel transcription factors involved in cannabinoid biosynthesis in Cannabis sativa L. Plant Molecular Biology. 106 (1-2), 49-65 (2021).
- Slone, J. H., Kelsey, R. G. Isolation and purification of glandular secretory cells from Artemisia tridentata (ssp. vaseyana) by Percoll density gradient centrifugation. American Journal of Botany. 72 (9), 1445-1451 (1985).
- Namdar, D., et al. Terpenoids and Phytocannabinoids Co-Produced in Cannabis Sativa Strains Show Specific Interaction for Cell Cytotoxic Activity. Molecules. 24 (17), 3031(2019).
- McDowell, E. T., et al. Comparative functional genomic analysis of Solanum glandular trichome types. Plant Physiology. 155 (1), 524-539 (2011).
- Bergau, N., Santos, A. N., Henning, A., Balcke, G. U., Tissier, A. Autofluorescence as a signal to sort developing glandular trichomes by flow cytometry. Frontiers in Plant Science. 7, 949(2016).
- Livingston, S. J., et al. Cannabis glandular trichomes alter morphology and metabolite content during flower maturation. The Plant Journal. 101 (1), 37-56 (2019).
- Turner, J. C., Hemphill, J. K., Mahlberg, P. G. Gland distribution and cannabinoid content in clones of Cannabis sativa L. American Journal of Botany. 64 (6), 687-693 (1977).
- Turner, J. C., Hemphill, J. K., Mahlberg, P. G. Quantitative determination of cannabinoids in individual glandular trichomes of Cannabis sativa L. (Cannabaceae). American Journal of Botany. 65 (10), 1103-1106 (1978).
- Hammond, C. T., Mahlberg, P. G. Morphology of glandular hairs of Cannabis sativa from scanning electron microscopy. American Journal of Botany. 60 (6), 524-528 (1973).
- Marks, M. D., et al. A new method for isolating large quantities of Arabidopsis trichomes for transcriptome, cell wall, and other types of analyses. The Plant Journal. 56 (3), 483-492 (2008).
- Huebbers, J. W., et al. An advanced method for the release, enrichment and purification of high-quality Arabidopsis thaliana rosette leaf trichomes enables profound insights into the trichome proteome. Plant Methods. 18 (1), 12(2022).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
