מאמר שיטה

חקר מתילציה של חלבון ארגינין: גישות ושיטות

DOI:

10.3791/64821

⸱

20 בינואר 2023

1Pharmacology and Toxicology and Structural Genomics Consortium, University of Toronto

במאמר זה

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מאמרים שנדונו:

Hutchinson, A., Seitova, A. ייצור חלבוני PRMT רקומביננטיים באמצעות מערכת וקטור הביטוי של Baculovirus. כתב העת לניסויים חזותיים. (173), doi: 10.3791/62510 (2021).

Maniaci, M., Marini, F., Massignani, E., Bonaldi, T. גישת פרוטאומיקה מבוססת ספקטרומטריית מסה לניתוח R-Methylation של חלבון גלובלי ובביטחון גבוה. כתב העת לניסויים חזותיים. (182), doi: 10.3791/62409 (2022).

Habisch, H., Zhang, F., Zhou, Q., Madl, T. חקר מתילום הארגינין על ידי ספקטרוסקופיה של תהודה מגנטית גרעינית. כתב העת לניסויים חזותיים. (178), doi: 10.3791/63245 (2021).

Szewczyk, M. M., Vu, V., Barsyte-Lovejoy, D. שיטות כמותיות לחקר פעילות חלבון ארגינין מתילטרנספראז 1-9 בתאים. כתב העת לניסויים חזותיים. (174), doi: 10.3791/62418 (2021).

Poulard, C., Jacquemetton, J., Valantin, J., Treilleux, I., Le Romancer, M. בדיקת קשירת קרבה מאפשרת זיהוי, לוקליזציה וכימות של מתילציה של חלבון ארגינין ברקמה קבועה. כתב העת לניסויים חזותיים. (185), doi: 10.3791/64294 (2022).

מאמר מערכת

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מתילציה של חלבון ארגינין היא שינוי לאחר תרגום המעורב בוויסות של ספקטרום רחב של תהליכים ביולוגיים 1,2,3. תשעת החברים במשפחת החלבון ארגינין מתילטרנספראז (PRMTs) יכולים לבצע מתילציה של ארגינינים בצורה מונומתיל ודי-מתיל סימטרית או אסימטרית. הבנת ההשלכות התפקודיות וקטלוג הסובסטרטים המתיליים של PRMTs קידמו באופן דרמטי את ההבנה של אנזימי PRMT והקלו על הקשר שלהם למחלה2. בנוסף, הפיתוח של מעכבים חזקים וסלקטיביים איפשר גישות מבוססות ביולוגיה כימית לחקר PRMTs והאיץ את הפיתוח הקליני של חומרי המטרה PRMT3. ככל שתחום ה-PRMTs מתקדם, שיטות חדשות ויישומיהן יאפשרו עוד יותר להבהיר את הרגולציה והביולוגיה של אנזימים אלה.

באוסף שיטות זה, מאמר על ייצור רקומביננטי של חלבוני PRMT מספק תיאור מפורט של מערכת ביטוי מבוססת נגיף בקולוך4. ניתן ליצור מספר PRMTs באמצעות ביטוי החיידקים; עם זאת, PRMTs תלויים גדולים או מורכבים כגון PRMT7 או PRMT5 דורשים מערכת ביטוי תאי חרקים. שיטה זו כבר הועילה למאמצים רבים במבחנה לקבוע את המצעים של PRMTs.

חקר מצעי PRMT בסביבה התאית דורש גישות זיהוי מתוחכמות. שני מאמרים באוסף זה מציגים מתודולוגיות נפרדות המסתמכות על העשרת נוגדנים של ארגינינים שעברו מתילציה ואחריה כימות ספקטרומטריית מסה או כימות בלתי תלוי בנוגדנים באמצעות תהודה מגנטית גרעינית (NMR). פותחו מספר נוגדנים המזהים מצבי מתילציה מובהקים ושימשו במחקרים המזהים את מצעי PRMT5. שיטת ספקטרומטריית המסה מאפשרת הערכה כמותית של מתילציה של ארגינין חלבון תאי על ידי שימוש בתיוג מטבולי, טכניקות הפרדה מתוחכמות לאחר מכן והעשרה מבוססת נוגדנים6. כמה מבני משפחת PRMT מעדיפים מתילציה של ארגינינים הנמצאים במוטיבים חוזרים ונשנים של RGG השוכנים באזורים המופרעים באופן מהותי של חלבונים7. השיטה המבוססת על ספקטרוסקופיה NMR מאפשרת לקבוע את מצב המתילציה והמיקום של כל נגזרות הארגינין (מונו ודי, סימטריות וא-סימטריות) כאשר ניתן לכמת אותן באופן אמין בתוך דגימות ביולוגיות מורכבות8.

לבסוף, כדי לזהות שאריות ארגינין מתילציה בחלבונים ספציפיים, שני מאמרים מספקים גישות המבוססות על כתמים מערביים ובדיקת קשירת קרבה (PLA). שתי השיטות הללו משתמשות בזיהוי מבוסס נוגדנים אך נבדלות בשיטת הזיהוי ובמידע המסופק. שיטת הכתם המערבי היא כמותית והייתה בעלת ערך באפיון בדיקות כימיות9. ה-PLA מספק מידע על המיקום המרחבי של ארגינין שעבר מתילציה מכיוון שהוא משתמש בנוגדני חלבון המטרה ובנוגדן הגנרי למונו או די-מתיל ארגינין, ובכך עוקף את הצורך ביצירת נוגדנים ספציפיים וניתן להשתמש בו באופן יוצא דופן ברקמות קבועות10.

יחד, מתודולוגיות מגוונות אלו יאפשרו גילוי חזק של ארגינינים שעברו מתילציה במערכות תאים ומצבי מחלה שונים ויקדמו עוד יותר את הידע הבסיסי על התפקוד הביולוגי של אנזימי PRMT.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DBL נתמך על ידי מועצת המחקר למדעי הטבע וההנדסה של קנדה (NSERC). קונסורציום הגנומיקה המבנית הוא ארגון צדקה רשום (לא: 1097737) המקבל כספים מ-Bayer AG, Boehringer Ingelheim, Bristol Myers Squibb, Genentech, Genome Canada באמצעות המכון לגנומיקה של אונטריו [OGI-196], EU/EFPIA/OICR/McGill/KTH/Diamond Innovative Medicines Initiative 2 Joint Initiative [מענק EUbOPEN 875510], Janssen, Merck KGaA (הידוע גם בשם EMD בקנדה ובארה"ב), פייזר וטקדה.

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bedford, M. T., Clarke, S. G. Protein arginine methylation in mammals: who, what, and why. Molecular Cell. 33 (1), 1-13 (2009).
  2. Blanc, R. S., Richard, S. Arginine methylation: The coming of age. Molecular Cell. 65 (1), 8-24 (2017).
  3. Wu, Q., Schapira, M., Arrowsmith, C. H., Barsyte-Lovejoy, D. Protein arginine methylation: from enigmatic functions to therapeutic targeting. Nature Reviews. Drug Discovery. 20 (7), 509-530 (2021).
  4. Hutchinson, A., Seitova, A. Production of recombinant PRMT proteins using the baculovirus expression vector system. Journal of Visualized Experiments. (173), e62510(2021).
  5. Dhar, S., et al. Loss of the major Type I arginine methyltransferase PRMT1 causes substrate scavenging by other PRMTs. Scientific Reports. 3, 1311(2013).
  6. Maniaci, M., Marini, F., Massignani, E., Bonaldi, T. A mass spectrometry-based proteomics approach for global and high-confidence protein R-methylation analysis. Journal of Visualized Experiments. (182), e62409(2022).
  7. Thandapani, P., O'Connor, T. R., Bailey, T. L., Richard, S. Defining the RGG/RG motif. Molecular Cell. 50 (5), 613-623 (2013).
  8. Habisch, H., Zhang, F., Zhou, Q., Madl, T. Exploring the arginine methylome by nuclear magnetic resonance spectroscopy. Journal of Visualized Experiments. (178), e63245(2021).
  9. Szewczyk, M. M., Vu, V., Barsyte-Lovejoy, D. Quantitative methods to study protein arginine methyltransferase 1-9 activity in cells. Journal of Visualized Experiments. (174), e62418(2021).
  10. Poulard, C., Jacquemetton, J., Valantin, J., Treilleux, I., Le Romancer, M. Proximity ligation assay allows the detection, localization, and quantification of protein arginine methylation in fixed tissue. Journal of Visualized Experiments. (185), e64294(2022).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Recombinant PRMT ProteinsBaculovirus Expression VectorMass SpectrometryProteomics ApproachProtein R methylation AnalysisArginine MethylomeNuclear Magnetic Resonance SpectroscopyProtein Arginine Methyltransferase ActivityProximity Ligation AssayProtein DetectionTissue Quantification

מאמרים קשורים