הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

כימות בזמן אמת של ההשפעות של TnpB הקשור למשפחת IS200/IS605 על פעילות טרנספוזון

2.4K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/64825

⸱

20 בינואר 2023

 ,  , 
1Department of Physics and Astronomy, University of California, 2Microbiology Program, University of California, 3Biophysics Program, University of California

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול מתואר לביצוע הדמיה חיה בזמן אמת כדי לכמת כיצד חלבון האביזר TnpB משפיע על הדינמיקה של טרנספוזיציה בתאי Escherichia coli חיים בודדים.

תקציר

כאן, מתווה פרוטוקול לביצוע הדמיה חיה בזמן אמת של פעילות אלמנטים הניתנים להעברה בתאי חיידקים חיים באמצעות חבילה של כתבים פלואורסצנטיים המצומדים לטרנספוזיציה. בפרט, הוא מדגים כיצד ניתן להשתמש בהדמיה בזמן אמת כדי להעריך את ההשפעות של חלבון האביזר TnpB על הפעילות של האלמנט הניתן להעברה IS608, חבר במשפחת IS200/IS605 של אלמנטים הניתנים להעברה. משפחת IS200/IS605 של יסודות הניתנים להעברה הם שפע של יסודות ניידים המחוברים לאחד הגנים הרבים ביותר שנמצאו בטבע, tnpB. הומולוגיות של רצף מציעות כי חלבון TnpB עשוי להיות קודמן אבולוציוני למערכות CRISPR/Cas9. בנוסף, TnpB זכה להתעניינות מחודשת, לאחר שהוכח כי הוא פועל כאנדונוקלאז דנ"א מונחה RNA דמוי Cas. ההשפעות של TnpB על שיעורי הטרנספוזיציה של IS608 ניתנות לכימות, והוכח כי הביטוי של TnpB של IS608 גורם לפעילות טרנספוזון מוגברת של ~5x בהשוואה לתאים ללא ביטוי TnpB.

מבוא

אלמנטים הניתנים להעברה (TEs) הם אלמנטים גנטיים המתגייסים בתוך הגנום המארח שלהם על ידי כריתה או זירוז העתקה ואחריה שילוב מחדש של גנום. TEs קיימים בכל תחומי החיים, והטרנספוזיציה בונה מחדש את הגנום המארח, תוך מוטציה של אזורי קידוד ובקרה1. זה יוצר מוטציות ומגוון שממלאים תפקיד חשוב באבולוציה2,3, התפתחות 4,5, וכמה מחלות אנושיות6, כולל סרטן7.

באמצעות מבנים גנטיים חדשניים שמצמידים היבטים של פעילות טרנספוזיציונית לכתבים פלואורסצנטיים, העבודה הקודמת שלנו תיארה את הפיתוח של מערכת ניסיונית המבוססת על TE IS608 החיידקי, נציג של משפחת ה-TEs הנפוצה IS200/IS605, המאפשרת הדמיה בזמן אמת של טרנספוזיציה בתאים חיים בודדים8 (איור 1). מערכת TE מוצגת באיור 1A. ה- TE כולל את רצף קידוד הטרנספוזאז, tnpA, ולצדו קצה שמאלי (LE) וקצה ימין (RE) חזרות פלינדרומיות לא מושלמות (IP), שהן אתרי הזיהוי והכריתה עבור TnpA. tnpA מבוטא באמצעות מקדם PLTetO1, אשר מודחק על ידי מדכא tet והוא inducible עם anhydrotetracycline (aTc)9. ה- TE מפצל את הרצפים -10 ו- -35 של מקדם PlacIQ1 מכונן10 עבור הכתב הכחול mCerulean311. כפי שניתן לראות באיור 1C, כאשר הייצור של tnpA מושרה, ניתן לכרות את ה-TE, מה שמוביל לשיקום המקדם. התא המיוצר מבטא mCerulean3 ופלואורסצנטי כחול. N-terminus של TnpA מתמזג עם הכתב הצהוב ונוס12, ומאפשר מדידה של רמות TnpA על ידי פלואורסצנציה צהובה.

IS608 וחברים אחרים במשפחת הטרנספוזונים IS200/IS605 מקודדים בדרך כלל גם גן שני של הפונקציה הלא ידועה עד כה, tnpB13. חלבוני TnpB הם משפחה שופעת מאוד אך מאופיינת באופן לא מושלם של נוקלאזות המקודדות על ידי מספר TEs 14,15 חיידקי וארכאי, שלעתים קרובות מורכבים מ-tnpB16 בלבד. יתר על כן, מחקרים אחרונים חידשו את העניין ב-TnpB בכך שמצאו כי TnpB מתפקד כאנדונוקלאז מונחה RNA מונחה קריספר/Cas הניתן לתכנות אשר יניב הפסקות dsDNA או ssDNA בתנאים מגוונים17,18. עם זאת, עדיין לא ברור איזה תפקיד TnpB עשוי למלא בוויסות הטרנספוזיציה. כדי לבצע הדמיה בזמן אמת של ההשפעות של TnpB על טרנספוזיציה של IS608, נוצרה גרסה של הטרנספוזון, כולל אזור הקידוד של TnpB עם היתוך N-מסוף לחלבון הפלואורסצנטי האדום mCherry.

כהשלמה למחקרים מפורטים יותר ברמת תפזורת שבוצעו על ידי מעבדת Kuhlman19, הוא הראה כאן כיצד הדמיה בזמן אמת של פעילות טרנספוזון יכולה לחשוף באופן כמותי את ההשפעה של TnpB או כל חלבון עזר אחר על דינמיקה טרנספוזיציונית. על ידי מיזוג TnpB ל-mCherry, האירועים הטרנספוזיציוניים הבודדים מזוהים על ידי פלואורסצנציה כחולה ומתואמים עם רמות הביטוי של TnpA (פלואורסצנציה צהובה) ו- TnpB (פלואורסצנציה אדומה).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. הכנת תרביות חיידקים

  1. לגדל זן E. coli MG1655 עם מבנים טרנספוזונים פלסמידים (שתוארו בעבר ב- Kim et al.8) בן לילה ב- LB עם האנטיביוטיקה המתאימה (25 מיקרוגרם / מ"ל של קנאמיצין, ראה טבלת חומרים) ב 37 °C.
    הערה: הרצפים של המבנים המשמשים והרצפים הקשורים זמינים כמספרי ההצטרפות של GenBank20 OP581959, OP581957, OP581958, OP717084 ו- OP717085.
  2. כדי להשיג צמיחה אקספוננציאלית במצב יציב, יש לדלל תרביות ≥100 פעמים לתוך המדיום M63 (100 mM KH 2 PO 4, 1 mM MgSO 4, 1.8 μM FeSO 4, 15 mM [NH 4]2SO 4, 0.5 מיקרוגרם/מ"ל תיאמין [ויטמין B1]) בתוספת מקור פחמן (0.5% w/v גלוקוז כאן) ואנטיביוטיקה מתאימה (ראו טבלת חומרים).
  3. לגדל תרביות ב 37 °C עד הצפיפות האופטית ב 600 ננומטר (OD600) מגיע ~ 0.2. התרבויות מוכנות לשימוש.

2. הכנת שקופיות

  1. הכינו שקופית על ידי הרתחת M63 עם 0.5% גלוקוז w/v ו-1.5% w/v agarose במיקרוגל כדי להמיס את האגרוז ולוודא שהוא מותך לחלוטין ומעורבב היטב.
  2. יש לתת לתערובת להתקרר ל~55°C לפני הוספת אנטיביוטיקה וגורמים מעוררים (25 מיקרוגרם/מ"ל קנאמיצין ו-10 ננוגרם/מיקרול אנהידרו-טטרציקלין [aTc], ראו טבלת חומרים).
  3. הנח שקופית מיקרוסקופ על שולחן העבודה. ערמו שתי שקופיות נוספות בניצב לראשון והניחו שקופית נוספת למעלה, במקביל לשקופית התחתונה. ודא שיש רווח השווה לעובי שקופית אחת בין השקופיות התחתונות והעליונות. פיפטה ~ 1 מ"ל של תערובת אגרוז M63 לתוך הפער הזה בין השקופיות לאט לאט כדי ליצור ריבוע ג'ל קטן.
  4. לאחר שהג'ל התמצק (~10-15 דקות), החלק את השקופית העליונה כדי להסיר אותו. גזרו את כרית האגרוז בעזרת סכין גילוח או סכין. ואז פיפטה 2.5 μL של התרבית (שלב 1.3) ולשים את כיסוי על גבי.
  5. אטמו את הרווח בין המגלשה למכסה באמצעות אפוקסי (ראו טבלת חומרים). תנו לאפוקסי להתייבש ולתאים להתיישב על כרית האגרוז למשך שעה אחת לפחות ב-37 מעלות צלזיוס.

3. מיקרוסקופיה פלואורסצנטית בהילוך מהיר

  1. הניחו את הדגימה המוכנה (שלב 1.3) על מיקרוסקופ פלואורסצנטי (ראו טבלת חומרים) בסביבה מחוממת ומתוחזקת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
    1. הגדר את זמני החשיפה המתאימים למצלמה המשמשת לרכישת תמונה. כוונן את עוצמת התאורה כדי למזער את הלבנת התמונות.
      הערה: זמן חשיפה של 2 שניות לכל אורך גל שימש במחקר הנוכחי.
    2. עבור כל אורך גל, מצא שדה ראייה (FOV) המכיל פלואורסצנטיות מינימלית. רכוש תמונות לשימוש במהלך הניתוח לחיסור רקע.
  2. הגדר פרוטוקול להשגת תמונות ברשת באורכי גל שונים ובמרווחי זמן קבועים.
    1. קידוד צילום בהילוך מהיר לפרוטוקול. הגדר את תדירות הרכישה למרווח הזמן הרצוי (20 דקות כאן) ואת משך הזמן הכולל לאורך הרצוי (24 שעות).
    2. קידוד אורכי גל מתאימים לפרוטוקול (בהתאם למבנה שבו נעשה שימוש).
      הערה: שיא העירור mCherry הוא ב-587 ננומטר ושיא הפליטה ב-610 ננומטר21; mVenus הוא ב 515 ננומטר ו 527 ננומטר12, בעוד mCerulean3 הוא ב 433 ננומטר ו 475 ננומטר11.
    3. הגדר את גודל הרשת כדי ללכוד בין המספר הרצוי של FOVs.
      הערה: הנתונים המייצגים המוצגים כאן השתמשו ב- 8 x 8 FOVs.

4. ניתוח תמונות

  1. בצע חיסור רקע בכל ערוץ צבע באמצעות תמונות הרקע המתאימות שנרכשו בשלב 3.1.2. עבור כל שלבי הניתוח, אנו משתמשים במודולים סטנדרטיים בפלטפורמת הקוד הפתוח פיג'י22 (ראה טבלת חומרים).
  2. הערך את האוכלוסייה הכוללת בכל נקודת זמן על-ידי ספיגת ערוץ mCerulean וחלוקת אזור הסף באזור התא הממוצע.
  3. כדי לספור את אירועי הכריתה הייחודיים, קח את נגזרת הזמן של ערוץ mCerulean3. בצע זאת על-ידי חיסור תמונות עוקבות בערוץ mCerulean3. אירועי הכריתה יזוהו בנגזרת הזמן כהבזק בהיר של פלואורסצנציה.
    1. סף את ערימת אירועי הכריתה כדי למנוע פלואורסצנטיות לא רצויה. שים לב שתהליך זה יסתום חלקים מהכריתות עצמן. כדי לתקן זאת, הרחיבו את התמונות כדי לשחזר את הכריתות לגודלן המקורי.
      הערה: ניתוחים באמצעות טכניקות דומות של ספיגה וניתוח תמונה יכולים להתבצע גם בערוצי הפלואורסצנציה האחרים (לדוגמה, קורלציה בין אירועי כריתה לבין רמות של טרנספוזאז TnpA [פלואורסצנציה של ונוס צהוב] ו- TnpB [פלואורסצנציה של mCherry אדום].

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

שיטה זו של הדמיה של פעילות טרנספוזון בתאים חיים על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, תוך תפוקה נמוכה יותר מאשר מדידות פלואורסצנטיות בתפזורת, מאפשרת הדמיה ישירה של פעילות טרנספוזון בתאים חיים בודדים. אירועי כריתה של טרנספוזון גורמים לבנייה מחדש של מקדם ה-mCerulean3 (איור 1), מה שמאפשר זיהוי של תאים שעוברים טרנספוזון על-ידי פלואורסצנציה כחולה בהירה (איור 2, TnpB+: סרט משלים 1 ו-TnpB-: סרט משלים 2).

נמצא כ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

השיטה הייחודית המוצגת כאן להדמיה בזמן אמת של פעילות אלמנטים הניתנים להעברה בתאים חיים היא בדיקה רגישה שיכולה לזהות ישירות טרנספוזיציה בתאים חיים ובזמן אמת ולתאם פעילות זו עם ביטוי של חלבונים נלווים. בעוד שהתפוקה נמוכה מכפי שניתן להשיג בשיטות בתפזורת, שיטה זו משיגה מדידות מפורטות של פעילות TE וביטוי חלבונים בתאים חיים בודדים.

ניתן להשתמש במגוון כלים וטכניקות כדי לגדל תאים ישירות במיקרוסקופ לצורך הדמיה בזמן אמת. השיטה המשמשת כאן של גידול תאים על רפידות agarose יש את היתרון של להיות מהיר, זול, וק...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים על היעדר ניגוד עניינים.

תודות

תמיכה כספית למחקר זה ניתנה על ידי קרנות סטארט-אפ מאוניברסיטת קליפורניה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
2 טון אפוקסי שקוףDevcon31345
אגרוזסיגמא-אולדריץ'5066
אמוניום גופרתיסיגמא-אולדריץ'AX1385-1
אנהידרוטטרציקלין הידרוכלורידסיגמא-אולדריץ'37919
ארגון לייזרMelles Griot35-IMA-840-015
קוביית מסנןכחולה כרומהלדוגמה: Z457/10X, em: ET485/30M
D(+)גלוקוזסיגמא-אולדריץ'G7021
מיקרוסקופ Eclipse Ti-Eניקון
ומגשי מילוי eppendorf eppendorf שהופסקו, נפח: 0.1 עד 10 ומיקרו; L, אורך: 3.4 ס"מ, 1.33 אינץ', PP (פוליפרופילן)Eppendorf North America Biotools22491504
קופסאות ומגשי מילוי eppendorf epTIPS, נפח: 50 עד 1000 ומיקרו; L, אורך: 7.1 ס"מ, 2.79 אינץ', PP (פוליפרופילן)Eppendorf North America Biotools22491555
ברזל סולפט Acs 500 גרםפישר סיינטיפיק706834
פיג'יפיג'י (imagej.net)
Fisher BioReagents מרק LB, מילר (מגורען)Fisher ScientificBP9723-2 
שקופית כיסוי זכוכיתפישר סיינטיפיק12-542B 
Kanamycin SulfateSigma-Aldrich1355006
מגנזיום גופרתי Cert AcFisher XXM63SP3KG
מיקרוסקופ מחמםWorld Precision Instruments96810-1
אשלגן פוספט MonobasicFisher Scientific17001H
ProScan III שלבקודם
קוביית מסנן אדומהכרומהלשעבר: ET560/40X, Em: ET645/75M
ספיר 561 LP שקופית1170412קוהרנטית
מיקרוסקופפישר סיינטיפיק125535B
תיאמין הידרוכלורידסיגמא-אולדריץ' (SIAL)T1270-100G
Ti-LU4 שיגור לייזרניקון
קוביית מסנן צהובכרומהלדוגמה: Z514/10X, EM: ET535/30M
קופסאות מדעי לייזר,

מקורות

  1. Cowley, M., Oakey, R. J. Transposable elements re-wire and fine-tune the transcriptome. PLoS Genetics. 9 (1), 1003234(2013).
  2. Schneider, D., Lenski, R. E. Dynamics of insertion sequence elements during experimental evolution of bacteria. Research in Microbiology. 155 (5), 319-327 (2004).
  3. Chao, L., Vargas, C., Spear, B. B., Cox, E. C. Transposable elements as mutator genes in evolution. Nature. 303 (5918), 633-635 (1983).
  4. Coufal, N. G., et al. L1 retrotransposition in human neural progenitor cells. Nature. 460 (7259), 1127-1131 (2009).
  5. Kano, H., et al. L1 retrotransposition occurs mainly in embryogenesis and creates somatic mosaicism. Genes & Development. 23 (11), 1303-1312 (2009).
  6. Belancio, V. P., Deininger, P. L., Roy-Engel, A. M. LINE dancing in the human genome: transposable elements and disease. Genome Medicine. 1 (10), 97(2009).
  7. Goodier, J. L. Retrotransposition in tumors and brains. Mobile DNA. 5, 11(2014).
  8. Kim, N. H., et al. Real-time transposable element activity in individual live cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (26), 7278-7283 (2016).
  9. Lutz, R., Bujard, H. Independent and tight regulation of transcriptional units in Escherichia coli via the LacR/O, the TetR/O and AraC/I1-I2 regulatory elements. Nucleic Acids Research. 25 (6), 1203-1210 (1997).
  10. Calos, M. P., Miller, J. H. The DNA sequence change resulting from the IQ1 mutation, which greatly increases promoter strength. Molecular and General Genetics MGG. 183 (3), 559-560 (1981).
  11. Markwardt, M. L., et al. An improved cerulean fluorescent protein with enhanced brightness and reduced reversible photoswitching. PLoS One. 6 (3), 17896(2011).
  12. Nagai, T., et al. A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications. Nature Biotechnology. 20 (1), 87-90 (2002).
  13. Kersulyte, D., et al. Transposable element ISHp608 of Helicobacter pylori: nonrandom geographic distribution, functional organization, and insertion specificity. Journal of Bacteriology. 184 (4), 992-1002 (2002).
  14. Shmakov, S., et al. Diversity and evolution of class 2 CRISPR-Cas systems. Nature Reviews Microbiology. 15 (3), 169-182 (2017).
  15. Bao, W., Jurka, J. Homologues of bacterial TnpB_IS605 are widespread in diverse eukaryotic transposable elements. Mobile DNA. 4 (1), 12(2013).
  16. Siguier, P., Gourbeyre, E., Chandler, M. Bacterial insertion sequences: their genomic impact and diversity. FEMS Microbiology Reviews. 38 (5), 865-891 (2014).
  17. Altae-Tran, H., et al. The widespread IS200/IS605 transposon family encodes diverse programmable RNA-guided endonucleases. Science. 374 (6563), 57-65 (2021).
  18. Karvelis, T., et al. Transposon-associated TnpB is a programmable RNA-guided DNA endonuclease. Nature. 599 (7886), 692-696 (2021).
  19. Kaur, D., Kuhlman, T. E. IS200/IS605 family-associated TnpB increases transposon activity and retention. bioRxiv. , (2022).
  20. Benson, D. A., et al. GenBank. Nucleic Acids Research. 41, Database issue 36-42 (2013).
  21. Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nature Biotechnology. 22 (12), 1567-1572 (2004).
  22. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  23. Ton-Hoang, B., et al. Single-Stranded DNA transposition is coupled to host replication. Cell. 142 (3), 398-408 (2010).
  24. Wang, P., et al. Robust growth of Escherichia coli. Current Biology. 20 (12), 1099-1103 (2010).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

TnpBmCerulean3
כימות בזמן אמת של ההשפעות של TnpB הקשור למשפחת IS200/IS605 על פעילות טרנספוזון
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.