הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

יצירה וטיפוח של אורגנואידים שמקורם בסרטן השחלות הסרוסי ברמה גבוהה

5.6K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/64878

⸱

6 בינואר 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Washington University in St. Louis, 2University of California San Francisco

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

אורגנואידים שמקורם בחולה (PDO) הם תרבית תלת ממדית (3D) שיכולה לחקות את סביבת הגידול במבחנה. בסרטן שחלות סרוסי בדרגה גבוהה, PDOs מייצגים מודל לחקר סמנים ביולוגיים וטיפולים חדשים.

תקציר

אורגנואידים הם מודלים תלת-ממדיים של גידולים דינמיים שניתן לגדל בהצלחה מרקמת גידול שחלה שמקורה במטופלת, מיימת או נוזל פלאורלי ולסייע בגילוי טיפולים חדשניים וסמנים ביולוגיים מנבאים לסרטן השחלות. מודלים אלה משחזרים הטרוגניות שבטית (clonal heterogeneity), את המיקרו-סביבה של הגידול (tumor microenvironment) ואת האינטראקציות בין תאים לתאים ולמטריצות תאים. בנוסף, הם הוכחו כמתאימים לגידול הראשוני מבחינה מורפולוגית, ציטולוגית, אימונוהיסטוכימית וגנטית. לפיכך, אורגנואידים מאפשרים מחקר על תאי הגידול ועל המיקרו-סביבה של הגידול והם עדיפים על קווי תאים. הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטות שונות ליצירת אורגנואידים של סרטן השחלות שמקורם במטופלות מגידולים, מיימת ודגימות נוזל פלאורלי עם שיעור הצלחה גבוה מ-97%. דגימות המטופל מופרדות לתרחיפים תאיים על ידי עיכול מכני ואנזימטי כאחד. לאחר מכן התאים מצופים באמצעות תמצית קרום מרתף (BME) ונתמכים במצע גדילה אופטימלי המכיל תוספים ספציפיים לגידול סרטן שחלות סרוסי בדרגה גבוהה (HGSOC). לאחר יצירת אורגנואידים ראשוניים, PDOs יכולים לקיים תרבית ארוכת טווח, כולל מעבר להרחבה לניסויים הבאים.

מבוא

בשנת 2021, כ-21,410 נשים בארה"ב אובחנו לאחרונה עם סרטן שחלות אפיתל, ו-12,940 נשים נפטרו ממחלה זו1. למרות התקדמות מספקת נעשו בניתוחים וכימותרפיה, מעל 70% מהחולים עם מחלה מתקדמת לפתח עמידות כימותרפית למות בתוך 5 שנים של אבחנה 2,3. לפיכך, יש צורך דחוף באסטרטגיות חדשות לטיפול במחלה קטלנית זו ובמודלים מייצגים ואמינים למחקר פרה-קליני.

קווי תאים סרטניים וקסנוגרפטים שמקורם במטופלות (PDX) שנוצרו מגידולים ראשוניים בשחלות הם המכשירים העיקריים המשמשים במחקר סרטן השחלות. יתרון מרכזי של קווי תאים סרטניים הוא ההתרחבות המהירה שלהם. עם זאת, התרבית המתמשכת שלהם גורמת לשינויים פנוטיפיים וגנוטיפיים הגורמים לקווי התאים הסרטניים לסטות מדגימת הגידול הסרטני הראשונית המקורית. בשל ההבדלים הקיימים בין קו התאים הסרטניים לבין הגידול הראשוני, בדיקות תרופות שיש להן השפעות חיוביות בשורות תאים אינן מצליחות להשיג את אותן השפעות בניסויים קליניים2. כדי להתגבר על מגבלות אלה, מודלים PDX משמשים. מודלים אלה נוצרים על ידי השתלת רקמת סרטן שחלה טרייה בעכברים מדוכאי חיסון. מכיוון שהם מודלים in vivo , הם דומים יותר למאפיינים ביולוגיים אנושיים, ובתורם, מנבאים יותר את תוצאות התרופות. עם זאת, למודלים אלה יש גם מגבלות משמעותיות, כולל העלות, הזמן והמשאבים הדרושים כדי לייצר אותם4.

PDOs מציעים מודל חלופי למחקר פרה-קליני המתגבר על המגבלות של קווי תאים סרטניים ומודלים של PDX. PDOs משחזרים את הגידול ואת המיקרו-סביבה של המטופל, ובכך מספקים מודל טרקטיבי במבחנה אידיאלי למחקר פרה-קליני 2,3,5. למודלים תלת-ממדיים אלה יש יכולות ארגון עצמי המדמים את הגידול הראשוני, תכונה שאין לעמיתיהם בקו התא הדו-ממדי (2D). יתר על כן, מודלים אלה הוכחו כמייצגים גנטית ותפקודית את גידולי האב שלהם, ולכן הם מודלים אמינים לחקר טיפולים חדשניים ותהליכים ביולוגיים. בקיצור, הם מציעים יכולות הרחבה ואחסון ארוכות טווח הדומות לקווי תאים, אך גם מקיפות את המיקרו-סביבה ואת אינטראקציות התא-תא הטבועות בדגמי עכברים 4,6.

הפרוטוקול הנוכחי מתאר את היצירה של PDOs מגידולים, מיימת ודגימות נוזל פלאורלי שמקורם במטופל עם שיעור הצלחה גבוה מ-97%. לאחר מכן ניתן להרחיב את תרביות ה-PDO למשך דורות רבים ולהשתמש בהן לבדיקת רגישות לטיפול תרופתי וסמנים ביולוגיים מנבאים. שיטה זו מייצגת טכניקה שניתן להשתמש בה כדי להתאים אישית טיפולים המבוססים על התגובות הטיפוליות של PDOs.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל דגימות הרקמה האנושית שנאספו למחקר התקבלו על פי פרוטוקול שאושר על ידי מועצת הביקורת המוסדית (IRB). הפרוטוקולים המתוארים להלן בוצעו בסביבת תרבית רקמה אנושית סטרילית. הסכמה מדעת בכתב התקבלה מנבדקים אנושיים. מטופלות זכאיות היו צריכות לקבל אבחנה או אבחנה משוערת של סרטן השחלות, להיות מוכנות ומסוגלות לחתום על הסכמה מדעת, ולהיות בנות 18 לפחות. רקמת הגידול (גידול ראשוני ממאיר או אתרים גרורתיים), מיימת ונוזל פלאורלי התקבלו מחולים בהסכמה בזמן ההליך. דגימות אלה הועברו מיד למעבדה ועובדו לייצור אורגנואידים בשיטות המתוארות להלן.

1. הכנת מדיה

  1. הכנת מדיה אורגנואידית מלאה
    1. הכינו מדיום מותנה R-spondin 1/Noggin בעקבות דו"ח שפורסם בעבר7.
      הערה: מדיום מותנה R-spondin-1/Noggin הוא חלופה זולה יותר לחלבונים רקומביננטיים הזמינים מסחרית. תאי HEK293T המפרישים ביציבות R-ספונדין-1 ונוגין באמצעות התמרה בתיווך לנטיוירוס היו מתנה נדיבה מרון בוס, בית הספר לרפואה של אוניברסיטת וושינגטון בסנט לואיס, ואניל רוסטגי, המרכז הרפואי אירווינג של אוניברסיטת ניו יורק-פרסביטריאן/קולומביה 8,9,10. מדיום מסחרי מותנה יכול לשמש כתחליף (ראה טבלת חומרים).
  2. כדי ליצור את מדיום האורגנואיד השלם, יש לשלב 10% R-spondin 1/Noggin מותנה בינוני, 50 ng/mL EGF, 10 ng/mL FGF-10, 10 ng/mL FGF2, 1x B27, 10 mmol / L nicotinamide, 1.25 mmol / L N-אצטיל-ציסטאין, 1 μmol / L פרוסטגלנדין E2, 10 μmol / L SB202190, 500 nmol / L A83-01 ומעכב ROCK 10 μM (ראה טבלת חומרים).
    הערה: ניתן לאחסן את המדיום בטמפרטורה של 4°C למשך עד 3 חודשים. מדיום זה הותאם מ-Hill et al.11. הריכוזים והמרכיבים של המדיום זהים, בתוספת מעכב ROCK.
  3. הכן בסיס אורגנואיד בינוני על ידי שילוב של 500 מ"ל של נוסחה מתקדמת של DMEM/F12 עם 1% פניצילין-סטרפטומיצין, 1x דיפפטיד, L-alanyl-L-גלוטמין, 1x HEPES (10 mM) (ראה טבלה של חומרים).

2. קצירת אורגנואידים מיימת ונוזל פלאורלי

הערה: מיימת ונוזל פלאורלי חייבים להיות מעובדים בהקדם האפשרי לקבלת התשואה הטובה ביותר של אורגנואידים. הפשרה השתמשה בעבר ב-BME, DNase I ובמאגר התגובה DNase I (ראו טבלת חומרים) על ידי הנחתו על קרח עד לנוזלי התכולה.

  1. יש להשיג מיימת ונוזל פלאורלי ממטופלים שהסכימו לכך בזמן ניתוחים או הליכים סטנדרטיים, ולשנע בטמפרטורת החדר במיכל נסיעות למעבדה.
    הערה: כל מיימת או עיבוד נוזל pleural צריך להתבצע בסביבה סטרילית.
  2. העברת 50 מ"ל של מיימת או נוזל pleural ל 50 מ"ל צינורות חרוטי (מספר צינורות תלוי בנפח מיימת המתקבל). צנטריפוגה ב-1,650 x גרם למשך 5 דקות ב-4°C. לאחר הצנטריפוגה, השתמש פיפטה פסטר זכוכית כדי לשאוף בזהירות את supernatant.
  3. המשך על ידי הוספת 50 מ"ל של מיימת או נוזל pleural לגלולה צנטריפוגה בעבר, וצנטריפוגה שוב ב 1,650 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. שאפו בזהירות את הסופרנטנט בעזרת פיפטה מזכוכית. חזור על שלב זה עד שכל מיימת או נוזל pleural עובדו.
  4. הכינו תמיסת DNase I של 100 מיקרוגרם/מ"ל על ידי שילוב של 1,000 מיקרוליטר מים נטולי נוקלאז, 100 מיקרוליטר של מאגר התגובה של DNase I ו-10 מיקרוליטר של DNase I.
    הערה: הטיפול ב- DNase I המיושם מספיק כדי לבצע השעיה של תא בודד ללא קשר לנוכחות של צברי תאים בחלק מדגימות החולים12.
  5. השהה מחדש כל כדור תא ב- 1 מ"ל של תמיסת DNase I של 100 מיקרוגרם/מ"ל. הוסיפו בעדינות את תמיסת DNase I טיפתית, ואפשרו לצינורית לדגור במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
    הערה: הוסף לפחות 1 מ"ל של תמיסת DNase I. אם 1 מ"ל אינו מספיק כדי להפריע לכדור, הוסף 1 מ"ל נוספים.
  6. לאחר הדגירה, מוסיפים 25 מ"ל של מדיום בסיס אורגנואיד (שלב 1.3) לתאים, והופכים בעדינות כדי לערבב. לאחר מכן, צנטריפוגה ב 1,650 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. לאחר הצנטריפוגה, שאפו בזהירות את הסופרנאטנט באמצעות פיפטה פסטר זכוכית.
  7. יש להשהות מחדש את כדורי התא החדשים שנוצרו ב-5 מ"ל שחוממו מראש של חיץ ליזה של 1x תאי דם אדומים (RBC) (ראו טבלת חומרים). הגדר את המערבולת ל 458 x g, ומערבל את התמיסות בכל צינור חרוט. ברגע שהתמיסות הומוגניות, השתמש בצינור סרולוגי כדי לשלב את התוכן של כל הצינורות החרוטיים לצינור חרוטי יחיד של 50 מ"ל.
  8. דוגרים על הצינור החרוטי המכיל את התמיסה המערבולת בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות. לאחר השלמת הדגירה, צנטריפוגה ב 1,650 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C.
    הערה: בדוק את הכדור. גלולה ורודה/אדומה מציינת את נוכחותם של RBCs, מה שידרוש חזרה על שלב חיץ הליזה של RBC עד שהגלולה כבר לא תהיה אדומה.
  9. לאחר הצנטריפוגה, שאפו בזהירות את הסופרנאטנט באמצעות פיפטה פסטר זכוכית. לאחר מכן, לשטוף את הגלולה עם 10 מ"ל של PBS, מערבל את התמיסה ב 458 x גרם, וצנטריפוגה ב 1,650 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C.
  10. אם נוצרת גלולת תא גדולה, שאפו את PBS באמצעות פיפטת פסטר זכוכית, והוסיפו 1 מ"ל של מדיום בסיס אורגנואיד (שלב 1.3) על גבי הכדורית. מערבלים את התמיסה ב 458 x גרם, ומעבירים 300-400 μL לצינור מיקרוצנטריפוגה. צנטריפוגה צינור microcentrifuge ב 1,650 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C.
    הערה: ניתן להקפיא את החלק של גלולת התא שאינו ממוקם בצינור המיקרוצנטריפוגה לשימוש עתידי (500 מיקרוליטר תאים עד 1 מ"ל של 10% DMSO ב- FBS). את גלולת התא הקפואה ניתן לאחסן במשך שבועות בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס ובמשך שנים אם מניחים אותה בחנקן נוזלי13.
  11. יש לשאוף בזהירות את מדיום בסיס האורגנואיד (שלב 1.3) באמצעות פיפטה מזכוכית, ולהשהות מחדש ב-BME (ראו טבלת חומרים) בעזרת קצוות קרים.
    הערה: כמות BME מבוססת על גודל הכדור. מומלץ להשתמש 25% בסיס אורגנואיד בינוני (שלב 1.3) עם תאים מרחפים ל 75% BME.
  12. צלחת 40 μL aliquots של תמיסת התא resuspended על צלחת 6 באר. צלחת עד חמישה aliquots לכל באר (איור 1).
  13. הניחו מיד את הצלחת באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות כדי לאפשר ל-BME להתמצק. לאחר הדגירה, מוסיפים בעדינות 2 מ"ל של מדיום אורגנואיד שלם (שלב 1.2) לכל באר.

ניסוי מעבדה באמצעות פיפטה בתחנת עבודה PCR להכנת ניתוח DNA.
איור 1: ציפוי אורגנואידים של סרטן השחלות שמקורם במטופלות. תמונה מייצגת של ציפוי האורגנואידים. Aliquots של תערובת אורגנואיד מצופים בקפידה, להבטיח לא בועות נוצרו. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

3. קצירת אורגנואידים מרקמה

הערה: יש לעבד רקמות בהקדם האפשרי לקבלת התשואה הטובה ביותר של אורגנואידים.

  1. לאסוף ולשנע את הגידול על קרח במיכל נסיעות המכיל PBS.
  2. הניחו את הדגימה על צלחת תרבית רקמה בקוטר 10 ס"מ (איור 2). בעזרת אזמל חד פעמי, טוחנים את הרקמה. לאחר מכן, באמצעות קצה עמום של מזרק חד פעמי, למחוץ את הרקמה עד תערובת הומוגנית נוצר.
  3. בעזרת מלקחיים, מניחים את תערובת הרקמה ההומוגנית לתוך צינור דיסוציאציה. עבור כל 1-2 מ"ל של רקמה הומוגנית, הוסף 7-8 מ"ל של תמיסת קולגנאז מסוג II של 1 מ"ג/מ"ל (ראה טבלת חומרים) בתווך בסיס אורגנואיד (שלב 1.3) ו-1 מ"ל של תמיסת DNase I. מערבולת את הפתרון ב 458 x גרם.
    הערה: כמות הרקמה תקבע את כמות תמיסת הקולגנאז ואת מספר הצינורות הדרושים.
  4. השתמש במכונת הדיסוציאציה (ראה טבלת חומרים) כדי לנזול את הרקמה בזמן שהיא בתמיסת הקולגנאז. הפעל את התוכנית 37C_h_TDK3 (1 שעות) עד שהיא תשעה של תא יחיד.
    הערה: יהיה צורך להפעיל מחדש את התוכנית אם התערובת המתקבלת אינה הומוגנית (כלומר, אם חתיכות רקמה עדיין קיימות בתערובת). אם הרקמה מתעכלת אך התמיסה צמיגה, מדללים באמצעות תווך בסיס אורגנואיד (שלב 1.3).
  5. מעבירים את התערובת ההומוגנית לצינור חרוטי חדש של 50 מ"ל, ומוסיפים 20-40 מ"ל של מדיום בסיס אורגנואיד (שלב 1.3). לאחר מכן, סנן את התמיסה דרך מסננת תאים של 100 מיקרומטר לתוך צינור חרוטי חדש של 50 מ"ל.
  6. צנטריפוגה את התערובת המסוננת ב 1,650 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. לאחר מכן, שאפו בזהירות את הסופרנאטנט באמצעות פיפטה מזכוכית.
  7. הכינו תמיסת DNase I של 100 מיקרוגרם/מ"ל על ידי שילוב של 1,000 מיקרוליטר מים נטולי נוקלאז, 100 מיקרוליטר של מאגר התגובה של DNase I ו-10 מיקרוליטר של DNase I.
    הערה: הטיפול ב- DNase I המיושם מספיק כדי לבצע השעיה של תא בודד ללא קשר לנוכחות של צברי תאים בחלק מדגימות החולים12.
  8. להשעות מחדש את התאים ב 1 מ"ל של 100 ug / mL DNase פתרון I. הוסיפו בעדינות את תמיסת DNase I טיפתית, ואפשרו לצינורית לדגור במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
  9. לאחר הדגירה, מוסיפים 25 מ"ל של מדיום בסיס אורגנואיד (שלב 1.3) לתאים, והופכים בעדינות כדי לערבב. לאחר מכן, צנטריפוגה ב 1,650 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. לאחר הצנטריפוגה, שאפו בזהירות את הסופרנאטנט באמצעות פיפטה פסטר זכוכית.
  10. השהה מחדש את גלולת התא החדשה שנוצרה ב -5 מ"ל של חיץ ליזיס 1x RBC שחומם מראש. מערבול את התמיסות בכל צינור חרוטי ב 458 x גרם.
  11. דגרו על הצינור החרוטי המכיל את גלולת התא התלויה מחדש במאגר הליזה של RBC למשך 5 דקות. לאחר השלמת הדגירה, צנטריפוגה ב 1,650 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C.
    הערה: בדוק את הכדור. גלולה ורודה/אדומה מציינת נוכחות של RBC, מה שיחייב חזרה על שלב חיץ הליזיס של RBC עד שהגלולה נראית לבנה.
  12. לאחר הצנטריפוגה, שאפו בזהירות את הסופרנאטנט באמצעות פיפטה פסטר זכוכית. לאחר מכן, לשטוף את הגלולה עם 10 מ"ל של PBS, מערבל את התמיסה ב 458 x גרם, וצנטריפוגה ב 1,650 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C.
  13. אם נוצרת גלולת תא גדולה, שאפו את PBS באמצעות פיפטת פסטר זכוכית, והוסיפו 1 מ"ל של מדיום בסיס אורגנואיד (שלב 1.3) על גבי הכדורית. מערבלים את התמיסה ב 458 x גרם, ומעבירים 300-400 μL לצינור מיקרוצנטריפוגה. צנטריפוגה ב-1,650 x גרם למשך 5 דקות ב-4°C.
    הערה: ניתן להקפיא את החלק של גלולת התא שאינו ממוקם בצינור המיקרוצנטריפוגה לשימוש עתידי (500 מיקרוליטר תאים עד 1 מ"ל של 10% DMSO ב- FBS) (שלב 5.1). את גלולת התא הקפואה ניתן לאחסן במשך שבועות בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס ובמשך שנים אם מניחים אותה בחנקן נוזלי13.
  14. שאפו בזהירות את מדיום הבסיס האורגנואידי באמצעות פיפטה פסטר זכוכית, והשהו מחדש ב- BME באמצעות קצוות קרים.
    הערה: כמות BME מבוססת על גודל הכדור. מומלץ להוסיף 25% מדיום בסיס אורגנואיד (שלב 1.3) עם תאים מרחפים ל-75% BME.
  15. לוחית את תמיסת התא המרחף מחדש על צלחת 6 בארות ב 40 μL aliquots. צלחת עד חמישה aliquots לכל באר.
  16. מניחים מיד את צלחת הבאר באינקובטור למשך 20 דקות. לאחר הדגירה, מוסיפים בעדינות 2 מ"ל של מדיום אורגנואיד שלם (שלב 1.2) לכל באר.

תהליך תרבית תאים עם מצעי גידול, מיכלים ודגימות רקמה במערך מעבדה.
איור 2: רקמת הגידול לפני נתיחה. תמונה מייצגת של רקמת הגידול המתקבלת לייצור אורגנואידים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

4. מעבר של אורגנואידים

הערה: אם הדגימה היא חופפת, כל באר אורגנואידים יכולה לעבור מדי שבוע לשתי בארות חדשות.

  1. באמצעות פיפטה של 1 מ"ל, הוסף 1 מ"ל של מדיום בסיס אורגנואיד (שלב 1.3) לכל באר, ופיפטה את המדיה למעלה ולמטה ישירות על לשוניות האורגנואידים כדי לנתק אותה. לאסוף את כל המדיום המכיל את כדורי resuspended בצינור חרוטי 15 מ"ל.
  2. צנטריפוגה את הצינור החרוטי 15 מ"ל המכיל את התערובת ב 1,650 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. לאחר מכן, שאפו בזהירות את הסופרנאטנט באמצעות פיפטה מזכוכית.
  3. הוסף 1 מ"ל של אנזים רקומביננטי ללא מקור מן החי (ראה טבלת חומרים) לכדורית התא, מערבל את התמיסה ב 458 x גרם, ומעביר לצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל. אפשר לצינור לדגור במשך 15 דקות באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס.
  4. לאחר הדגירה, צנטריפוגה ב 1,650 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. לאחר מכן, שאפו בזהירות את הסופרנאטנט באמצעות פיפטה מזכוכית.
  5. השהה מחדש את הגלולה ב- BME.
    הערה: כמות BME מבוססת על גודל הכדור. מומלץ להוסיף 25% מדיה בסיסית אורגנואידית (שלב 1.3) עם תאים מרחפים ל-75% BME.
  6. צלחת את תמיסת התא resuspended לתוך צלחת 6 באר ב 40 μL aliquots. צלחת עד חמישה aliquots לכל באר. לאחר שכל aliquots כבר מצופה, מיד מניחים את צלחת הבאר באינקובטור במשך 20 דקות. לאחר הדגירה, מוסיפים בעדינות 2 מ"ל של מדיום אורגנואיד שלם (שלב 1.2) לכל באר.

5. הקפאה והפשרה של אורגנואידים

  1. הקפאת אורגנואידים
    1. התחל בשלבים 4.1-4.4.
    2. יש להשהות מחדש את כדורית התא ב-0.5-1 מ"ל של תרבית תאי התאוששות בהקפאה (ראו טבלת חומרים), ולהעביר 1 מ"ל לכל קריוביאלי.
    3. לאחר מכן, הניחו את הקריובלים במיכל מלא איזופרופנול בטמפרטורה של -80°C למשך עד שבועיים לפני העברתם למיכל חנקן נוזלי לאחסון לטווח ארוך13.
  2. הפשרת אורגנואידים
    1. הסר את הדגימות ממיכל החנקן הנוזלי, והפשיר באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס.
    2. לאחר ההפשרה, להעביר צינור חרוטי 15 מ"ל, צנטריפוגה ב 1,650 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. לאחר הצנטריפוגה, שאפו בזהירות את הסופרנאטנט באמצעות פיפטה פסטר זכוכית.
    3. השהה מחדש את הגלולה ב- BME.
      הערה: כמות BME מבוססת על גודל הכדור. מומלץ להוסיף 25% מדיה בסיסית אורגנואידית (שלב 1.3) עם תאים מרחפים ל-75% BME.
    4. לוחית את תמיסת התא המרחף מחדש על צלחת 6 בארות ב 40 μL aliquots. מניחים עד חמישה aliquots לכל באר.
    5. מניחים מיד את הצלחת באינקובטור למשך 20 דקות. לאחר הדגירה, להוסיף בעדינות 2 מ"ל של מדיום אורגנואיד מלא (שלב 1.2) לבארות.

6. הטבעה ויצירה של שקופיות משובצות פרפין קבועות פורמלין (FFPE) להערכת הרכב האורגנואידים

  1. לאחר גידול אורגנואידים במשך 10 ימים לפחות כדי להבטיח גודל נאות, להסיר את המדיום אורגנואיד מלא מן הבארות, ולהוסיף 1 מ"ל של 2% paraformaldehyde fixative (PFA). יש לדגור בטמפרטורת החדר למשך 5-10 דקות.
  2. לאחר הדגירה, לשטוף את aliquots אורגנואיד תרבית 3 פעמים במשך 5 דקות בכל פעם עם 1 מ"ל של PBS.
  3. מוציאים את PBS מכל באר, ומוסיפים 1 מ"ל של אגר חם 2% ב H2O נטול יונים. בעת הוספת האגר, הרימו את עלי האורגנואיד המתורבת מהצלחת באמצעות מרית.
    הערה: חשוב לא לתת לאגר להתקשות לפני הרמת האליציטוטים האורגנואידים המתורבתים.
    1. מניחים לאגר להתמצק בבאר בטמפרטורת החדר.
  4. בעזרת מרית קטנה, שחררו את האגר המוצק מהבאר, ואחסנו אותו בקלטת עד 48 שעות (ראו טבלת חומרים) בטמפרטורה של 4°C באתנול 70% עד לעיבוד14.
  5. הטמיעו את הדגימות בפרפין 15, חתכו את השקופיות לעובי של 5 מיקרומטר, וצבעו את השקופיות בצביעה של המטוקסילין ואאוזין (H&E, ראו טבלת חומרים) באמצעות פרוטוקול סטנדרטי15.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

כדי ליצור PDOs, הדגימות עוכלו באופן מכני ואנזימטי לתרחיפים חד-תאיים. התאים הושעו מחדש ב-BME ונוספו להם מדיה מהונדסת במיוחד (איור 3). אורגנואידים נוצרים בדרך כלל על פני מסגרת זמן של 10 ימים, שלאחריה הם מדגימים אורגנואידים נפרדים בתרבית (איור 4).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

סרטן השחלות קטלני ביותר בשל השלב המתקדם שלו באבחון, כמו גם ההתפתחות הנפוצה של עמידות לכימותרפיה. התקדמות רבה במחקר סרטן השחלות נעשתה על ידי שימוש בקווי תאים סרטניים ומודלים PDX; עם זאת, יש צורך ברור במודל ייצוגי יותר ובמחיר סביר יותר במבחנה . PDOs הוכיחו שהם מייצגים במדויק את ההטרוגניות של הגידול, את המיקרו-סביבה של הגידול ואת התכונות הגנומיות והשעתוק של הגידולים העיקריים שלהם, ולכן הם מודלים פרה-קליניים אידיאליים לגישות מחקר מגוונות, כגון יישום מודלים אורגנואידים בטיפול תרופתי16.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

אנו אסירי תודה על הדרכתו של רון בוס, MD, PhD, ועל עזרתה של ברברה בלאחוט, MD, בביסוס פרוטוקול זה. ברצוננו גם להודות לבית הספר לרפואה של אוניברסיטת וושינגטון במחלקה למיילדות וגינקולוגיה בסנט לואיס ולמחלקה לאונקולוגיה גינקולוגית, לתוכנית מלגות הדיקן של אוניברסיטת וושינגטון ולתוכנית לפיתוח מדעני פוריות על תמיכתם בפרויקט זה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
1% HEPESLife Technologies15630080
1% פניצילין-סטרפטומיציןFisher Scientific30002CI
1.5 מ"ל שפופרות אפנדורף Genesee Scientific14125
צלחת תרבית רקמות 10 ס"מ TPP93100
10 מ"ל פיפט
100 ומיקרו; m מסנן תאMidSci100ICS
15 מ"ל צינורות צנטריפוגהקורנינג430052
2 מ"ל CryovialSimport ScientificT301-2
2% Paraformaldehyde FixativeSigma-Aldrich
37 ° אמבט מים C NEST602052
3dGRO R-Spondin-1 תוסף מדיה ממוזגMillipore SigmaSCM104
6 צלחות בארTPP92006
70% אתנולסיגמא-אולדריץ'R31541GA
A83-01סיגמא-אולדריץ'SML0788
מתקדם DMEM/F12ThermoFisher12634028
אגרלמדא ביוטקC121
B-27טכנולוגיות חיים17504044
צנטריפוגה 
Cultrex סוג 2R& D Systems3533-010-02תמצית קרום מרתף
DNase Iניו אינגלנד ביו מעבדותM0303S
DNase I מאגר תגובהניו אינגלנד ביו מעבדותM0303S
EGFPeproTechAF-100-15
FBS Sigma-AldrichF2442
FGF-10PeproTech100-26
FGF2PeproTech100-18B
gentleMACS C TubesMiltenyi BioTech130-096-334
gentleMACS Octo Dissociator עם תנורי חימוםMiltenyi BioTech130-096-427אנו משתמשים בפרוטוקול היצרנים.
GlutaMAXLife Technologies35050061דיפפטיד, ערכת צביעה L-alanyl-L-גלוטמין
המטוקסילין ואאוזיןFisher ScientificNC1470670
שעוות פרפין HistoplastFisher Scientific22900700
מיקרוצנטריפוגה 
מיכל הקפאה של מר פרוסטיפישר סיינטיפיק07202363S
N-acetylcysteineSigma-AldrichA9165
ניקוטינמידסיגמא-אולדריץ'N0636
p1000 פיפטה עם טיפים 
p200 פיפטה עם טיפים 
פיפטות פסטר 9 אינץ'פישר סיינטיפיק1367820D
PBSפישר MT21031CM
מדעי בקר
פרוסטגלנדין E2R& D Systems2296
Puromycin ThermoFisherA1113802
Recombinant עכברים נוגיןPeproTech250-38
תרבית תאים לשחזור הקפאת תרבית תאים בינוניתInvitrogen12648010
מאגר ליזה של תאי דם אדומיםBioLegend420301
מעכב ROCK (Y-27632)R& D Systems1254/1
SB202190Sigma-AldrichS7076
T75 בקבוקMidSciTP90076
מכסה מנוע תרבית רקמות 
קלטת
TrypLE ExpressInvitrogen12604013אנזים רקומביננטי
מסוג II מסוג II CollagenaseLife Technologies17101015
Vortex
סרולוגיפיפטהטמעת רקמות

מקורות

  1. Bray, F., et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (6), 394-424 (2018).
  2. Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
  3. Pauli, C., et al. Personalized in vitro and in vivo cancer models to guide precision medicine. Cancer Discovery. 7 (5), 462-477 (2017).
  4. Fujii, E., Kato, A., Suzuki, M. Patient-derived xenograft (PDX) models: Characteristics and points to consider for the process of establishment. Journal of Toxicologic Pathology. 33 (3), 153-160 (2020).
  5. Yang, J., et al. Application of ovarian cancer organoids in precision medicine: Key challenges and current opportunities. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 701429(2021).
  6. Yang, H., et al. Patient-derived organoids: A promising model for personalized cancer treatment. Gastroenterology Report. 6 (4), 243-245 (2018).
  7. Karakasheva, T. A., et al. Generation and characterization of patient-derived head and neck, oral, and esophageal cancer organoids. Current Protocols in Stem Cell Biology. 53 (1), 109(2020).
  8. Madison, B. B., et al. Let-7 represses carcinogenesis and a stem cell phenotype in the intestine via regulation of Hmga2. PLoS Genetics. 11 (8), 1005408(2015).
  9. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  10. Murray, E., et al. HER2 and APC mutations promote altered crypt-villus morphology and marked hyperplasia in the intestinal epithelium. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 12 (3), 1105-1120 (2021).
  11. Hill, S. J., et al. Prediction of DNA repair inhibitor response in short-term patient-derived ovarian cancer organoids. Cancer Discovery. 8 (11), 1404-1421 (2018).
  12. Passarelli, M. C., et al. Leucyl-tRNA synthetase is a tumour suppressor in breast cancer and regulates codon-dependent translation dynamics. Nature Cell Biology. 24 (3), 307-315 (2022).
  13. Pleguezuelos-Manzano, C., et al. Establishment and culture of human intestinal organoids derived from adult stem cells. Current Protocols in Immunology. 130 (1), 106(2020).
  14. Stumm, M. M., et al. Validation of a postfixation tissue storage and transport medium to preserve histopathology and molecular pathology analyses (total and phosphoactivated proteins, and FISH). American Journal of Clinical Pathology. 137 (3), 429-436 (2012).
  15. Feldman, A. T., Wolfe, D. Tissue processing and hematoxylin and eosin staining. Methods in Molecular Biology. 1180, 31-43 (2014).
  16. Ooft, S. N., et al. Patient-derived organoids can predict response to chemotherapy in metastatic colorectal cancer patients. Science Translational Medicine. 11 (513), (2019).
  17. Aisenbrey, E. A., Murphy, W. L. Synthetic alternatives to Matrigel. Nature Reviews Materials. 5 (7), 539-551 (2020).
  18. Nanki, Y., et al. Patient-derived ovarian cancer organoids capture the genomic profiles of primary tumours applicable for drug sensitivity and resistance testing. Scientific Reports. 10, 12581(2020).
  19. Mead, B. E., et al. Screening for modulators of the cellular composition of gut epithelia via organoid models of intestinal stem cell differentiation. Nature Biomedical Engineering. 6 (4), 476-494 (2022).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

אורגנואידים של סרטן השחלהתרבית אורגנואידיםמיקרו-סביבה של גידולעיכול מכניעיכול אנזימטיתמצית ממבנה הבסיסמעבר אורגנואידיםשימור בהקפאהצביעת המטוקסילין-אוסין
יצירה וטיפוח של אורגנואידים שמקורם בסרטן השחלות הסרוסי ברמה גבוהה
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.