הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

מדידת קינטיקה של רקמת שומן in vivo בבני אדם באמצעות גישת תיוג דאוטריום (2שעות)

723 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/64883

⸱

21 ביולי 2023

 ,  ,  ,  ,  , 
1Pennington Biomedical Research Center, Louisiana State University System, 2University of California at Berkeley

במאמר זה

סיכום

מוצג כאן פרוטוקול למדידת קינטיקה של רקמת שומן in vivo בבני אדם בשיטת תיוג דאוטריום (2H).

תקציר

רקמת שומן לבנה היא איבר פלסטי מאוד הנחוץ לשמירה על הומאוסטזיס אנרגטי בכל הגוף. מסת רקמת השומן ושינויים במסת השומן או בפיזור מוסדרים על ידי שינויים בסינתזה ובפירוק (כלומר, תחלופה) של תאי שומן וטריאציל גליצרולים. עדויות מצביעות על כך שהאופן והגודל של התרחבות רקמת השומן התת עורית (כלומר, היפרטרופיה לעומת היפרפלזיה) ותחלופה יכולים להשפיע על הבריאות המטבולית, שכן אדיפוגנזה מעורבת בפתוגנזה של השמנת יתר ומחלות נלוות. למרות התפקיד הפוטנציאלי של תחלופת השומן בבריאות האדם, קיים חוסר ידע על הקינטיקה in vivo של תאי השומן. זה נובע, בין השאר, מקצב התחלופה האיטי של התאים ברקמת השומן והמורכבות המעשית של תיוג ישיר של קודמיהם המטבוליים in vivo. כאן, אנו מתארים שיטות למדידת קינטיקה ושיעורי תחלופה של שומן in vivo בבני אדם באמצעות צריכת מים המסומנים בדאוטריום (2H). השילוב של 2H בחלקי הדאוקסיריבונוקלאוטידים של ה- DNA בפרה-אדיפוציטים ואדיפוציטים מספק מדד מדויק להיווצרות תאים ומוות (תחלופת שומן). בסך הכל, זוהי גישה חדשנית למדידת קינטיקה של שומן in vivo ומייצגת סטייה מהותית מהערכות אחרות במבחנה .

מבוא

השמנת יתר היא מחלה המאופיינת בעודף רקמת שומן לבנה (AT) ומהווה גורם סיכון משמעותי להתפתחות סוכרת מסוג 2 ומחלות לב וכלי דם1. White AT הוא איבר פלסטי מאוד המאחסן אנרגיה בצורה של טריאציל גליצרולים (TGs) והוא חיוני להומאוסטזיס מטבולי2. White AT שומר על היכולת להתרחב, להפחית ולעצב מחדש במהלך הבגרות3, ומסת ה-AT נקבעת על ידי שינויים דינמיים בנפח השומן (באמצעות סינתזה ופירוק TG), היווצרות מתמשכת של אדיפוציטים באמצעות התפשטות והתמיינות של פרה-אדיפוציטים (כלומר, היפרפלזיה או אדיפוגנזה), ומוות תאי שומן4.

עדויות מצביעות על כך שיש קשר חשוב בין תחלופת AT תת עורית (למשל, היווצרות אדיפוציטים ומוות) לבין בריאות קרדיומטבולית 5,6,7,8, ותפקיד האדיפוגנזה בפתוגנזה של הפרעות הקשורות להשמנת יתר נותר שנוי במחלוקת4. עם זאת, מעט ידוע על תחלופת AT in vivo בבני אדם בשל קצב התחלופה האיטי של מרכיבי התא של ה-AT והמורכבות של תיוג ישיר של קודמיהם המטבוליים in vivo. בעוד ששיטות במבחנה סיפקו תובנה מסוימת, גישות אלה אינן מספקות הערכה מקיפה in vivo בסביבה הטבעית של ה-AT.

שיטה פותחה על ידי מעבדת הלרשטיין9 להערכת תחלופת AT in vivo באמצעות שילוב האיזוטופ היציב דאוטריום (2H) ממים כבדים (2H2O) לתוך ה-AT (איור 1)10. הפרוטוקול, שאומת בעכברים ובבני אדם, כולל הגברה ראשונית של 2H2O כדי להגביר את ההעשרה של 2H של מי הגוף, ולאחר מכן צריכה יומית מספקת כדי לשמור על ערכי העשרה יציבים וקרובים למישור. ה-2H מ-2H2O (כלומר, מים כבדים) משולב בחלק הדאוקסיריבוז (dR) של דאוקסיריבונוקלאוטידים ב-DNA של תאי שומן, והעשרת האיזוטופים נמדדת ב-DNA באמצעות ספקטרומטריית מסה ויישום ניתוח התפלגות איזוטופומר מסה (MIDA)9,10,11. לתיוג החלק של דאוקסיריבוז של דאוקסיריבונוקלאוטידים של פורין ב-DNA עם מבשרי איזוטופים יציבים יש מספר יתרונות על פני שיטות קודמות, כגון אלה שכללו תיוג עם חלקי בסיס נוקלאוטידים של פירימידין (למשל, מ-3H-thymidine או bromo-deoxyuridine). יש לציין כי השילוב האנדוגני של בסיסים, במיוחד עבור פירימידינים, אך לא dR, בשכפול DNA בלבל בעבר את הפרשנות של שילוב תווית12. בנוסף, שילוב של תווית איזוטופ יציב ב-dR אינו גורם לרעילות גנולוגית, בניגוד לשילוב של חומרים רדיואקטיביים או גנוטוקסיים כגון 3H (טריטיום) או ברומו-דאוקסיורידין. לכן, השימוש ארוך הטווח בטכניקה זו במודלים של בעלי חיים ובבני אדם הוא בטוח.

המדידה של סינתזת DNA עם תווית H2 מציינת את המעבר של תא דרך שלב ה-S של חלוקת התא ומזהה פרה-אדיפוציטים ואדיפוציטים חדשים שנוצרו (באמצעות התמיינות טרום-אדיפוציטים) או אדיפוגנזה13. תאים שעוברים תחלופה מהירה (למשל, מונוציטים) מחליפים את ה-DNA שלהם במהירות ומגיעים לרמה בהעשרה של 2H, ובכך מספקים התייחסות פנימית לבדיקה. היחס בין העשרת 2H של DNA מתאי שומן לזה של מונוציטים (תאי ייחוס) או מדידת הגוף המשולב 2H2O מאפשר לחשב את החלק של תאי השומן החדשים שסונתזו. כאן, פרוטוקול זה מתאר שיטות למדידת שיעורי תחלופת תאי שומן in vivo (adipogenesis) בבני אדם באמצעות פרוטוקול התיוג המטבולי 2H, כולל טכניקות מעודנות לטיהור האדיפוציטים באמצעות ברירה חיסונית שלילית ולהעשרת אוכלוסיית הקדם-אדיפוציטים14.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

מועצת הביקורת המוסדית של מרכז המחקר הביו-רפואי של פנינגטון (IRB) אישרה את כל ההליכים (#10039-PBRC), וכל הנבדקים האנושיים נתנו הסכמה מדעת בכתב.

1. שמונה שבועות 2שעות2תקופת תיוג O

  1. יש לתת מינויים של 70% או 99.9% מים עם תווית דאוטריום (2H2O) במיכלי פלסטיק סטריליים.
  2. הנחו את המשתתפים לשתות מנות של 35 מ"ל של 2H2O או 40 מ"ל מועשרות ב-99.9% של 2H2O מועשרות ב-70% שלוש פעמים ביום בשבוע 1 (תקופת ההתחלה) ולשתות שתי מנות של 35 מ"ל או 50 מ"ל, בהתאמה, ליום בשבועות 2-8.
    הערה: סחרחורת חולפת או ורטיגו הן תופעות הלוואי היחידות הידועות של צריכת 2H2O וקשורות לשינויים מהירים בזרימת המים בתפזורת, הנתפסים על ידי זקיקי השיער של האוזן הפנימית. לפיכך, הנחו את המשתתפים ליטול את המנות לפחות ~2 שעות זו מזו כדי למנוע התרחשות נדירה של סחרחורת חולפת או ורטיגו15. מאותה סיבה, אל תפצו על החמצת מנות על ידי הכפלת מנה אחת. מתן המינון כמתואר לעיל (בהפרש של ≥2 שעות) הופך את תופעת הלוואי הזו לנדירה ביותר בבני אדם (<1% מכמה מאות נבדקים).
  3. עקוב אחר התאימות לצריכת 2H2O באמצעות איסוף שתן כדי למדוד את ההעשרה של 2H במי הגוף וגם על ידי ההחזרה השבועית של הבקבוקונים הריקים לספירה.
    1. נקו את דגימות השתן באמצעות פחם פעיל ומסנן.
      1. הוסף 8 מ"ל שתן לצינור של 10 מ"ל עם 1 מ"ל פחם פעיל.
      2. הניחו את הדגימה על נדנדה למשך 10 דקות, וצנטריפוגה למשך 5 דקות בחום של 800 x גרם כך שהפחם יעבור לתחתית הצינור. סנן את הדגימה עם מסנן מזרק של 0.2 מיקרומטר.
    2. מדוד את העשרת 2H2O במי הגוף (שתן) על ידי ספקטרומטריית מסה ביחס איזוטופים (IRMS).
      הערה: ניתן לנתח העשרה של 2H2O בשיטות שונות, כולל כרומטוגרפיה של גז-ספקטרומטריית מסה16, מנתח יסודות המרה בטמפרטורה גבוהה (TC/EA) יחד עם IRMS17, ספקטרוסקופיה אינפרא אדום טבעת חלל (IRIS)18, או עם H/Device המחובר לספקטרומטר מסה (למשל, IRMS)19.
    3. השתמש בהעשרה הממוצעת של 2H2O שנמדדה בשתן במהלך תקופת התיוג של 8 שבועות כדי לחשב את החשיפה הקודמת 2H2O ואת החלק של תאי AT שסונתזו לאחרונה (ראה סעיף 7 וסעיף 8 להלן).

הערה: פרוטוקול התיוג 2H2O שומר על העשרה קרובה למישור 2H במי הגוף בטווח של 1.0%-2.5% למשך תקופת התיוג של 8 שבועות (איור 2)10.

2. אוספי ביופסיה של רקמת שומן מנבדקים אנושיים

  1. לאחר ניקוי העור בתמיסת פובידון-יוד, יש לבצע הרדמה מקומית (למשל, 2% לידוקאין/0.5% בופיבקאין), לבצע חתך של ~0.75 ס"מ בעור, ולאסוף ביופסיות AT תת עוריות באמצעות טכניקת שאיבת שומן במחט בתנאים סטריליים13.
  2. שקלו צינור סטרילי של 50 מ"ל המכיל 5 מ"ל של טמפרטורת החדר (RT) 1 מ' מאגר HEPES, pH 7.3. הנח מיד את ה-AT בצינור עם מאגר HEPES לעיבוד.
  3. שקלו את צינור ה-50 מ"ל המכיל את ה-AT, ורשמו את המשקל.

3. בידוד של אדיפוציטים מטוהרים

  1. הוסף תמיסת קולגנאז / HEPES מסוג 1 (2 מ"ג/מ"ל) ל-2 גרם/מ"ל AT.
  2. עכל את ה-AT על ידי דגירה באמבט מים עם ניעור (100 סל"ד) למשך שעה אחת ב-37 מעלות צלזיוס עד לקבלת תערובת הומוגנית עם כמה חתיכות גדולות ושלמות של AT.
  3. צנטריפוגה של הצינור ב-500 x g למשך 8 דקות ב-RT כדי להפריד בין האדיפוציטים לבין השבר הסטרומלי-וסקולרי (SVF).
  4. הסר בעדינות את שכבת השומן העליונה (אדיפוציטים), והעביר אותה לצינור נפרד. אל תשבש את הגלולה (SVF) בתחתית הצינור.
  5. כפי שתואר קודם לכן14, טהר את האדיפוציטים באמצעות הפרדת תאים אימונומגנטיים.
    הערה: שלב חשוב זה נעשה כדי "לנקות" את האדיפוציטים, שכן סוגי תאים אחרים עם תחלופת תאים מהירה, כולל תאים המטופואטיים, אנדותל ותאי גזע, עשויים להיצמד לתאים הצפים ולהשפיע על המדידות.
    1. הנח ~400 מיקרוליטר של אדיפוציטים לתוך צינור של 5 מ"ל לטיהור חיסוני שלילי.
    2. הוסף נוגדן חוסם FcR (100 מיקרוליטר/מ"ל).
    3. הוסף קוקטייל של נוגדנים ביוטיניליים כנגד סמנים של תאי אנדותל (CD31 אנטי-אנושי; 1:100), תאים המטופויאטיים (CD45 אנטי-אנושי; 1:400) ותאי גזע מזנכימליים (CD34 אנטי-אנושי; 1:100) לתמיסת השומן למשך 15 דקות ב-RT.
    4. הוסף קוקטייל בחירת ביוטין (100 מיקרוליטר/מ"ל) לתמיסת השומן, ערבב היטב ודגר במשך 15 דקות ב-RT עם הטיה/סיבוב עדין.
    5. מערבבים את הננו-חלקיקים המגנטיים על ידי פיפטינג למעלה ולמטה, מוסיפים את החלקיקים (50 מיקרוליטר/מ"ל) לתמיסת השומן, מערבבים היטב ודוגרים במשך 10 דקות ב-RT עם סיבוב עדין (10 סל"ד).
    6. הוסף מאגר PBS/2% FBS/1 mM EDTA לתמיסת השומן לנפח כולל של 1 מ"ל.
    7. הנח את הצינור במגנט ותן לו לשבת במשך 5 דקות.
    8. הרם את המגנט, ובתנועה רציפה אחת, הפוך את המגנט המכיל את הצינור, ושפך את התוכן לתוך צינור חדש של 5 מ"ל. אין להקיש על הצינור בזמן המזיגה. התאים המחוברים לנוגדנים נקשרים על ידי הננו-חלקיקים המגנטיים ומוסרים, בעוד שהשומנים המטוהרים חיסונית נשמרים.
    9. הקפיאו את האדיפוציטים המטוהרים בנוזל N2, ואחסנו אותם בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עד למיצוי ה-DNA.

4. בידוד של פרה-אדיפוציטים

  1. כדי לבודד אוכלוסייה מועשרת של פרה-אדיפוציטים, השתמש בפרוטוקול כדי לנצל את יכולתם להיצמד לפלסטיק לאחר תרבית קצרת טווח של SVF20.
  2. במכסה זרימה למינרית, השעו מחדש את גלולת ה-SVF ב-5 מ"ל של מאגר ליזה אריתרוציטים למשך 5-10 דקות ב-RT (מערבבים היטב), וצנטריפוגה ב-800 x גרם. הסר את הסופרנטנט והשהה מחדש את הגלולה ב-10% FBS באלפא (α)MEM.
  3. צלחת את התאים על צלחת תרבית פלסטיק למשך ~8-12 שעות בחממת תרבית רקמות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ועם אטמוספירה של 5% CO2 .
  4. לאחר ~8-12 שעות, שטפו בעדינות את התאים הלא נדבקים מצלחת התרבות עם PBS בתוך מכסה זרימה למינרית.
  5. לאחר שאיבת ה-PBS, הוסף 1-1.5 מ"ל של 0.25% טריפסין/1 מ"מ EDTA לצלחת התרבית כדי לנתק את התאים הדבקים (אוכלוסייה מועשרת של פרה-אדיפוציטים). מניחים את צלחת התרבות בחממה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך ~5-8 דקות כדי לסייע בהרמת התאים.
  6. הוסף 10% FBS / αMEM לצלחת, ושטוף את הצלחת היטב כדי לאסוף את כל התאים מהצלחת. העבירו את תמיסת התא לצינור של 15 מ"ל או 50 מ"ל, וצנטריפוגה בטמפרטורה של 800 x גרם למשך 8 דקות.
  7. הסר את הסופרנטנט, ואחסן את הכדור (קדם-אדיפוציטים) בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עד למיצוי ה-DNA.

5. בידוד מונוציטים בדם

הערה: המונוציטים מנותחים כדי לייצג אוכלוסיית תאים (כמעט) שהתהפכה לחלוטין, ומדידת ההעשרה של 2H במונוציטים יכולה לשמש כסמן ייחוס לחשיפה של 2H2O בכל פרט. לחלופין, ניתן למדוד את העשרת הגוף 2H2O ולהשתמש בה לחישוב החשיפה ל-2H2O.

  1. שאבו דם טרי ומלא מבני אדם לתוך שפופרות ואקוטיינר המכילות EDTA.
  2. צנטריפוגה בדם בטמפרטורה של 1,000-2,000 x גרם למשך 15 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
    הערה: אל תשתמש בבלם.
  3. הסר את שכבת הפלזמה העליונה. היזהר לא לגעת במעיל הבאפי הלבן ממש מתחת לפלזמה.
  4. שאפו את מעיל הבאפי הלבן בעזרת פיפטת העברה, והעבירו אותו לצינור של 50 מ"ל. הוסף ~10 מ"ל PBS למעיל ה-buffy.
  5. הוסף בעדינות 10 מ"ל של מדיום שיפוע צפיפות כדי לשכב את שכבת מעיל האפי.
    הערה: ודא שקצה הפיפטה נוגע בתחתית הצינור, והוצא בזהירות כך שתהיה שכבה ברורה של מדיום שיפוע צפיפות בתחתית. הימנע מהכנסת בועות.
  6. צנטריפוגה את הצינור ב-800 x גרם למשך 30 דקות כשהבלם כבוי.
  7. פיפטה החוצה (~10 מ"ל) מהשכבה הלבנה (שבר חד-גרעיני), תוך ביצוע תנועות מעגליות עם קצה פיפטת ההעברה קרוב לגבול אך לא נוגע בשכבה העליונה. מעבירים לצינור חדש של 50 מ"ל, ומוסיפים 10 מ"ל PBS. צנטריפוגה בטמפרטורה של 800 x גרם למשך 5 דקות (אל תשתמש בבלם), והשליך את הסופרנטנט.
  8. הוסף 5 מ"ל של מאגר ליזה אריתרוציטים לגלולה. מערבבים, ונותנים לזה לשבת 2 דקות ב-RT.
  9. הוסף 5 מ"ל של PBS עם 0.1% BSA לתמיסת המאגר/גלולה של אריתרוציטים, צנטריפוגה ב-800 x גרם למשך 5 דקות, והשליך את הסופרנטנט.
  10. בודד את המונוציטים כתאי CD14+ באמצעות חרוזים אימונו-מגנטיים. בצע את הבידוד של תאי CD14+ על-ידי ביצוע פרוטוקול היצרן.
  11. אחסן את המונוציטים המבודדים בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עד למיצוי ה-DNA.

6. הכנת DNA (בידוד, הידרוליזה ונגזרת)

  1. בודד את ה-DNA מהפרה-אדיפוציטים, האדיפוציטים והמונוציטים בדם באמצעות ערכת מיצוי DNA בהתאם להוראות היצרן.
  2. כדי לשחרר את הדאוקסיריבונוקלאוזידים, הידרוליזה אנזימטית של ה-DNA (~200 מיקרוליטר) למשך הלילה (לא יותר מ-24 שעות) ב-37 מעלות צלזיוס ב-50 מיקרוליטר של קוקטייל הידרוליזה של אנזים המכיל 1 מ"ל של נוקלאז S1, 1 מ"ל של אנזים פוספטאז ו-36.8 מ"ל של מאגר הידרוליזה פי 5 בצינורות זכוכית עם מכסה בורג בגודל 16 מ"מ x 100 מ"מ (10 מ"ל). בנוסף, כלול את הדגימות הבאות: ריק מים, ריק קוקטייל הידרוליזה, ריק עמודה מערכת מיצוי ה-DNA ו-500 ננוגרם של תקני DNA.
    1. כדי להכין את מאגר ההידרוליזה פי 5, הנח 94 מ"ל של מים טהורים בדרגת ביולוגיה מולקולרית לתוך סטרילית. שקלו 3.08 גרם נתרן אצטט ו-21.5 מ"ג אבץ גופרתי, הוסיפו מים וערבבו עד להמסה. התאם את ה-pH ל-5.0 עם חומצה אצטית קרחונית ובדוק באמצעות נייר pH. הוסף מים כדי להגיע לנפח כולל של 100 מ"ל.
    2. להכנת האנזים פוספטאז, יש להשעות בקבוקון של פוספטאז חומצה ב-1 מ"ל מים טהורים.
    3. כדי להכין את האנזים נוקלאז 0.5 U/μL S1, יש לדלל 2.5 מיקרוליטר של נוקלאז S1 ל-2 מ"ל של מאגר הידרוליזה 1x (הוסף 1 מ"ל של מאגר הידרוליזה פי 5 ל-4 מ"ל מים טהורים).
  3. נגזר את ההידרוליזטים לנגזרות פנטפלואורובנזיל הידרוקסילאמין (PFBHA). באופן ספציפי, הוסף את הדברים הבאים ישירות לדגימות ה-DNA המעוכלות, כולל התקנים והחסר, בצינורות מכסה בורג בגודל 16 מ"מ על 100 מ"מ (10 מ"ל): 100 מיקרוליטר של פנטפלואורובנזיל הידרוקסילאמין הידרוכלוריד (PFBHA; 1 מ"ג/מ"ל) ו-75 מיקרוליטר של חומצה אצטית קרחונית מערבולת (לזמן קצר), מכסים את הבקבוקונים ומניחים את דגימות ההידרוליזט על גוש חימום המוגדר ל-100 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
  4. הסר את הדגימות, ותן להן להתקרר במשך ~5 דקות ל-RT. לאחר הקירור, הוסף 2 מ"ל אנהידריד אצטי ו -100 מיקרוליטר של 1-מתילימידזול לכל צינור מתחת למכסה אדים. הנח את הצינורות על גוש חום של 100 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
  5. הסר את הדגימות ולאחר מכן הניח להן להתקרר במשך ~15-20 דקות. לאחר שהתקרר, הוסיפו 3 מ"ל מים בדרגת ביולוגיה מולקולרית לכל דגימה, מערבולת קצרה ותנו להם לשבת במשך 10 דקות.
  6. הוסף 2 מ"ל של דיכלורומתאן (DCM) לצינורות, ומערבל את הדגימות במרץ במשך 15 שניות כדי לחלץ את הנגזרת לשלב האורגני.
  7. צנטריפוגה ב-800 x גרם למשך 5 דקות להפרדת השלבים. העבירו בזהירות את שכבת הדיכלורומתאן התחתונה לבקבוקון GC נקי של 1.6 מ"ל.
    הערה: אל תעביר אף אחד מהפאזה המימית, מכיוון שהדבר יגדיל את הרקע.
  8. התאדה ליובש עם חנקן למשך ~20 דקות כדי להסיר את ה-DCM ושאריות החומצה האצטית, ולאחר מכן ייבוש ~ 10 דקות בוואקום מהיר ב-RT כדי להסיר את כל עקבות הריאגנטים.

7. ניתוח כרומטוגרפיה גזית-ספקטרומטריית מסה (GC-MS) של ה-DNA

  1. לאחר הייבוש, השעו מחדש את נגזרות ה-PFBHA ב-150 מיקרוליטר של אתיל אצטט ומכסה. לאחר מכן, נתח לשילוב של 2H ב-DNA במכשיר כרומטוגרפיית גז (GC)/ספקטרומטריית מסה (MS) המצויד בעמודת DB-225 באמצעות יינון כימי שלילי של מתאן ואיסוף היונים במצב ניטור יונים סלקטיבי ב-m/z 435, m/z 436 ו-m/z 437 (המייצגים את איזוטופומרי המסה M0, M1 ו-M2 ). בהתאמה). עקוב אחר הוראות היצרן עבור המכשיר בו נעשה שימוש.
    1. הגדר את תנאי ה-GC כדלקמן: עמודה: 30 מ' x 0.25 מ"מ קוטר פנימי x 0.25 מיקרומטר ציפוי פילם; כרומטוגרף: גז נושא הליום בזרימה קבועה של 1.0 מ"ל/דקה; זריקות פועמות ללא פיצול; טמפרטורת מזרק: 250 מעלות צלזיוס; קו העברה MS: 325 מעלות צלזיוס; תנאי תנור: טמפרטורה התחלתית 100 מעלות צלזיוס, החזק 2 דקות, רמפה ב-40 מעלות צלזיוס לדקה לטמפרטורה של 220 מעלות צלזיוס, החזק 7.5 דקות, רמפה שנייה ב-40 מעלות צלזיוס לדקה עד 320 מעלות צלזיוס, החזק למשך דקה. זמן הריצה הכולל הוא 16.0 דקות. זמני פליטת ה-dR האופייניים הם 10.5 דקות ו-10.8 דקות עבור הפסגה הראשונה והשנייה, בהתאמה.
    2. הגדר את תנאי MS כדלקמן: מקור יינון כימי שלילי מתאן עם זיהוי במצב ניטור יונים בודדים; יונים שנאספו עבור dR: m/z 435, m/z 436 ו-m/z 437 (המייצגים איזוטופומרים בעלי מסה M0, M1 ו-M2 , בהתאמה).
      הערה: סיליקון את תוחם הזכוכית הפתוח עם פקק קטן של צמר זכוכית סיליקון בחלק התחתון של התוחם. החלף את התוחם הזה לעתים קרובות (כל ~100 זריקות).
  2. חשב את יחסי שכיחות איזוטופומר המסה M1 בנגזרת dR הלא מועשרת (שפע טבעי) באופן הבא:
    יחס M1 = שפע M1/(סכום שפע M0, M1 ו-M2)
    לאחר מכן, הפחיתו את יחסי השפע הטבעי M1 מיחסי M1 ב-dR של הדגימות המסומנות כדי לחשב את ההעשרה (עודף שפע איזוטופים, או %EM1)21.
  3. למדוד את שפע האיזוטופומרים המסה של תקני ה-DNA הבסיסיים (הלא מועשרים) בו-זמנית על פני טווח של שפע יונים M0 המשתרעים על טווח שפע היונים M0 בדגימות שנותחו.
    הערה: שלב זה חיוני כדי לתקן את "רגישות השפע" של יחסי איזוטופים הנמדדים על ידי GC/MS22.
  4. בנה גרף של שפע היונים M0 הנמדד לעומת יחסי איזוטופומר המסה הנמדד M1 בתקנים הלא מסומנים כדי לקבוע את ריכוז הדגימה על העמודה המדויק ביותר עבור איזוטופומר המסה M1 (כלומר, היכן הוא הקרוב ביותר ליחס השפע הטבעי המחושב הידוע M1, או "הנקודה המתוקה"). יחס M1 עבור נגזרת dR לא מועשרת זו הוא 0.1669.
  5. הזרקו את דגימות הניסוי כך שיהיו קרובות ככל האפשר באזור שיא M0 ל"נקודה מתוקה" זו. השתמש ברגרסיה ריבועית של יחס M1 של התקנים הלא מועשרים לעומת שטח השיא של M0 כדי להעריך יחס M1 "שפע טבעי מותאם" עבור כל דגימה בריכוז ה-M0 הספציפי שלה. הפחיתו זאת מיחס M1 של דגימת תאי השומן כדי להניב את אחוז ההעשרה מעל השפע הטבעי, או %EM1 (איור 3)23.
  6. חשב את ההעשרה המקסימלית התיאורטית של M1 (EM1*) בתאי השומן באמצעות משוואות ניתוח התפלגות איזוטופומר מסה (MIDA)24 בהתבסס על החשיפה של הגוף 2H2O (נמדדת בשתן) המשולבת במהלך תקופה של 8 שבועות (איור 4) או העשרת מונוציטים שנמדדה ביניים (שלב 7.5).

8. חישוב שבר התאים המסונתזים החדשים, או adipogenesis in vivo

  1. חשב את חלק התאים החדשים (%), המהווה מדד לאדיפוגנזה in vivo או להיווצרות של פרה-אדיפוציטים או אדיפוציטים שסונתזו לאחרונה, באמצעות הנוסחה הבאה:
    חלק של תאים חדשים (%) = [(העשרה M1 בתאי הדגימה [שומן])/EM1* (העשרה מקסימלית תיאורטית M1 )] x 100
    הערה: *העשרה של 2H במונוציטים יכולה לשמש גם כמכנה המשוואה. מדידה זו במונוציטים מייצגת סמן תא ייחוס של החשיפה ל-2H2O בכל פרט וניתן להשתמש בה כדי לאשר את החישובים של העשרה מקסימלית תיאורטית של M1מערכי הגוף הנמדד 2H2O.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

פרוטוקול התיוג 2H2O (סעיף 1) שומר על העשרה קרובה למישור 2H במי הגוף בטווח של 1.0%-2.5% למשך תקופת התיוג של 8 שבועות10, כפי שמוצג באיור 2. מחקר קודם השתמש בפרוטוקול התיוג 2H2O כדי להעריך קינטיקה של שומן באמצעות שילוב של 2H ב-DNA של תאי שומן, כמפורט בסעיפים 2-8, ודיווח כי אדיפוגנזה in vivo (הן התפשטות קדם-אדיפוציטים והן היווצרות אדיפוציטים) הייתה גבוהה יותר בעצם הירך התת עורית (scFEM) בה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הערכות in vivo נחוצות כדי לספק ידע חדש על הדינמיקה של תחלופת AT לבנה ותפקידה בהשמנת יתר ומחלות מטבוליות קשורות, שכן הערכות חוץ גופיות אינן מקיפות את הסביבה הטבעית של ה-AT. למרות שהשימוש בתיארוך פחמן רדיואקטיבי רטרוספקטיבי להערכת דינמיקת השומן היה אינפורמטיבי 7,25, גישה זו אינה מתאימה ללכידת שינויים דינמיים במהלך מחקרי התערבות פרוספקטיביים. שיטת התיוג 2H אומתה לספק מדדים פיזיולוגיים של היווצרות ותחלופה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין ניגודי אינטרסים להצהיר עליהם.

תודות

המחברים מודים לליבת ספקטרומטריית המסה במרכז המחקר הביו-רפואי פנינגטון.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
1-methylimidazoleMilliporeSigma336092
2H2OSigma Aldrich
Acetic AnhydrideAldridge539996
ACK Lysing Buffer (מאגר ליזה אריתרוציטים)Quality Biological Inc (VWR)10128-802
Agilent 6890/5973 GC/MS Agilent
Anti-Human CD31 (PECAM-1) BiotinInvitrogen13-0319-82
אנטי אנושי CD34 ביוטיןInvitrogen13-0349-82
אנטי אנושי CD45BioLegend304004
תמיסת אנטיביוטיקה אנטי-פטרייתMilliporeSigmaA5955
קולגנאז סוג 1וורת'ינגטון ביוכימית תאגידLS004196
דאוקסיריבוז (2-דאוקסי די-ריבוז)MilliporeSigma31170
תחמוצת דאוטריוםMilliporeSigma756822
DB-225 עמודה (30 מ', 0.25 מ"מ, 0.25um)J& W Scientific122-2232
דיכלורומתאן (DCM)MilliporeSigma34856
תקן DNA (DNA של תימוס עגל)MilliporeSigmaD4764
Dneasy דם ורקמות ערכת (ערכת מיצוי DNA)Qiagen69504
Easy Sep ערכת ביוטין אנושיטכנולוגיות תאי גזע17663
EasySep Human CD14 בחירה חיובית טכנולוגיותתאי גזע18058C
אתיל אצטטפישרEX0241-1
פלקון 5 מ"ל מבחנה פוליסטירן תחתון עגולVWR60819-295
Ficoll-Paque PlusMilliporeSigmaGE17-1440-02
בקבוקוני GC (2 מ"ל)פישרC-4011-1W
מוסיף בקבוקון GCפישרC-4011-631; C-4012-530
חומצה אצטית קרחוניתפישרAC14893-0010
צינורות זכוכית (להידרוליזה)פישר14-959-35AA
מאגר HEPESThermoFisher15630080
Hyclone Water, כיתה ביולוגיה מולקולריתתומאס סיינטיפיקSH30538.02
MEM אלפאפישר סיינטיפיק32561-037
PFBHA (o-(2, 3, 4, 5, 6)-penatfluorobenzylhydroxylamin hydrochloride)MilliporeSigma194484
רצועות חיווי pHפישר987618
פוספטאזCalbiochem (VWR)80602-592
S1 nuclease (מ- Aspergillus oryzae)MilliporeSigmaN5661
נתרן גופרתיMilliporeSigma23913
קוקטייל

מקורות

  1. Cypess, A. M. Reassessing human adipose tissue. The New England Journal of Medicine. 386 (8), 768-779 (2022).
  2. Cinti, S. The adipose organ at a glance. Disease Models & Mechanisms. 5 (5), 588-594 (2012).
  3. Sethi, J. K., Vidal-Puig, A. J. Thematic review series: Adipocyte biology. Adipose tissue function and plasticity orchestrate nutritional adaptation. Journal of Lipid Research. 48 (6), 1253-1262 (2007).
  4. White, U., Ravussin, E. Dynamics of adipose tissue turnover in human metabolic health and disease. Diabetologia. 62 (1), 17-23 (2019).
  5. Danforth, E. Failure of adipocyte differentiation causes type II diabetes mellitus. Nature Genetics. 26 (1), 13(2000).
  6. Virtue, S., Vidal-Puig, A. Adipose tissue expandability, lipotoxicity and the metabolic syndrome--An allostatic perspective. Biochimica et Biophysica Acta. 1801 (3), 338-349 (2010).
  7. Arner, E., et al. Adipocyte turnover: relevance to human adipose tissue morphology. Diabetes. 59 (1), 105-109 (2010).
  8. Cinti, S., et al. Adipocyte death defines macrophage localization and function in adipose tissue of obese mice and humans. Journal of Lipid Research. 46 (11), 2347-2355 (2005).
  9. Busch, R., Neese, R. A., Awada, M., Hayes, G. M., Hellerstein, M. K. Measurement of cell proliferation by heavy water labeling. Nature Protocols. 2 (12), 3045-3057 (2007).
  10. Neese, R. A., et al. Measurement in vivo of proliferation rates of slow turnover cells by 2H2O labeling of the deoxyribose moiety of DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (24), 15345-15350 (2002).
  11. Strawford, A., Antelo, F., Christiansen, M., Hellerstein, M. K. Adipose tissue triglyceride turnover, de novo lipogenesis, and cell proliferation in humans measured with 2H2O. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 286 (4), E577-E588 (2004).
  12. Macallan, D. C., et al. Measurement of cell proliferation by labeling of DNA with stable isotope-labeled glucose: Studies in vitro, in animals, and in humans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (2), 708-713 (1998).
  13. White, U. A., Fitch, M. D., Beyl, R. A., Hellerstein, M. K., Ravussin, E. Differences in in vivo cellular kinetics in abdominal and femoral subcutaneous adipose tissue in women. Diabetes. 65 (6), 1642-1647 (2016).
  14. Tchoukalova, Y. D., et al. In vivo adipogenesis in rats measured by cell kinetics in adipocytes and plastic-adherent stroma-vascular cells in response to high-fat diet and thiazolidinedione. Diabetes. 61 (1), 137-144 (2012).
  15. Jones, P. J., Leatherdale, S. T. Stable isotopes in clinical research: Safety reaffirmed. Clinical Science. 80 (4), 277-280 (1991).
  16. Bacchus-Souffan, C., et al. Relationship between CD4 T cell turnover, cellular differentiation and HIV persistence during ART. PLoS Pathogens. 17 (1), e1009214(2021).
  17. Simonato, M., et al. Disaturated-phosphatidylcholine and surfactant protein-B turnover in human acute lung injury and in control patients. Respiratory Research. 12 (1), 36(2011).
  18. Tremoy, G., et al. Measurements of water vapor isotope ratios with wavelength-scanned cavity ring-down spectroscopy technology: New insights and important caveats for deuterium excess measurements in tropical areas in comparison with isotope-ratio mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 25 (23), 3469-3480 (2011).
  19. dos Santos, T. H. R., Zucchi, M. D., Lemaire, T. J., de Azevedo, A. E. G., Viola, D. N. A statistical analysis of IRMS and CRDS methods in isotopic ratios of H-2/H-1 and O-18/O-16 in water. Sn Applied Sciences. 1, 664(2019).
  20. Soleimani, M., Nadri, S. A protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse bone marrow. Nature Protocols. 4 (1), 102-106 (2009).
  21. Hellerstein, M. K., Neese, R. A. Mass isotopomer distribution analysis at eight years: theoretical, analytic, and experimental considerations. The American Journal of Physiology. 276 (6), E1146-E1170 (1999).
  22. Patterson, B. W., Zhao, G., Klein, S. Improved accuracy and precision of gas chromatography/mass spectrometry measurements for metabolic tracers. Metabolism. 47 (6), 706-712 (1998).
  23. Mazzarello, A. N., Fitch, M., Hellerstein, M. K., Chiorazzi, N. Measurement of leukemic B-cell growth kinetics in patients with chronic lymphocytic leukemia. Methods in Molecular Biology. 1881, 129-151 (2019).
  24. Hellerstein, M. K., Neese, R. A. Mass isotopomer distribution analysis: A technique for measuring biosynthesis and turnover of polymers. The American Journal of Physiology. 263, E988-E1001 (1992).
  25. Spalding, K. L., et al. Dynamics of fat cell turnover in humans. Nature. 453 (7196), 783-787 (2008).
  26. Allerton, T. D., et al. Exercise reduced the formation of new adipocytes in the adipose tissue of mice in vivo. PLoS One. 16 (1), e0244804(2021).
  27. White, U. A., Fitch, M. D., Beyl, R. A., Hellerstein, M. K., Ravussin, E. Association of in vivo adipose tissue cellular kinetics with markers of metabolic health in humans. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 102 (7), 2171-2178 (2017).
  28. White, U., Fitch, M. D., Beyl, R. A., Hellerstein, M. K., Ravussin, E. Adipose depot-specific effects of 16 weeks of pioglitazone on in vivo adipogenesis in women with obesity: A randomised controlled trial. Diabetologia. 64 (1), 159-167 (2021).
  29. Steele, R. Influences of glucose loading and of injected insulin on hepatic glucose output. Annals of the New York Academy of Sciences. 82, 420-430 (1959).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

B

מאמר זה פורסם

הסרטון יגיע בקרוב

צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.