מאמר שיטה

דיאלקטרופורזה הנגרמת על ידי אור לאפיון ההתנהגות החשמלית של תאי גזע מזנכימליים אנושיים

DOI:

10.3791/64909

⸱

16 ביוני 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemical and Biomolecular Engineering, Samueli School of Engineering, University of California, Irvine, 2Department of Biomedical Engineering, Samueli School of Engineering, University of California, Irvine, 3Department of Chemistry, School of Physical Sciences, University of California, Irvine, 4Sue & Bill Gross Stem Cell Research Center, University of California, Irvine

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מציגים דיאלקטרופורזה הנגרמת על ידי אור כגישה נטולת תוויות לאפיון קווי תאים הטרוגניים, במיוחד תאי גזע מזנכימליים אנושיים (hMSCs). מאמר זה מתאר פרוטוקול לשימוש ואופטימיזציה של התקן מיקרופלואידי עם שכבה פוטו-מוליכה כדי לאפיין את ההתנהגות החשמלית של hMSCs מבלי לשנות את מצבם הטבעי.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תאי גזע מזנכימליים אנושיים (hMSCs) מציעים מקור תאי שמקורו במטופל לביצוע מחקרים מכניסטיים של מחלות או למספר יישומים טיפוליים. הבנת תכונות hMSC, כגון התנהגותם החשמלית בשלבי הבשלה שונים, הפכה חשובה יותר בשנים האחרונות. דיאלקטרופורזה (DEP) היא שיטה שיכולה לתפעל תאים בשדה חשמלי לא אחיד, שבאמצעותו ניתן לקבל מידע על התכונות החשמליות של התאים, כגון קיבוליות קרום התא והיתריות. מצבים מסורתיים של DEP משתמשים באלקטרודות מתכת, כגון אלקטרודות תלת ממדיות, כדי לאפיין את תגובת התאים ל- DEP. במאמר זה אנו מציגים התקן מיקרופלואידי הבנוי משכבה פוטו-מוליכה המסוגלת לתמרן תאים באמצעות הקרנות אור הפועלות כמו אלקטרודות וירטואליות באתרן עם גיאומטריות הניתנות להתאמה בקלות. מוצג כאן פרוטוקול המדגים תופעה זו, הנקראת DEP המושרה לאור (LiDEP), לאפיון hMSCs. אנו מראים כי תגובות תאים המושרות על ידי LiDEP, הנמדדות כמהירויות תאים, יכולות להיות ממוטבות על ידי פרמטרים משתנים כגון מתח הכניסה, טווחי אורכי הגל של הקרנות האור ועוצמת מקור האור. בעתיד, אנו צופים כי פלטפורמה זו תוכל לסלול את הדרך לטכנולוגיות נטולות תוויות המבצעות אפיון בזמן אמת של אוכלוסיות הטרוגניות של hMSCs או קווי תאי גזע אחרים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תאי גזע מזנכימליים אנושיים (hMSCs) מוכרים בזכות תכונותיהם המדכאות את מערכת החיסון1, שהובילו לשימוש בהם בטיפולים לטיפול במגוון מחלות, כגון סוכרת מסוג II2, מחלת השתל לעומת המאכסן3 ומחלת כבד4. HMSCs הם הטרוגניים, המכילים תת-אוכלוסיות של תאים המתמיינים לאדיפוציטים, כונדרוציטים ואוסטאובלסטים. HMSCs נגזרים מרקמת שומן, רקמת חבל הטבור ומח עצם, ופוטנציאל ההתמיינות שלהם תלוי ברקמת המקור ובתהליך תרבית התאים המשמש5. לדוגמה, על פי מחקר של Sakaguchi et al., hMSCs שמקורם ברקמת השומן נוטים יותר להתמיין לאדיפוציטים, בעוד hMSCs שמקורם במח עצם נוטים יותר להתמיין לאוסטיאוציטים6. עם זאת, ההשפעה של מקור הרקמה של hMSCs על פוטנציאל ההתמיינות שלהם היא תופעה שעדיין צריכה להיות מובנת יותר. בנוסף, פוטנציאל הבידול המגוון של hMSCs תורם להטרוגניות הטבועה בהם ויוצר אתגרים ביישום hMSCs לטיפולים. ככזה, האפיון, כמו גם המיון, של קווי תאי גזע הטרוגניים הוא קריטי לפיתוח המבחנה והיישום הקליני של תאים אלה. ציטומטריית זרימה, טכניקת תקן הזהב לבחינת הבדלים בפנוטיפים תאיים, משתמשת באנטיגנים של פני התא ובצבעים פלואורסצנטיים כדי לסמן תאי מטרה ולאפיין אותם על סמך פיזור אור או מאפייני פלואורסצנטיות ספציפיים לתא 6,7,8. החסרונות של שיטה זו כוללים את הזמינות המוגבלת של סמנים ביולוגיים של אנטיגן פני התא, העלות הגבוהה של הציוד והתפעול, והעובדה שצביעת פני התא עלולה לפגוע בקרום התא ולהשפיע על יישומים טיפוליים 9,10,11. לכן, בחינת טכניקות חדשות לאפיון תאים מבלי לפגוע במצב הטבעי של קרום התא יכולה להועיל לביצועים הקליניים של טיפולי תאי גזע.

דיאלקטרופורזה (DEP), שיטה לאפיון תאים שאינה משתמשת בתוויות פני השטח, עומדת במוקד העבודה הנוכחית. DEP היא שיטה ללא תוויות או ללא צביעה המיושמת על פלטפורמות מיקרופלואידיות כדי לאפיין אוכלוסיות הטרוגניות של תאים בהתבסס על התכונות החשמליות שלהם. DEP משתמש בשדה חשמלי של זרם חילופין (AC) כתחליף לצביעה פלואורסצנטית (כלומר, שיטה מבוססת תווית)7. היתרונות האחרים של שימוש בהתקנים מיקרופלואידים מבוססי DEP לאפיון תאים כוללים שימוש בנפחים קטנים (מיקרוליטרים), זמן ניתוח מהיר, דרישות להכנת דגימת תאים מינימלית, סיכון מינימלי לזיהום דגימה, ייצור פסולת מינימלי ועלות נמוכה12,13. יתרון נוסף של DEP הוא ניטור בזמן אמת של תאים14,15,16. עבור DEP, תאים בתרחיף נחשפים לשדה חשמלי AC לא אחיד שנוצר באמצעות אלקטרודות, והם הופכים מקוטבים6. קיטוב זה גורם לתנועת התא ומאפשר מניפולציה של התא בהתבסס על התדר והמתח של השדה החשמלי AC המופעל. על ידי התאמת התדר, בדרך כלל בין 5 קילוהרץ ל -20 מגה הרץ, תאים יכולים להימשך או להדוף את האלקטרודות, בהתאם להתנהגות DEP חיובית ושלילית, בהתאמה6.

ישנם מספר מצבים של אפיון DEP, כלומר, מסורתי, שבר זרימת שדה, ומושרה אור, כפי שסווג על ידי תצורת האלקטרודות שלהם ו / או אסטרטגיה תפעולית17. מנתח 3DEP, מצב מסורתי של DEP, משלב אלקטרודות מתכת פיזיות ומנטר את התגובה התאית לשדה חשמלי AC. מערכת זו משתמשת בשבב המורכב ממיקרו-בארות עם אלקטרודות מעגליות תלת ממדיות מרובות ומזהה שינויים בעוצמות האור כדי לאפיין התנהגות DEP של התא 18,19,20,21. DEP חיובי נצפה כאשר התאים נעים לעבר הקצוות של אלקטרודות עגולות לאורך הדפנות של microwell, וכתוצאה מכך עוצמת האור מוגברת במרכז microwell. DEP שלילי נצפה כאשר תאים מתקבצים במרכז המיקרו-באר הרחק מהאלקטרודות המעגליות, וכתוצאה מכך עוצמת האור יורדת במרכז המיקרו-באר. שתי התופעות האלה מיוצגות באיור 1. לשיטות DEP מסורתיות יש את היכולת לאפיין את התכונות החשמליות של אוכלוסיות תאים הטרוגניות 18,20,21. לדוגמה, Mulhall et al. הדגימו את הפוטנציאל להבחין בין קרטינוציטים אוראליים נורמליים (HOK) לבין קווי תאים של קרטינוציטים אוראליים ממאירים (H357) בהתבסס על הבדלים בקיבול הממברנה21 באמצעות אנלייזר 3DEP. עם זאת, מגבלה אחת של מצבים מסורתיים של DEP היא גאומטריית האלקטרודות הקבועות. מכיוון ש-hMSCs הם הטרוגניים, יש יתרון ליכולת לשנות בקלות את הגיאומטריות של האלקטרודות במהלך הערכות DEP. לדוגמה, היכולת לשנות את מערכי האלקטרודות או האלקטרודות בזמן אמת לצורך לכידה של תא בודד מאפשרת לאפיין את התאים בהתבסס על מהירות והתנהגות DEP. היישום של שינוי אלקטרודות בזמן אמת בהערכות DEP של hMSCs מאפשר ניתוח חד-תאי של hMSCs מיד לאחר מיקורם מרקמת הדגימה כדי לאפיין את ההטרוגניות של אוכלוסיית המדגם.

כדי להתגבר על המגבלה של מצבים מסורתיים של DEP (כלומר, אלקטרודות פיזיות קבועות) ולחקור הזדמנויות חדשות לשינויים בתצורת אלקטרודות בזמן אמת באמצעות תופעת DEP, DEP המושרה על ידי אור (LiDEP) נחקר. LiDEP הוא מצב לא מסורתי של DEP המפעיל תאים באמצעות התקן מיקרופלואידי מוליך22,23 באמצעות הקרנות אור, אלקטרודות מקומיות יוצרות שדה חשמלי לא אחיד, בדומה לשיטת DEP המסורתית. גישה זו מאפשרת גם גמישות בגיאומטריית האלקטרודות ובהנעת האלקטרודות בתוך המכשיר המיקרופלואידי. זה מקל על המגבלה שנראית עם אלקטרודות קבועות ומספק הזדמנות לקבל מידע נוסף על הטרוגניות תאית. LiDEP שימש לזיהוי וניתוח סוגי תאים שונים באוכלוסיות הומוגניות והטרוגניות של תאים22,23,24. לדוגמה, Liao et al. השתמשו ב- LiDEP כדי להפריד תאי גידול במחזור הדם (CTCs) המבטאים את מודול היצמדות תאי אפיתל (EpCAMneg) מתאי דם אדומים כדי לחקור את משמעותם בגרורות סרטניות22. אנליזה של תא בודד עם LiDEP שימשה בהצלחה לאפיון ומניפולציה של תאים סרטניים עם ריבוד גידולי הלבלב23 וניתוח CTCs בדגימות לפני ואחרי גרורות24.

במאמר זה אנו מתארים כיצד ניתן להשתמש ב-LiDEP כדי לתפעל hMSCs במגוון גיאומטריות אלקטרודות (מעגל, יהלום, כוכב וקווים מקבילים) והגדרות מערכת (מתח מופעל, עוצמת אור וחומר התקן מיקרופלואידי), ובכך מציעים גישה לאפיון ההתנהגות של תאי גזע שמקורם בבני אדם באמצעות אלקטרודות וירטואליות.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. ייצור מכשיר מיקרופלואידי LiDEP

הערה: תהליך הייצור מורכב משילוב של שלוש שכבות: (i) שכבה פוטו-מוליכה עם סיליקון אמורפי (A:Si) ומוליבדן המושקעים על מצע זכוכית אינדיום בדיל אוקסיד (ITO); (2) שכבה מיקרו-ערוצית שנחתכה מסרט דו-צדדי; ו-(iii) מצע זכוכית ITO עליון עם חורים שנקדחו עבור הכניסה והיציאה של מתלה התא.

  1. ציפוי זכוכית של תחמוצת בדיל אינדיום פוטו-מוליך (ITO)
    1. נקו את מצע הזכוכית המצופה ITO (התנגדות של 15-20 Ω) על ידי הזרמת גז חנקן (N2) על פני השטח בקצב זרימה המספיק כדי להזיז חלקיקי אבק נראים לעין. לאחר שלב זה, לשטוף את המצע עם אצטון.
    2. מעבירים את מגלשת הזכוכית המצופה ITO לאמבט אלכוהול איזופרופיל כדי לשטוף את שאריות האצטון, שוטפים במי DI ומזרימים שוב גז N2 עד שהמצע יבש לחלוטין.
    3. הניחו את מגלשת הזכוכית עם הצד המצופה ITO כלפי מעלה לתוך מערכת הגמגום בוואקום.
    4. יש לפזר שכבה בעובי 10 ננומטר של מוליבדן על מצע זכוכית מצופה ITO (יעד מוליבדן) עם קצב שיקוע של 0.7 Å/s וזמן שיקוע של 140 שניות.
    5. הוסיפו מסיכת צל לצד אחד של מצע הזכוכית כדי להשאיר 2 מ"מ מקצה מצע הזכוכית חשוף לחיבורי חשמל. הפקדה של 1 מיקרומטר של A:Si באמצעות תצהיר אדים כימי משופר פלזמה מצומדת אינדוקטיבית (ICP-PECVD), כמתואר ב- Medjdoub et al.25.
    6. נקה את המגלשה עם גז N2 כדי להסיר אבק וזיהומים אחרים. עבור כל A:Si שהושקע מתחת למסיכת הצל, שקעו את הקצה עד לסימן 2 מ"מ בתמיסת אשלגן הידרוקסיד של 25% w/v כדי לחרוט את A:Si.
  2. ייצור התקן שבב LiDEP
    1. כדי ליצור את המיקרו-ערוץ, השג סרט דו-צדדי (52 מ"מ x 25 מ"מ), וחורי ניקוב (קוטר = 4 מ"מ) במרחק 5-6 מ"מ מקצה הממד הקצר יותר וממורכז בין הצדדים הארוכים יותר של הקלטת. השתמש באזמל כדי לחתוך שני קווים ישרים (3 מ"מ זה מזה) על פני החורים. ודא שגיליונות המגן בשני הפנים של הסרט הדו-צדדי מופעלים במהלך כל שלב חיתוך המיקרו-ערוץ.
    2. קדח שני חורים בקוטר 3 מ"מ במגלשת זכוכית ITO העליונה. ניתן ליישר את הסרט על גבי הזכוכית המצופה ITO, כאשר הקצה הארוך של הסרט מיושר עם הקצה הארוך של הזכוכית. סמן את מיקום החור בטוש רחיץ. ודא שהחורים שנקדחו מתיישרים עם החורים המנוקבים בסרט הדו-צדדי. שני חורים אלה ישמשו כחורי הכניסה והיציאה של המכשיר המיקרופלואידי.
    3. הסר צד אחד של סרט המגן על הסרט הדו-צדדי, ישר את החורים בקלטת ואת שקופית זכוכית ITO העליונה ולחץ אותם יחד. לחץ בעדינות כדי להסיר כיסי אוויר, במיוחד ליד המיקרו-ערוץ. כיסי אוויר עשויים לאפשר לתמיסות המדיום או אחרות לחלחל מתחת לסרט הדבק, מה שעלול לפגוע או לגרום לעובש במכשיר המיקרופלואידי.
    4. הסר את סרט המגן השני מהסרט הדו-צדדי, ולחץ על צד המוליבדן וזכוכית ITO מצופה A:Si. התאם את קצה השקופית הפוטו-מוליכה המנוגדת לצד מרווח 2 מ"מ לקצה הסרט הדו-צדדי שנמצא לכיוון מרכז שקופית זכוכית ITO העליונה. יהיה הנגאובר ממגלשת הזכוכית העליונה של ITO וממגלשת זכוכית ITO מצופה חומר פוטו-מוליך.
    5. לחץ על משטח ישר כדי להבטיח הדבקה טובה. תרשים של מצע הזכוכית ושכבות הסרט הדו-צדדי מתואר באיור 1A. חותכים את עודפי הסרט בצד.
    6. החל סרט נחושת על הקצוות של שכבה A ושכבה C כדי לחבר את מחולל הפונקציות. עשו זאת על ידי עטיפת הסרט בצד של ITO או חומר פוטו-מוליך, תלוי אם מדובר בשכבה A או שכבה C, מקצה הסרט הדו-צדדי ועד כ-3 ס"מ על הצד הלא מצופה של מצע הזכוכית.
    7. כדי להבטיח ייצור מוצלח של המכשיר, השתמש במולטימטר כדי לבדוק קריאת התנגדות בין השקופיות המצופות של שני מצעי הזכוכית לבין סרט הנחושת שהוצמד לזכוכית.
  3. הכנת מאגר DEP
    1. למדוד החוצה 4.25 גרם של סוכרוז, ומניחים אותו לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל. לאחר מכן, למדוד החוצה 0.15 גרם של גלוקוז, ומניחים אותו לתוך אותו צינור חרוטי 50 מ"ל.
    2. ממלאים את הצינור החרוטי ב-25 מ"ל מים טהורים במיוחד, סוגרים את המכסה ומערבבים. לאחר כמחצית סוכרוז גלוקוז התמוססו, למלא את הצינור החרוטי עם מים טהורים עד קו 50 מ"ל. מערבבים במרץ עד שכל הסוכרוז והגלוקוז מומסים. תמיסת חיץ DEP מכילה 8.5% (w/v) סוכרוז ו-0.3% (w/v) גלוקוז.
    3. להשיג 20 מ"ל של סוכרוז מוכן פתרון גלוקוז, ומניחים אותו לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל. לאחר מכן, מדדו 0.1 גרם אלבומין בסרום בקר (BSA), והכניסו אותו לצינור החרוטי של 50 מ"ל המכיל את תמיסת הסוכרוז והגלוקוז. מערבולת עד המסת ה- BSA. פתרון מאגר DEP הסופי מכיל 0.5% (w/v) BSA.
  4. הכנת תאים
    1. להשיג לפחות 1 x 106 תאים (hMSCs או HEK 293) מושעה 1 מ"ל של מדיום גידול באמצעות פרוטוקול תרבית תאים שתואר במחקרים קודמים26,27. הכניסו את מתלה התא לצינור צנטריפוגה בנפח 10 מ"ל.
    2. צנטריפוגה את תאי HEK 293 ב 201 x גרם במשך 5 דקות ואת hMSCs ב 290 x גרם במשך 10 דקות. לאחר הצנטריפוגה, שאפו את הסופרנטנט, והשעו מחדש את התאים ב -1 מ"ל של תמיסת חיץ DEP עם 0.5% BSA. הקפד לא להוסיף את תמיסת החיץ מהר מדי מכיוון שעלולות להיווצר בועות.
    3. חזור על תהליך הצנטריפוגה פעמיים נוספות, ולאחר מכן השעה מחדש את התאים במאגר DEP עם 0.5% BSA לאפיון LiDEP. פרוטוקול הכנת התא הרשום מספיק ל -10 ריצות. לדוגמה, בדיקת תדר אחת דורשת לפחות 15 ריצות, ולכן יש לבצע 2 מ"ל תאים בריכוז של 1 x 106 תאים / מ"ל.

2. אפיון LiDEP

  1. מערך ניסיוני
    1. הרכיבו את הציוד הבא למערך הניסוי לכימות התגובות התאיות ל-LiDEP: מחשב נייד, מקרן, עדשה אובייקטיבית, מיקרוסקופ דיגיטלי ומחולל פונקציות. השתמש במחשב הנייד כדי לעצב את הקרנות האור (כוכב, יהלום, שלושה קווים וסגלגל) וחבר אותו למקרן.
    2. השתמש במקרן כמקור האור כדי להציג את הקרנות האור על פני השטח הפוטו-מוליכים (שכבה C) של שבב LiDEP. הגדר אותו כך שהאור ממקור האור (המקרן) יעבור דרך עדשה אובייקטיבית של 10x אל אזור המיקרו-ערוץ של שבב LiDEP. עדשת האובייקט 10x יושבת על גבי עדשת המקרן. איור משלים 1 מציג את שילוב המקרן במערכת LiDEP.
    3. חבר את שבב LiDEP למחולל הפונקציות כדי להפעיל את השדה החשמלי AC. התבונן בתאים החווים את כוח LiDEP באמצעות המיקרוסקופ הדיגיטלי לצורך הדמיה והקלטת וידאו. איור 1B מראה סכמה של מנגנון הניסוי. עקוב אחר פרוטוקולים סטנדרטיים של תרביות תאים26,27 עבור כל התאים שנבדקו.
  2. הליכים ניסיוניים
    1. שטפו את המיקרו-ערוץ עם 70% אתנול, ואחריו תמיסת BSA של 0.5%. שטפו שוב את המיקרו-ערוץ בתמיסת BSA של 0.5% פעמיים נוספות כדי להבטיח שהאתנול והתאים הקודמים יישטפו לחלוטין. תאים שכבר נחשפו לשדה DEP יגיבו באופן שונה מתאים טריים ועלולים לשבש את איסוף הנתונים.
    2. הסר את תמיסת BSA 0.5% עם פיפטה, והכנס את ההתקן המיקרופלואידי למחזיק המכשיר.
    3. חבר אטבי תנין לכל אחד מחיבורי סרט הנחושת במכשיר. הגדר את מחולל הפונקציות למתח הרצוי (מתח משיא לשיא, Vpp) ולתדר (Hz). טווח התדרים שנבדק כאן היה 30 קילוהרץ עד 20 מגה-הרץ.
    4. הוסף 70 μL של תרחיף תאים (תאים + תמיסת חיץ DEP עם 0.5% BSA) למיקרו-ערוץ של המכשיר. בשל דקיקות המיקרו-ערוץ (~0.05 מ"מ), עלולה להתרחש שפיכה החוצה מחורי הכניסה והיציאה. כדי להפחית את כמות השפיכה, השתמשו בקצה פיפטה קטן יותר והטו מעט את הקצה בתוך החור לכיוון המיקרו-ערוץ. כל תמיסת גישה (0.5% BSA או תאים בתמיסה) ניתנת לניגוב באמצעות מגבוני נייר חד-פעמיים ולהשליך לפסולת מסוכנת ביולוגית.
    5. הקרן את גיאומטריית האלקטרודות הווירטואלית הרצויה (כאן, עיגולים, יהלומים, כוכבים ו/או קווים מקבילים) על שבב LiDEP.
    6. בתוכנת המיקרוסקופ הדיגיטלי, הגדר את אורך הווידאו ל -3 דקות. כוונו טיימר מעבדה ל-2 דקות ו-30 שניות. ברגע שהתאים נייחים במיקרו-ערוץ של שבב LiDEP, לחץ על התחל בתוכנת המיקרוסקופ הדיגיטלי כדי להתחיל בתהליך הקלטת הווידאו.
    7. המתן 10 שניות ולאחר מכן לחץ על לחצן ON של פלט ערוץ מחולל הפונקציות כדי להחיל את השדה החשמלי AC ולחץ על התחל עבור הטיימר. נטר את התנהגות DEP התא באמצעות המיקרוסקופ הדיגיטלי, ומנע רעידות או תזוזה סביב ההתקנה.
    8. לאחר כיבוי הטיימר, לחץ על לחצן ON של פלט ערוץ מחולל הפונקציות. פעולה זו מכבה את פלט ערוץ מחולל הפונקציות, והשדה החשמלי AC אינו מסופק עוד דרך האלקטרודות. עצור את הקלטת הווידאו ב 3 דקות, ושמור במיקרוסקופ דיגיטלי לניתוח עתידי.
    9. פיפטה את התאים מחוץ לקצה היציאה של שבב LiDEP על ידי דחיפה איטית של 60 μL של חיץ DEP עם 0.5% BSA לתוך microchannel ובו זמנית איסוף בשקע. המשך עד שיש מעט תאים או ללא תאים במיקרו-ערוץ.
    10. חזור על שלבים 2.2.3-2.2.9 עד לבדיקת כל התדרים.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בדיקות מתח וצבע אלקטרודות הושלמו באמצעות ההליך לעיל עם שינוי קל בשלב 2.2.3 ושלב 2.2.10. עבור בדיקת המתח, צבע האלקטרודה ותדירותה נותרו קבועים, והוחלו 5 V pp, 10 V pp ו- 20 Vpp. עבור בדיקת צבע האלקטרודות, המתח והתדר המופעלים הוחזקו קבועים ב- 30 קילוהרץ ו- 20 וולטpp, ונבדקו אלקטרודות כחולות, אדומות, לבנות וצהובות (אליהן מתייחסים קודי צבע HEX #4472C4, #FF0000, #FFFFFF ו- #FFFF00, בהתאמה). כדאיות התא נבדקה על ידי צביעת התאים בכחול טריפאן וספירת מספר התאים החיים והמתים באמצעות המוציטומטר.

עם הגדרת LiDEP, הצלחנו לתפעל את hMSCs וליצור עקומות תגובת DEP בתגובה לתדר הקלט, שהיא אחת הדרכים לאפיין את ההתנהגות החשמלית של תאים. סדרה של ניסויים נערכו כדי למצוא את תנאי ההפעלה האופטימליים על ידי מניפולציה של פרמטרים כגון המתח המופעל וצבע האלקטרודה המוקרן (כלומר, צורות עם צבעים מובחנים שנוצרו באמצעות תוכנת עורך גרפי) כדי לצפות בהתנהגות תאים עקבית לשדה החשמלי AC הלא אחיד שנוצר עם האלקטרודות הווירטואליות. הנתונים שנאספו עבור תגובות תאים באמצעות LiDEP, DEP לא מסורתי, הושוו לתוצאות של מנתח 3DEP, DEP מסורתי.

בדיקת המיטוב הראשונה התמקדה בתגובת DEP חיובית של hMSCs (כלומר, התאים הנעים לעבר האלקטרודה הווירטואלית) בשבב LiDEP. התאים שלא הציגו תגובת DEP חיובית הציגו תגובת DEP שלילית על ידי התרחקות מהאלקטרודה הווירטואלית, היו נייחים ומסתובבים, או לא הגיבו לשדה החשמלי. תגובת התאים כומתה על ידי מעקב אחר מהירותם (מיקרומטר לשנייה) ב-ImageJ במהלך תקופה של 2 דקות ו-30 שניות. עבור האלקטרודה הווירטואלית נעשה שימוש בהיטל אליפטי צהוב, והמתחים המופעלים של 5 V pp, 10 V pp ו-20 Vpp נבדקו בתדר קבוע של 30 kHz. התמקדנו בתאים שהיו בטווח של 50 מיקרומטר מהאלקטרודה הווירטואלית בזמן שהשדה החשמלי AC פעל כדי לשמור על עקביות ולמזער חריגים. 20 וולטpp הביא לתנועת התאים המהירה ביותר מבין תאי HEK 293, עם מהירות ממוצעת של 0.035 מיקרומטר לשנייה, ואחריה 0.032 מיקרומטר לשנייה ב-10 וולט לשנייה ו-0.020 מיקרומטר לשנייה ב-5 וולטלשנייה, כלומר תאים אלה מייצגים בקרה הומוגנית יחסית. מגמה דומה נצפתה עבור hMSCs, שהיו בעלי מהירות ממוצעת של 0.051 מיקרומטר לשנייה ב-20 וולט לשנייה, 0.036 מיקרומטר לשנייה ב-10 וולט לשנייה ו-0.025 מיקרומטר לשנייה ב-5 וולט לשנייה, כמו באיור 2A (כאן, * מציין p < 0.05). ב 20 Vpp, נצפה כי hMSCs חוו DEP חיובי ושלילי בו זמנית. זה לא נצפה ב 10 V pp ו 5 V pp. ממצאי הכדאיות של hMSCs לאחר שחוו את כוח DEP הראו כי מתחים גבוהים יותר הביאו בדרך כלל לקיום תאים נמוך יותר, כאשר 66% מהתאים קיימא ב 5 V pp, 58% מהתאים קיימא ב 10 V pp, ו 57% מהתאים קיימא ב 20 V pp, כמו באיור 2B (כאן, ** מציין p < 0.01).

בשל היותה של LiDEP מערכת מבוססת אופטיקה, עוצמת האור וצבע האלקטרודה הם פרמטרים שניתן לכוונן בקלות כדי לשלוט בביצועים של שבב LiDEP. כאן, צבעי אלקטרודות שונים (לבן, צהוב, אדום וכחול) שנוצרו בהתבסס על הצורה המוקרנת הוערכו כדי לקבוע את ההשפעה על תגובות ה- DEP של התאים. HEK 293 תאים hMSCs הוערכו ב 20 Vpp ו 30 kHz. אלקטרודות בצבעי לבן, צהוב, אדום וכחול נבחרו, אך ההארה דרך שבב LiDEP הושפעה מהשכבה הפוטו-מוליכה, שהייתה בעלת צבע אדום-כתום. לפיכך, האלקטרודה הלבנה המוקרנת נראתה צהובה עם פנים לבן, האלקטרודה האדומה נראתה כתומה עם קו מתאר אדום, והאלקטרודה הכחולה נראתה ירוקה בהירה (איור 3A-D). תפוקות החשמל של ארבעת הצבעים הללו היו כדלקמן: 77.7 μW ± 0.7 μW, 92.7 μW ± 1.3 μW, 21.9 μW ± 0.2 μW ו- 56.7 μW ±- 0.9 μW עבור לבן, צהוב, אדום וכחול, בהתאמה. זה מצביע בבירור על כך שלצהוב ולבן היה שדה DEP החזק ביותר, בעוד שכחול ואדום היו חלשים יותר, כמו באיור 3E (כאן, *** מציין p < 0.001 עבור תאי HEK 293 ו- ** מציין p < 0.01 עבור hMSCs). כמו כן נצפה סיבוב נייח של התאים בשולי האלקטרודות הווירטואליות הצהובות והלבנות במהלך יישום כוח DEP. עבור כל שינויי צבע האלקטרודות, התרחשו בו זמנית תגובות DEP שליליות וחיוביות, בקורלציה למה שהוצג ב- 20 Vpp עבור בדיקת המתח. בנוסף, בעוד שמהירות התאים השתנתה בהתאם לצבע האלקטרודה, כמעט כל התאים בגבול 50 מיקרומטר הגיבו ל-LiDEP. גודלם של hMSCs נמדד כ-19.2 מיקרומטר ±-5.8 מיקרומטר.

כדי להעריך את היכולת של LiDEP בהשוואה ל-DEP עם אלקטרודות קונבנציונליות, הערכנו את ההבדלים בין התנהגות ה-DEP של תאים המשתמשים ב-LiDEP לזו של תאים שנותחו על-ידי מנתח 3DEP. תגובת DEP של hMSCs נמדדה בתמיסת חיץ DEP במוליכות נמוכה עם 0.5% BSA (~100 μS/cm). כדי לחקות את מנתח 3DEP, הוקרן אלקטרודה וירטואלית צהובה אליפסה אחת ב- 10 Vpp. התנהגות DEP של hMSCs אופיינה מ 30 קילוהרץ עד 20 MHz. בתדרים נמוכים מ-25 קילוהרץ צפינו באלקטרוליזה, שהביאה ליצירת בועות על פני השטח של שכבת המתכת בתוך המכשיר המיקרופלואידי. עבור LiDEP, בתדרים נמוכים יותר, hMSCs חוו כוח DEP חיובי, כמו באיור 4A, המיוצג כאחוז התאים הנמשכים לאלקטרודה הווירטואלית. התאים התחילו עם כוח DEP חיובי חזק, שנחלש ככל שהתדירות עלתה. התאים חוו את כוח ה-DEP החיובי החזק ביותר מ-30 קילו-הרץ ל-97 קילוהרץ. לאחר הפעלת השדה החשמלי AC בתדרים אלה, חלק מהתאים הפסיקו להגיב, בעוד שתאים אחרים הראו התנהגות DEP שלילית. מגמה זו חורגת מהתגובה הנצפית שכומתה באמצעות מנתח 3DEP; התאים גדלו ב-DEP חיובי מ-37 קילו-הרץ ל-255 קילו-הרץ וירדו ב-DEP חיובי מ-1,772 קילו-הרץ ל-20 מגה-הרץ, כמו באיור 4B.

figure-results-1
איור 1: התקנה ניסיונית עבור פרוטוקול LiDEP המתואר כאן עבור hMSCs. (A) תמונה סכמטית ואמיתית של שבב LiDEP עם השכבה הפוטו-מוליכה ומערך הניסוי. (B) תמונות מייצגות של תגובות DEP חיוביות ושליליות של תאים באנלייזר 3DEP (באמצעות אלקטרודות DEP קונבנציונליות, למעלה) וייצוג סכמטי של תגובות DEP חיוביות ושליליות של תאים באמצעות LiDEP (שימוש בהקרנות אור כאלקטרודות וירטואליות, למטה). (C) דוגמאות לצורות שונות שניתן להקרין על המכשיר כאלקטרודות וירטואליות. איור שנוצר באמצעות BioRender.com. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: אפיון תגובות ה-DEP (מהירות) של hMSCs והישימות שלהן בתנאים הנתונים. (A) המהירויות הנמדדות של תגובות DEP חיוביות של hMSCs ל- 5 V pp, 10 V pp ו- 20 V pp. ה-hMSCs נעו במהירות של 0.051 מיקרומטר לשנייה ב-20 וולט לשנייה, 0.036 מיקרומטר לשנייה ב-10 וולט לשנייה ו-0.025 מיקרומטר לשנייה ב-5 וולטלשנייה. (B) יכולת הקיום של hMSCs לאחר שחוו את כוח ה-DEP החיובי שנוצר באמצעות אלקטרודות וירטואליות. הכדאיות הייתה 57%, 58% ו-66% עבור 20 V pp, 10 V pp ו-5 Vpp, בהתאמה. קווי שגיאה מייצגים את סטיית התקן (SD). ניתוח סטטיסטי שהושלם על מערכי נתונים מאוגמים באמצעות מבחני t (*p < 0.05 ו- **p < 0.01). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: השוואת תגובות DEP בין קווי תאים הומוגניים (HEK 293) והטרוגניים (hMSCs). תגובת DEP חיובית של תאי hMSCs לאלקטרודות (A) לבן, (B) צהוב, (C) אדום ו-(D) כחול ב-20 Vpp ו-30 kHz. (E) תגובות מהירות של תאי HEK 293 ו-hMSCs לאלקטרודות בצבעים שונים. תאי HEK 293 הציגו את המהירויות הגבוהות ביותר עם אלקטרודות צהובות ואדומות של 0.035 מיקרומטר לשנייה ו-0.033 מיקרומטר לשנייה, בהתאמה. תאי HEK 293 הציגו את המהירות הנמוכה ביותר עם האלקטרודות הכחולות של 0.027 מיקרומטר לשנייה. ה-hMSCs הציגו את המהירויות הגבוהות ביותר עם האלקטרודות הצהובות והלבנות ב-0.068 מיקרומטר לשנייה ו-0.049 מיקרומטר לשנייה, בהתאמה. ה-hMSCs חוו את המהירות הנמוכה ביותר עם האלקטרודות האדומות ב-0.039 מיקרומטר לשנייה. קווי השגיאה מייצגים את SD. ניתוח סטטיסטי שהושלם בערכות נתונים מאוגמות באמצעות בדיקות t (*p < 0.05, **p < 0.01 ו- ***p < 0.001). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-4
איור 4: השוואת תגובות DEP של hMSCs באמצעות LiDEP ו-3DEP. תגובות ה-DEP של hMSCs נמדדו באמצעות (A) LiDEP ו-(B) מנתח 3DEP ב-10 Vpp. עם LiDEP, חלה דעיכה בתגובת ה-DEP החיובית של hMSCs מ-30 קילו-הרץ ל-20 מגה-הרץ. ממנתח 3DEP, התאים גדלו ב-DEP חיובי מ-37 קילו-הרץ ל-255 קילו-הרץ וירדו ב-DEP חיובי מ-1,772 קילו-הרץ ל-20 מגה-הרץ. קווי שגיאה מייצגים את ה-SD. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור משלים 1: תמונות מייצגות של מערך LiDEP ששימש לניסויים בפרוטוקול זה. תמונה מוגדלת של מערכת LiDEP המציגה את שילוב המקרן. האור עובר מהמקור (המקרן) דרך עדשה אובייקטיבית פי 10 אל המיקרו-ערוץ של שבב LiDEP. המטרה של 10x יושבת על גבי עדשת המקרן. כל רכיב ממוספר בתמונות ומופיע בצד. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

סרטון משלים 1: וידאו מייצג של hMSCs המגיבים לאלקטרודות וירטואליות לבנות, צהובות, אדומות וכחולים. התאים מוצגים כחווים DEP חיובי (נע לכיוון האלקטרודה הווירטואלית), חווים DEP שלילי (מתרחקים מהאלקטרודה הווירטואלית), נייחים ומסתובבים, או לא מגיבים לשדה החשמלי. hMSCs נבדקו ב 37 kHz ו 20 Vpp, ואת הווידאו הואץ 20x. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בחינת ההטרוגניות של hMSCs חשובה לקידומם בטיפול. עבודה זו מספקת צעד ראשון לשימוש ב- LiDEP ככלי אנליטי להערכת hMSCs. בחנו את תלות המתח של תגובת DEP חיובית של תאים ב- LiDEP על ידי כימות המהירות. צפוי שמתחים גבוהים יותר יפיקו כוח DEP חיובי חזק יותר, וראינו דפוס זה עם המהירויות שנמדדו. מתחי 10 V pp ו- 20 Vpp הספיקו למניפולציה של hMSCs באמצעות LiDEP. מתחים נמוכים יותר (כלומר, 5 Vpp) גרמו לתגובות תאים איטיות יותר; אמנם זה לא אופטימלי עבור hMSCs, אבל זה יכול להיות יתרון עבור סוגי תאים אחרים. חלה ירידה תלוית מתח בכדאיות של hMSCs של כ-9%. זה שונה במקצת מהספרות הקודמת 6,12,28,29, שבה השימוש ב- DEP ו- LiDEP מסורתיים בבדיקת תאים ביולוגיים לא הפחית את יכולת הקיום של התא. עם זאת, מטרת הניסוי בכל מחקר השתנתה. גלזר ופור עקבו אחר צמיחת פיברובלסטים של עכברי L929 דבקים על אלקטרודות מתכת בתווךתרבית תאים 28. לעומת זאת, לו ועמיתיו בחנו את הכדאיות של תאי גזע עצביים שנחשפו לשדות חשמליים AC לפרקי זמן שונים12. Adams et al. אפיינו את התכונות הדיאלקטריות של hMSCs עם אלקטרודות מתכת12, ו- Li et al. תמרנו תאי לוקמיה עם LiDEP29. ההבדל בין מחקרים אלה לשלנו היה השימוש ב- BSA, שעשוי להיות הגורם לירידה בכדאיות שראינו. עם זאת, הכדאיות הכוללת הנמוכה יותר עשויה לנבוע גם מזמן החשיפה (2 דקות 30 שניות) המשמש בפרוטוקול שנקבע כאן. זמן זה נבחר כדי לספק מספיק זמן כדי לדמיין מניפולציה של תאים במהלך חשיפה לשדה חשמלי AC לא אחיד.

שיטות אפיון התא נבדקו באמצעות צבע האלקטרודה כדי לקבוע את היכולות והמגבלות של מערכת LiDEP שלנו שנבנתה כמתואר בפרוטוקול. בפרוטוקול ספציפי זה, ניתן לשלוט בצבע האלקטרודה בהתבסס על צבע הצורה המוקרנת באמצעות קובץ עורך גרפי. השתמשנו בארבעה צבעים: לבן, צהוב, אדום וכחול. מקריאות תפוקת החשמל של כל צבע, האלקטרודות הצהובות (#FFFF00) והלבנות (#FFFFFF) המוקרנות נמדדו כבעלות עוצמות גבוהות יותר, וזה היה הבסיס לכך שצבעים אלה היו נוחים יותר לשימוש בניסויים הבאים. בנוסף, בגלל התלות המבוססת בעוצמת האור של חומרים פוטו-מוליכים30,31, התוצאות מצביעות על כך שהביצועים של התקני LiDEP מסתמכים על A:Si פוטו-מוליך וניתן לכוונן אותם על ידי בחירת צבע האלקטרודה המוקרנת. שילוב של תגובות DEP חיוביות ושליליות של hMSCs נצפה גם באמצעות LiDEP, בדומה לתופעה שנצפתה בשיטות DEP מסורתיות. עם כל צבע אלקטרודה, hMSCs חוו כוח DEP שלילי, כוח DEP חיובי וסיבוב תאים, מה שמצביע על כך שדגימת התא הייתה הטרוגנית בתדר יחיד (וידאו משלים 1). זה מסכים עם הממצאים של Adams et al.6 כי hMSCs מפגינים התנהגות שלילית וחיובית DEP בתדירות אחת. תנאים אלה (צבע אלקטרודה, צורת אלקטרודה וחומר פוטו-מוליך) עשויים לספק פרמטרים נוספים לזיהוי רמת ההטרוגניות בדגימות hMSC.

לבסוף, תוצאות הערכת LiDEP הושוו לתוצאות מנתח 3DEP כאמת מידה להתנהגות hMSC DEP. נצפה הבדל בטווח התדרים של תגובת ה-DEP החיובית של hMSCs, אך המגמות בנתונים שנאספו באמצעות LiDEP ומנתח 3DEP היו דומות בסך הכל (כלומר, תגובת ה-DEP החיובית פחתה עם העלייה בתדירות). כאשר השדה החשמלי AC סופק לשבב LiDEP והוקרן עליו אור, המוליכות באזור בתוך הקרנת האור ירדה, ונוצר שדה חשמלי לא אחיד. לכן, המאפיינים של מקור האור (כלומר, עוצמה ואורך גל) משפיעים על התגובה הצפויה של התאים בתוך שבב LiDEP, כפי שניתן לראות מתוצאות בדיקות המתח ושינוי צבע האלקטרודות. פרמטרים אחרים שניתן לשנות הם החומר של השכבה הפוטו-מוליכה והמוליכות של תמיסת החיץ DEP. לפיכך, יש להעריך את התנאים המשמשים להערכת התנהגות DEP של תאים בהתבסס על ההתקנה של מערכת LiDEP. לעומת זאת, עבור מנתח 3DEP, או שיטות אחרות המשתמשות באלקטרודות מתכת כדי להפעיל את כוח DEP, מאפייני האלקטרודות הם קבועים ולא ניתן לשנות אותם באופן מיידי כדי להתאים למה שנדרש עבור התאים הנחקרים. וריאציה זו של התנהגות DEP חיובית עשויה להועיל למחקר עתידי על אפיון סוגי תאים שונים בתוך דגימות hMSC, אנליזה של תא בודד או מיון תאים. בנוסף, ככל שהתאים מתרחקים מהאלקטרודות הווירטואליות, השדה החשמלי AC נחלש. עם זאת, עם מנתח 3DEP, או מצבי DEP מסורתיים אחרים המשתמשים באלקטרודות מתכת, ניתן ליישם אזור שדה חשמלי גדול יותר, המאפשר לתאים רבים יותר להיות מניפולציה. לכן, פחות תאים בניסוי LiDEP חוו את ההשפעות של השדה החשמלי AC בתוך המיקרו-ערוץ של שבב LiDEP. פערים נוספים עשויים להיגרם כתוצאה משינויים בביצועי המכשיר לאורך זמן (כלומר, שעתיים או 3 שעות), שעדיין נחקרים. הזרימה המתמדת של מים, אתנול ותמיסת חיץ DEP עלולה לשבור את פני השטח של שכבת המיקרו-ערוץ (כלומר, החומר הפוטו-מוליך) ויש לקחת זאת בחשבון. ביצועי המכשיר לאורך זמן לאפיון תאים צריכים להילקח בחשבון גם לשימוש ממושך בשבב LiDEP אחד. שינויים בפרמטרים הניסיוניים בזמן אמת ארכו שניות ספורות עד דקות בלבד. צבע האלקטרודה והגיאומטריות הותאמו באופן מיידי באמצעות הגדרות בתוך תוכנת העורך הגרפי.

לסיכום, מאמר זה מדגים את היכולות של LiDEP לתפעל ולאפיין קו תאים עם אוכלוסיות תאים הטרוגניות כגון hMSCs. באמצעות הגדרה זו והפרוטוקול המתואר, הצלחנו להשיג אפיון מוצלח של hMSCs בתנאים של 20 Vpp ואלקטרודות צהובות וירטואליות מוקרנות. מחקרים עתידיים צריכים להתמקד בהתאמת זמן החשיפה של hMSCs לשדה חשמלי AC שנוצר באמצעות LiDEP, הגדלת עוצמת האור של האלקטרודות הווירטואליות, והערכת מקורות שונים של hMSCs (או אוכלוסיות תאי גזע אחרות) כדי לפתח קטלוג LiDEP של החתימות החשמליות של אוכלוסיות תאי גזע הטרוגניות.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים אינם מדווחים על ניגודי עניינים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי פרס CAREER של הקרן הלאומית למדע (2048221) באמצעות CBET. ברצוננו להודות למו קביילי ממתקן המחקר המשולב לננו-מערכות (INRF) של UCI. בנוסף, ברצוננו להודות לד"ר דווין קק על הסיוע בפיתוח מערכת LiDEP.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.05% טריפסין-EDTAGibco25300054
10x אובייקטיביAmScope---
אסיליקון אמורפי (A:Si)Millipore SigmaS5130
אנטיביוטיקה-אנטימיקוטית (100X)Gibco15240-062
אלבומין סרום בקר (BSA)FisherBP9706-100
סרט נחושתזההBF4964
דקסטרוז (גלוקוז)פישרD16-1
מיקרוסקופ דיגיטליKeyenceVHX-7000
אינסולקטרוסרט דו צדדיFLX000484
תמיסת מלח חוצץ פוספט של Dulbecco (DPBS)Gibco14190-144
Fetel Bovine Serum (FBS)קורנינג35-011-CV
מחולל פונקציותTektronixAFG 31102
תוכנת עורך גרפיMicrosoft Office Powerpoint---
פח אינדיום תחמוצת זכוכית מצופה שקופיותMSE מסופקGL0333
L-Alanyl-L-גלוטמיןATCCPCS-999-034
מחשב ניידDellInspiron 14, 2 ב-1
מזנכימלי תאי גזע בזאליים ATCCPCS-500-030
בינונית עבור MSCs שמקורם בטבור ובחבל השומןATCCPCS-500-040
מינימום חיוני מדיאום אלפא (MEM a, 1X)GibloA10490-01
מוליבדן, 99.95%קורט ג'יי לסקרEJTMOXX352A4יעד מקרטע
פנול אדוםסיגמאP5530
מד כוחThor LabsS130VC/PM400
מקרןVecupoi---
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 MediaGibco11875-093מדיה זו מכילה L-גלוטמין ופנול אדום.
סוכרוזפישרBP220-1
טריפן כתם כחולGibco15250-0610.40%
מנטרל טריפסיןGibcoR002100
מערכת מקרטעת ואקוםDentonDV-502M
ערכת גידול תאי גזע מזנכימליים

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mahla, S. R. Stem cells applications in regenerative medicine and disease therapeutics. International Journal of Cell Biology. 2016, (2016).
  2. Bhansali, A. Efficacy of autologous bone marrow-derived stem cell transplantation in patients with type 2 diabetes mellitus. Stem Cells and Development. 18 (10), 1407-1416 (2009).
  3. Bouchlaka, M. N. Human mesenchymal stem cell-educated macrophages are a distinct high IL-6-producing subset that confer protection in graft-versus-host-disease and radiation injury models. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 23 (6), 897-905 (2017).
  4. Alfaifi, M., Eom, Y. W., Newsome, P. N., Baik, S. K. Mesenchymal stromal cell therapy for liver diseases. Journal of Hepatology. 68 (6), 1272-1285 (2018).
  5. Oswald, J. Mesenchymal stem cells can be differentiated into endothelial cells in vitro. Stem Cells. 22 (3), 377-384 (2004).
  6. Sakaguchi, Y., Sekiya, I., Yagishita, K., Muneta, T. Comparison of human stem cells derived from various mesenchymal tissues: superiority of synovium as a cell source. Arthritis and rheumatism. 52 (8), 2521-2529 (2005).
  7. Poirier, J. T. Chapter 5 - Genetic profiling of tumors in PDX models. In Patient Derived Tumor Xenograft Models: Promise, Potential and Practice. Uthamanthil, R., Tinkey, P. , Academic Press. Cambridge, MA. 149-159 (2017).
  8. Sino Biological. Fluorescence-activated cell sorting (FACS). , Available from: https://www.sinobiological.com/category/fcm-facs-facs (2023).
  9. González-González, M., Vázquez-Villegas, P., García-Salinas, C., Rito-Palomares, M. Current strategies and challenges for the purification of Stem Cells. Journal of Chemical Technology and Biotechnology. 87 (1), 2-10 (2011).
  10. Flanagan, A. L. Unique dielectric properties distinguish stem cells and their differentiated progeny. Stem Cells. 23 (3), 656-665 (2007).
  11. Vykoukal, J., Vykoukal, D. M., Freyberg, S., Alt, E. U., Gascoyne, P. R. C. Enrichment of putative stem cells from adipose tissue using dielectrophoretic field-flow fractionation. Lab on a Chip. 8 (8), 1386-1393 (2008).
  12. Adams, T. N. G., Turner, P. A., Janorkar, A. V., Zhao, F., Minerick, A. R. Characterizing the dielectric properties of human mesenchymal stem cells and the effects of charged elastin-like polypeptide copolymer treatment. Biomicrofluidics. 8 (5), (2014).
  13. Wu, H. W., Lin, C. C., Lee, G. B. Stem cells in microfluidics. Biomicrofluidics. 5 (1), (2011).
  14. Adams, T. N. G. Label-free enrichment of fate-biased human neural stem and progenitor cells. Biosensors and Bioelectronics. 152, 111982(2020).
  15. Zhao, K., Larasati,, Duncker, B. P., Li, D. Continuous cell characterization and separation by microfluidic alternating current dielectrophoresis. Analytical Chemistry. 91 (9), 6304-6314 (2019).
  16. Song, H. Continuous-flow sorting o stem cells and differentiation products based on dielectrophoresis. Lab on a Chip. 15, 1320-1328 (2015).
  17. Khoshmanesh, K., Nahavandi, S., Baratchi, S., Mitchell, A., Kalantar-Zadeh, K. Dielectrophoretic platforms for bio-microfluidic systems. Biosensors and Bioelectronics. 26 (5), 1800-1814 (2010).
  18. Hoettges, K. F. Ten-second electrophysiology: Evaluation of the 3DEP platform for high-speed, high-accuracy cell analysis. Scientific Reports. 9, 19153(2019).
  19. Hubner, Y., Hoettges, K. F., Kass, G. E. N., Ogin, S. L., Hughes, M. P. Parallel measurements of drug actions on Erythrocytes by dielectrophoresis, using a three-dimensional electrode design. IEE Proceedings - Nanobiotechnology. 152 (4), 150-154 (2005).
  20. Hoettges, K. F. Dielectrophoresis-activated multiwell plate for label-free high-throughput drug assessment. Analytical Chemistry. 80 (9), 2063-2068 (2008).
  21. Mulhall, H. J. Cancer, pre-cancer and normal oral cells distinguished by dielectrophoresis. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 401 (8), 2455-2463 (2011).
  22. Liao, C. -J. An optically induced dielectrophoresis (ODEP)-based microfluidic system for the isolation of high-purity CD45neg/EPCAMNEG cells from the blood samples of cancer patients-Demonstration and initial exploration of the clinical significance of these cells. Micromachines. 9 (11), 563(2018).
  23. McGrath, J. S. Electrophysiology-based stratification of pancreatic tumorigenicity by label-free single-cell impedance cytometry. Analytica Chimica Acta. 1101, 90-98 (2019).
  24. Chiu, T. K. Optically-induced-dielectrophoresis (ODEP)-based cell manipulation in a microfluidic system for high-purity isolation of integral circulating tumor cell (CTC) clusters based on their size characteristics. Sensors and Actuators, B: Chemical. 258, 1161-1173 (2018).
  25. Medjdoub, M., Courant, J. L., Maher, H., Post, G. Inductively coupled plasma - plasma enhanced chemical vapor deposition silicon nitride for passivation of InP based high electron mobility transistors (HEMTs). Material Science and Engineering: B. 80 (1-3), 252-256 (2001).
  26. Umbilical cord-derived mesenchymal stem cells; Normal, human. , ATCC. Available from: https://www.atcc.org/products/pcs-500-010 (2023).
  27. 293 [HEK-293]. , ATCC. Available from: https://www.atcc.org/products/crl-1573 (2023).
  28. Glasser, H., Fuhr, G. Cultivation of cells under strong ac-electric field-differentiation between heating and trans-membrane potential effects. Bioelectrochemistry and Bioenergetics. 47 (2), 301-310 (1998).
  29. Li, B. Implementation of flexible virtual microchannels based on optically induced dielectrophoresis. Nanotechnology. 33, 295102(2022).
  30. Schellenberg, J. J., Kao, K. C. On the relationship between photoconductivity and light intensity in solids. Journal of Physics D: Applied Physics. 21, 1764-1768 (1988).
  31. Aoyagi, Y., Masuda, K., Namba, S. Explaination of light-intensity dependence of photoconductivity in zinc phthalocyanine. Journal of Applied Physics. 43, 249-251 (1972).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים