הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

בידוד וניתוח שעתוק של סוגי תאי צמח

2.6K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/64913

⸱

7 באפריל 2023

 ,  ,  , 
1Joint Center for Single Cell Biology, School of Agriculture and Biology, Shanghai Jiao Tong University

במאמר זה

סיכום

ההיתכנות והיעילות של שיטות scRNA-seq בעלות תפוקה גבוהה מבשרות על עידן חד-תאי בחקר צמחים. מוצג כאן הליך חזק ומלא לבידוד סוגי תאי שורש ספציפיים של Arabidopsis thaliana ובנייה וניתוח של ספריית שעתוק לאחר מכן.

תקציר

באורגניזמים רב-תאיים, תכנות התפתחותי ותגובות סביבתיות יכולים להיות שונים מאוד בסוגי תאים שונים או אפילו בתוך תאים, מה שידוע בשם הטרוגניות תאית. בשנים האחרונות, בידוד תא בודד וסוג תא בשילוב עם טכניקות ריצוף הדור הבא (NGS) הפכו לכלים חשובים לחקר תהליכים ביולוגיים ברזולוציה של תא יחיד. עם זאת, בידוד תאי צמח הוא יחסית קשה יותר בשל נוכחותם של קירות תאי הצמח, אשר מגביל את היישום של גישות חד-תאיות בצמחים. פרוטוקול זה מתאר הליך חזק למיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות (FACS) המבוסס על בידוד תא בודד וסוג תא עם תאי צמחים, המתאים לניתוח מולטי-אומיקס במורד הזרם ולמחקרים אחרים. באמצעות שימוש בקווי סמן פלואורסצנטיים של שורש Arabidopsis אנו מדגימים כיצד סוגי תאים מסוימים, כגון תאי פריסייקל של קוטב קסילם, תאי שורש ראשוניים רוחביים, תאי כובע שורש רוחביים, תאי קליפת המוח ותאים אנדודרמליים, מבודדים. יתר על כן, שיטת ניתוח תמלול יעילה במורד הזרם באמצעות Smart-seq2 מסופקת גם כן. שיטת בידוד התאים וטכניקות ניתוח התעתיק ניתנות להתאמה לסוגי תאים אחרים ולמיני צמחים ויש להן פוטנציאל יישום רחב במדעי הצמח.

מבוא

תאים הם היחידה הבסיסית של כל האורגניזמים החיים ומבצעים פונקציות מבניות ופיזיולוגיות. למרות שהתאים באורגניזמים רב-תאיים מראים סינכרוניות לכאורה, תאים מסוגים שונים ותאים בודדים מציגים הבדלים בתעתיק שלהם במהלך ההתפתחות ובתגובות סביבתיות. ריצוף RNA חד-תאי בתפוקה גבוהה (scRNA-seq) מספק עוצמה חסרת תקדים להבנת הטרוגניות תאית. יישום scRNA-seq במדעי הצמח תרם לבנייה מוצלחת של אטלס תאי צמח1, שימש לזיהוי טקסים תאיים נדירים ברקמות צמח2, סיפק תובנה לגבי הרכב סוגי התאים ברקמות צמחים, ושימש לזיהוי זהות תאית ופונקציות חשובות המשמשות במהלך התפתחות והתמיינות צמחים. בנוסף, ניתן להסיק מסלולי התפתחות מרחביים-זמניים ברקמות צמחים 1,2,3 כדי לגלות גנים חדשים של סמן4 ולחקור את תפקודם של גורמי שעתוק חשובים5 באמצעות scRNA-seq כדי לחשוף את השימור האבולוציוני של אותו סוג תא בצמחים שונים3. עקה אביוטית היא בין ההשפעות הסביבתיות החשובות ביותר על גדילה והתפתחות של צמחים. על ידי חקירת השינויים בהרכב סוגי התאים ברקמות צמחים בתנאי טיפול שונים באמצעות ריצוף שעתוק חד-תאי, ניתן גם לפתור את מנגנון תגובת העקה הא-ביוטית6.

הפוטנציאל לפתרון הטרוגניות שעתוק בין סוגי תאים באמצעות ריצוף scRNA תלוי בשיטת בידוד התאים ובפלטפורמת הריצוף. מיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות (FACS) היא טכניקה נפוצה לבידוד תת-אוכלוסייה של תאים עבור scRNA-seq בהתבסס על פיזור האור והתכונות הפלואורסצנטיות של התאים. פיתוח קווי סמן פלואורסצנטיים על ידי טכנולוגיה טרנסגנית שיפר מאוד את יעילות בידוד התאים על ידי FACS7. ביצוע scRNA-seq באמצעות Smart-seq28 משפר עוד יותר את היכולת לנתח את ההטרוגניות התאית. לשיטת Smart-seq2 יש רגישות טובה לזיהוי גנים והיא יכולה לזהות גנים גם עם קלט תעתיק נמוך9. בנוסף לאיסוף סוגי תאים בתפזורת, ממייני תאים מודרניים מספקים תבנית מיון אינדקס של תא יחיד, המאפשרת ניתוח תעתיק ברזולוציה של תא בודד באמצעות Smart-seq210 או שיטות RNA-seq מרובות אחרות, כגון CEL-seq211. מיון תא בודד או סוג תא יכול לשמש פוטנציאלית עבור יישומים רבים אחרים במורד הזרם, כגון מחקרי מולטי-אומיקה מקבילים12,13. מוצג כאן פרוטוקול חזק ורב-תכליתי לבידוד סוגי תאי צמחים, כגון תאי פריסייקל בקוטב קסילם, תאי כובע שורש רוחביים, תאי שורש ראשוניים רוחביים, תאי קליפת המוח ותאים אנדודרמליים משורשי קווי תאי סמן Arabidopsis thaliana על ידי FACS. הפרוטוקול כולל גם בניית ספריית Smart-seq2 לניתוח תמלול במורד הזרם.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הפרוטוקול הבא עבר אופטימיזציה עבור זרעי A. thaliana wild-type (WT) ללא קווי סמן פלואורסצנטי ופלואורסצנטי עבור סוגי תאי השורש הבאים: תאי פריסייקל בקוטב קסילם (J0121), תאי שורש ראשוניים לטרליים, תאי כובע שורש רוחביים (J3411), אנדודרמיס ותאי קליפת המוח (J0571) (איור 1A). כל קווי הסמנים התקבלו ממקור מסחרי (ראה טבלת חומרים), למעט קו סמן תא התחלת שורש רוחבי, שנוצר על ידי החדרת מבנה GFP מונע מקדם GATA23 לצמח ארבידופסיס מסוג בר בעקבות דו"ח14 שפורסם בעבר.

1. הכנת החומר הצמחי

  1. יש לעקר את זרעי A. thaliana WT ואת זרעי קו הסמן הפלואורסצנטי על ידי דגירה של הזרעים באקונומיקה של 20% באינקובטור מסתובב בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.
  2. שטפו את הזרעים במים מזוקקים פעמיים (ddH2O) שלוש עד חמש פעמים. בצעו שלב זה על ספסל סטרילי ונקי.
  3. מקציפים את זרעי קו ה-WT והכתב על מדיום Murashige ו-Skoog (MS) בחצי חוזק עם 0.8% אגר (w/v)15. לגדל את הצמחים אנכית במשך 5 ימים (16 שעות אור ב 23 ° C) לאחר ריבוד במשך 2 ימים ב 4 °C (75 °F).

2. Protoplasting

  1. הכינו את תמיסות הפרוטו-עמידות2,5, המכונות תמיסה א' ותמיסה ב' (ראו טבלת חומרים).
    1. הכן תמיסה A המכילה 400 mM mannitol, 0.05% BSA, 20 mM MES (pH 5.7), 10 mM CaCl2 ו-20 mM KCl (ראה טבלת חומרים). אחסנו את תמיסה A בטמפרטורה של -20°C למשך עד חודש אחד.
    2. הכינו תמיסה B על-ידי הוספת 1% (w/v) צלולאז R10, 1% (w/v) צלולאז RS, 1% (w/v) המיצלולאז, 0.5% (w/v) פקטוליאז, ו-1% (w/v) macerozyme R10 באליציטוט טרי של תמיסה A. אחסנו תמיסה B בטמפרטורה של -20°C למשך עד חודש אחד.
  2. הפשירו בעדינות את תמיסה א' ותמיסה ב' על קרח לפני תחילת הניסוי.
  3. חותכים את השורשים באמצעות להב נקי או מספריים, וקוצצים את השורשים לחתיכות ~0.5 ס"מ. השקיעו את השורשים ב-1.5 מ"ל של תמיסה B ולאחר מכן סיבוב עדין (בערך 18 סל"ד) בטמפרטורת החדר למשך 1.5-2 שעות.
  4. סנן את הפרוטופלסטים של השורש דרך רשת המסננת בגודל 40 מיקרומטר (ראה טבלת חומרים).
  5. שטפו את רשת המסננת עם 1-2 מ"ל של תמיסה A.
  6. שלב את הנוזלים של שלב 2.4 ושלב 2.5, וצנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. השליכו את הסופרנאטנט עם פיפטה, השהו מחדש את גלולת התא ב 500-600 מיקרוליטר של תמיסה A, ולאחר מכן הניחו אותה על קרח מיד.
  7. העבר את תמיסת התאים המרחפים למבחנה חדשה של 5 מ"ל למיון תאים.

3. מיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות (FACS)

  1. הפעל וסיים את שלבי הגדרת המכשיר במיון (ראה טבלת חומרים). בחרו את התעלות הפלואורסצנטיות, השתמשו בצמח WT (ללא פלואורסצנציה) כבקרה כדי לקבוע את קו הבסיס לפלואורסצנטיות עצמית, וכווננו את שער המיון בהתבסס על עוצמת הפלואורסצנטיות וסינגלי FSC/SSC (איור 2).
  2. הוסף 500 μL של תמיסה A (שלב 2.1.1) לתוך צינור איסוף של 1.5 מ"ל כדי למנוע נזק לתאים. לאסוף 2,000-3,000 תאים בכל צינור.
  3. לאחר המיון, מיד מניחים את הדגימות על קרח, צנטריפוגות את צינור האיסוף המכיל את התאים ב 300 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C, ולהסיר את supernatant עם פיפטה.
  4. קח 2 μL של תאים ממוינים, ולבדוק פלואורסצנטיות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (ראה טבלה של חומרים).
  5. אחסן את התאים הממוינים ב- -80°C, או השתמש בהם מיד לבניית ספריה (שלב 4).
  6. למיון אינדקס של תא יחיד, מקם את לוח 96 הבארות במתאם. כיילו את מיקום הצלחת כך שהטיפה תיפול בחור המרכזי של הצלחת. בחר מצב מיון של תא בודד בעת המיון, הזן את מספר היעד של התאים הממוינים כ- 1 והתחל במיון.

4. הכנת ספריית Smart-seq2

  1. כתוצאה מכמות הקלט הנמוכה במיוחד, בצע בניית ספריית RNA-seq מסוג תא בודד בסביבה נטולת זיהום. לפני תחילת הניסוי, נקו את הספסל עם מזהם משטח8 (ראו טבלת חומרים) ו-75% אתנול.
  2. הכינו חיץ ליזיס (תערובת A) (טבלה 1) על ידי שילוב של 0.33 μL של 10% Triton X-100, 0.55 μL של מעכב RNase ו-0.22 μL של 0.1 M DTT (ראו טבלת חומרים).
  3. מוסיפים 1 μL של תערובת A לתוך מדגם ממוין, וטוחנים עם מזיק סטרילי. נפח המדגם המועדף הוא ≤0.5 מיקרוליטר; השתמש במים נטולי RNase כדי לפצות על נפח של 14 μL. העבר כל דגימת תא בודד לתוך צינור PCR דק דופן 0.2 מ"ל.
  4. הכינו תערובת B המכילה 0.44 מיקרוליטר פריימר תגובה אוליגו-dT30VN (RT) (100 מיקרומטר) ו-4.4 מיקרוליטר של dNTPs (10 מילימטר) (טבלה 2) (ראו טבלת חומרים).
  5. הוסיפו 4.4 מיקרוליטר של תערובת B ל-14 מיקרוליטר הדגימה בכל צינור, פיפטה בעדינות כדי לערבב את הדגימה, ודגרו על הדגימה בטמפרטורה של 72°C למשך 3 דקות. לאחר הדגירה, מיד לשים את הדגימות על קרח כדי הכלאה oligo-dT זנב פולי A.
  6. הכינו את תערובת תגובת השעתוק ההפוך (תערובת C) (טבלה 3) (ראו טבלת חומרים). הוסף 21.6 μL של תערובת C לכל צינור המכיל את הדגימות. הפעל את תוכנית RT במכשיר PCR נפוץ (טבלה 4).
  7. בצע את תגובת ההגברה מראש על קרח. הכינו תערובת D על ידי שילוב של 44 μL של תערובת 2x PCR פולימראז ו-0.88 μL של פריימר IS PCR (10 μM) (טבלה 5) (ראו טבלת חומרים). הוסף 40.8 μL של תערובת D למוצר תגובת RT של 40 μL, והפעל את תוכנית קדם-הגברה (טבלה 6).
  8. לטהר את מוצרי תגובת קדם-הגברה באמצעות חרוזי Ampure XP (ראה טבלת חומרים). הוסיפו 48 מיקרוליטר חרוזים (יחס של 0.6:1) לכל דגימה משלב 4.7, וערבבו בעדינות את הדגימות על ידי פיפט.
  9. יש לדגור על הדגימות בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. הניחו את צינורות ה-1.5 מ"ל המכילים את הדגימות על מעמד הפרדה מגנטית למשך 5 דקות. יש להשליך בזהירות את הסופרנאטנט מהדגימות מבלי להפריע לחרוזים.
  10. שטפו את החרוזים על ידי השעייתם מחדש ב-200 מיקרוליטר של 80% אתנול, והניחו את הדגימות על מעמד ההפרדה המגנטית (ראו טבלת חומרים) למשך 3 דקות נוספות לפני השלכת הסופרנטנט המכיל אתנול.
  11. ייבשו את הדגימות באוויר למשך 10 דקות, וכסו את הצינורית כדי למנוע זיהום וזיהום צולב במהלך ייבוש האוויר.
  12. השהה מחדש את החרוזים ב 20 μL של ddH2O, לדגור את הדגימות בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות, ולאחר מכן להניח אותם על מעמד ההפרדה המגנטית במשך 5 דקות.
  13. פיפטה מוציאה 18 מיקרוליטר של הסופרנאטנט מכל צינור, ומעבירה את הדגימות לצינורות צנטריפוגות חדשים של 1.5 מ"ל. השתמש ב- 1 μL של הדגימה כדי להעריך את איכות ה- cDNA באמצעות ערכת כימות DNA, קבע את התפלגות הגודל של כל קדם-ספרייה באמצעות מנתח מקטעים (ראה טבלת חומרים), ואחסן את הדגימה הנותרת ב- -20 °C.
  14. בניית ספריית cDNA8 עבור ריצוף Illumina 16 מהמכפלה הקדם-ספרייתית של שלב4.13 באמצעות ערכת הכנת ספריית רצף (ראה טבלת חומרים).
  15. לטהר את הספריות (משלב 4.14) באמצעות חרוזי Ampure XP, לכמת את הספריות המטוהרות ולקבוע את התפלגות הגודל של כל ספרייה לאחר שלב 4.13.
    הערה: אחסן ננו-שומות שוות של כל ספרייה, וודא שלאף אחת מהן אין את אותו שילוב של אינדקס Illumina. אחרת, ניתן לאגד את הספריות ביחס המבוסס על פלט הרצף הרצוי ולרצף אותן יחד באותו נתיב של רצף האילומינה. באופן כללי, ריצוף כל ספרייה לעומק של 4-6 GB, המניב >10 מיליון קריאות ממופות, מספק כיסוי פי 20x-30 של גנום Arabidopsis . עומקי רצף נמוכים יותר מקובלים גם הם, אך עשויים להשפיע על משמעות ניתוח הביטוי הדיפרנציאלי.

5. ניתוח נתוני RNA-seq

  1. חתוך את הקריאות הגולמיות באמצעות Trim-Galore17 ולאחר מכן מיפוי לגנום הייחוס באמצעות hisat218 (daehwankimlab.github.io/hisat2), והסר את המקטעים המשוכפלים PCR באמצעות Picard19 (broadinstitute.github.io/picard).
  2. בצע את עיבוד הספירה הגולמית וניתוח עוקב של הגנים המבוטאים באופן דיפרנציאלי (DEG) עם DESeq220 באמצעות לפחות שלושה עותקים ביולוגיים עבור כל דגימה. בצע אשכולות של ביטוי הגנים עם חבילת Pheatmap, והצג באופן חזותי במפת חום של ביטוי.
    הערה: ערכי RPKM (קריאות לקילו-בסיס למיליון קריאות ממופות) של הגנים וה-TEs (רכיבים הניתנים לטרנספוזיה) חושבו באמצעות Stringtie18 (github.com/gpertea/stringtie) והוצגו באופן חזותי בדפדפן גנום.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

בידוד פרוטופלסט
פרוטוקול זה יעיל למיון פרוטופלסטים של קווי סמן שורש פלואורסצנטי A. thaliana . קווי הסמנים האלה פותחו על-ידי מיזוג של חלבונים פלואורסצנטיים עם גנים שמתבטאים באופן ספציפי בסוגי תאי מטרה, או על-ידי שימוש בקווי מלכודת משפרים (איור 1). רקמות ואיברים רבים נותחו לסוגי תאים המבטאים סמנים פלואורסצנטיים ספציפיים בצמחי מודל ובגידולים.

אוכלוסיית FACS, תאים ממוינים ו- QC ספריה
על-ידי שימוש בצמח מסוג בר כבקרה והצב...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הפרוטוקול מבוסס Smart-seq2 יכול ליצור ספריות רצף אמינות מכמה מאות תאים8. איכות חומר המוצא חיונית לדיוק ניתוח התמלול. FACS הוא כלי רב עוצמה להכנת תאים מעניינים, אך הליך זה, במיוחד השלב הפרוטו-מתמשך, חייב להיות מותאם ליישומים צמחיים. מיקרודיסקציה ללכידת לייזר (LCM) או תאים מנותחים ידנית יכולים לשמש גם כקלט25,26, כך שהפרוטוקול המסופק כאן יכול לשמש במגוון מיני צמחים וסוגי תאים עם או בלי גני סמן ידועים.

הכנת ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

הקמנו פרוטוקול זה במתקן הרב-תאי היחיד של בית הספר לחקלאות וביולוגיה, אוניברסיטת ג'יאו טונג בשנחאי, ונתמכו על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מענק מס '32070608), תוכנית שנחאי פוג'יאנג (מענק מס '20PJ1405800), ואוניברסיטת שנגחאי ג'יאו טונג (מענק מס 'Agri-X20200202, 2019TPB05).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.22 ומיקרו; מסננת mSorfa 622110
AgarYeasen70101ES76
מנתח שברים זריזיםAglient5200
ערכת DNA גמישה ברגישות גבוההAglientDNF-474-0500
Ampure XP חרוזיםBECKMANA63881
BetaineyuanyeS18046-100g
אקונומיקהמר שרירFnBn83BK20% (v/v) אקונומיקה
BSAsigma9048-46-8
CaCl2yuanyeS24109-500g
צלולאז R10יאקולט (יפן)9012-54-8
צלולאז RSYakult (יפן)9012-54-8
צינור צנטריפוגה (1.5 מ"ל)אפנדולף30121589
DNase, RNase, DNA ו-RNA רחוקים מטהרי משטחBeyotimeR0127
dNTPs (10 מ"מ)NEBN0447S
DTT (0.1 מ')
invitrogen		18090050
אתנולסינופארם ריאגנט כימי ושות', בע"מ100092680
FACSBD FACS מלודיBD-65745
FACSSonySH800S
טיפ לסינון  (1000 ומיקרו; L)Thermo ScientificTF112-1000-Q
קצה מסנן  (200 ומיקרו; L)Thermo ScientificTF140-200-Q
(10 ומיקרו; L)Thermo ScientificTF104-10-Q
(100 ומיקרו; L)Thermo ScientificTF113-100-Q
מיקרוסקופ פלואורסצנטיNikonEclipse Ni-E
מיקסר מסתובב ארבעה מימדיםKylin -BellBE-1100
Hemicellulasesigma9025-56-3
IS PCR פריימר5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG
T-3'KAPA
HiFi HotStart ReadyMix( 2X)רוש 
KClSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd7447-40-7
Macerozyme R10Yakult (יפן)9032-75-1
מעמד הפרדה מגנטיתinvitrogen12321D
מניטולאלאדין69-65-8
MESאלאדין145224948
MgCl2< / sub> yuanyeR21455-500 מ"ל
מיקרוצנטריפוגותאפנדורףצנטריפוגה 5425
מיקרו-מיני צנטריפוגהטיטאןTimi-10k
MSPhytotechM519
Nextera XT ערכת הכנת ספריית DNA illuminaFC-131-1024
oligo-dT30VN פריימר5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG
TACTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT
מכשיר TTTTTTTTTTVN-3'PCR
Thermal cyclerA24811
PectolyaseYakult (יפן)9033-35-6
קווי סמן צמחיםמרכז המניות נוטינגהאם ארבידופסיס (NASC)
Qubit 1x dsDNA HS ערכת בדיקהinvitrogenQ33231
Qubit 2.0 פלואורומטרinvitrogenQ32866
מעכב RNase Thermo ScientificEO0382
תמיסת 10977023
A400 מ"מ מניטול, 0.05% BSA , 20 מ"מ MES (pH5.7), 10 מ"מ CaCl2, 20 מ"מ תמיסת KCl
B1% (w/v) צלולאז R10, 1% (w/v) צלולאז RS, 1 %  (w/v)המיצלולאז, 0.5%  פקטוליאז ו-1%  (עם / נ) Macerozyme R10 במנה טרייה של תמיסה מסננת
453463עלי סטריליBIOTREAT
(40 ומיקרו; m )Sorfa 251100
SuperScript IV טרנסקריפטאז הפוך (200 U/µ L)מאגר invitrogen18090050
SuperScript IV (5x)מבחנה invitrogen18090050
(5 מ"ל)BD Falcon352052
צינורות PCR דקי דופן עם פקקים (0.5 מ"ל)AXYGENPCR-05-C
Triton X-100Sangon BiotechA600198-0500
TSO פריימר5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG
TACATrGrG+G-3'מערבולת
טיטאןVM-T2
קצה מסנן קצה מסנן 7958935001מים ללא RNase

מקורות

  1. Zhang, T. -Q., Chen, Y., Liu, Y., Lin, W. -H., Wang, J. -W. Single-cell transcriptome atlas and chromatin accessibility landscape reveal differentiation trajectories in the rice root. Nature Communications. 12 (1), 2053(2021).
  2. Denyer, T., et al. Spatiotemporal developmental trajectories in the Arabidopsis root revealed using high-throughput single-cell RNA sequencing. Developmental Cell. 48 (6), 840-852 (2019).
  3. Liu, Q., et al. Transcriptional landscape of rice roots at the single-cell resolution. Molecular Plant. 14 (3), 384-394 (2021).
  4. Liu, Z., et al. Global dynamic molecular profiling of stomatal lineage cell development by single-cell RNA sequencing. Molecular Plant. 13 (8), 1178-1193 (2020).
  5. Shahan, R., et al. A single-cell Arabidopsis root atlas reveals developmental trajectories in wild-type and cell identity mutants. Developmental Cell. 57 (4), 543-560 (2022).
  6. Wendrich, J. R., et al. Vascular transcription factors guide plant epidermal responses to limiting phosphate conditions. Science. 370 (6518), (2020).
  7. Carter, A. D., Bonyadi, R., Gifford, M. L. The use of fluorescence-activated cell sorting in studying plant development and environmental responses. The International Journal of Developmental Biology. 57 (6-8), 545-552 (2013).
  8. Picelli, S., et al. Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2. Nature Protocols. 9 (1), 171-181 (2014).
  9. Wang, X., He, Y., Zhang, Q., Ren, X., Zhang, Z. Direct comparative analyses of 10X genomics chromium and Smart-seq2. Genomics Proteomics Bioinformatics. 19 (2), 253-266 (2021).
  10. Serrano-Ron, L., et al. Reconstruction of lateral root formation through single-cell RNAsequencing reveals order of tissue initiation. Molecular Plant. 14 (8), 1362-1378 (2021).
  11. Hashimshony, T., et al. CEL-Seq2: Sensitive highly-multiplexed single-cell RNA-Seq. Genome Biology. 17, 77(2016).
  12. Macaulay, I. C., et al. G&T-seq: Parallel sequencing of single-cell genomes and transcriptomes. Nature Methods. 12 (6), 519-522 (2015).
  13. Angermueller, C., et al. Parallel single-cell sequencing links transcriptional and epigenetic heterogeneity. Nature Methods. 13 (3), 229-232 (2016).
  14. De Rybel, B., et al. A novel aux/IAA28 signaling cascade activates GATA23-dependent specification of lateral root founder cell identity. Current Biology. 20 (19), 1697-1706 (2010).
  15. Duncombe, S. G., Barnes, W. J., Anderson, C. T. Imaging the delivery and behavior of cellulose synthases in Arabidopsis thaliana using confocal microscopy. Methods in Cell Biology. 160, 201-213 (2020).
  16. Levy, S. E., Myers, R. M. Advancements in next-generation sequencing. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 17 (1), 95-115 (2016).
  17. Ooi, C. C., et al. High-throughput full-length single-cell mRNA-seq of rare cells. PLoS One. 12 (11), e0188510(2017).
  18. Pertea, M., Kim, D., Pertea, G. M., Leek, J. T., Salzberg, S. L. Transcript-level expression analysis of RNA-seq experiments with HISAT, StringTie and Ballgown. Nature Protocols. 11 (9), 1650-1667 (2016).
  19. Tsyganov, K., Perry, A., Archer, S., Powell, D. RNAsik: A Pipeline for complete and reproducible RNA-seq analysis that runs anywhere with speed and ease. Journal of Open Source Software. 3, 583(2018).
  20. Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biology. 15 (12), 550(2014).
  21. Kamiya, T., et al. The MYB36 transcription factor orchestrates Casparian strip formation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (33), 10533-10538 (2015).
  22. Zhang, Y., et al. Two types of bHLH transcription factor determine the competence of the pericycle for lateral root initiation. Nature Plants. 7 (5), 633-643 (2021).
  23. Haecker, A., et al. Expression dynamics of WOX genes mark cell fate decisions during early embryonic patterning in Arabidopsis thaliana. Development. 131 (3), 657-668 (2004).
  24. Chen, Q., et al. Auxin overproduction in shoots cannot rescue auxin deficiencies in Arabidopsis roots. Plant Cell Physiol. 55 (6), 1072-1079 (2014).
  25. Nichterwitz, S., et al. Laser capture microscopy coupled with Smart-seq2 for precise spatial transcriptomic profiling. Nature Communications. 7, 12139(2016).
  26. Long, J., et al. Nurse cell--derived small RNAs define paternal epigenetic inheritance in Arabidopsis. Science. 373 (6550), (2021).
  27. Gutzat, R., et al. Arabidopsis shoot stem cells display dynamic transcription and DNA methylation patterns. EMBO Journal. 39 (20), e103667(2020).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

בידוד תאי צמחיםריצוף תא בודדמיון תאים מופעל פלואורסצנציהתאי שורש של Arabidopsisמיון פרוטופלסטיםריצוף RNAפרוטוקול Smart-seq2הטרוגניות של סוגי תאיםאנליזת מולטי-אומיקה
בידוד וניתוח שעתוק של סוגי תאי צמח
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.