מאמר שיטה

ייצור ותחזוקה של תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי פרימטים שמקורם בשתן

DOI:

10.3791/64922

⸱

28 ביולי 2023

 ,  ,  ,  , 
1Faculty of Biology, Ludwig Maximilian University of Munich, 2Institute for the Advanced Study of Human Biology, Kyoto University, 3Hakubi Center, Kyoto University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה לבידוד, הרחבה ותכנות מחדש של תאים אנושיים ולא אנושיים שמקורם בשתן של פרימטים לתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs), כמו גם הוראות לתחזוקה ללא הזנה של תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs) שנוצרו.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

גישות חוצות מינים החוקרות תאי גזע פלוריפוטנטיים של פרימטים ונגזרותיהם חיוניות להבנה טובה יותר של המנגנונים המולקולריים והתאיים של מחלות, התפתחות ואבולוציה. כדי להפוך תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי פרימטים (iPSCs) לנגישים יותר, מאמר זה מציג שיטה לא פולשנית ליצירת תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים אנושיים ולא אנושיים מתאים שמקורם בשתן, ותחזוקתם באמצעות שיטת תרבית ללא מזין.

ניתן לדגום את השתן מסביבה לא סטרילית (למשל, הכלוב של החיה) ולטפל בקוקטייל אנטיביוטי רחב טווח במהלך תרבית תאים ראשונית כדי להפחית את הזיהום ביעילות. לאחר התפשטות התאים שמקורם בשתן, iPSCs נוצרים על ידי שיטת התמרה שונה של מערכת וקטור וירוס סנדאי זמינה מסחרית. מושבות iPSC ראשונות עשויות להיות גלויות כבר לאחר 5 ימים, וניתן לקטוף אותן לאחר 10 ימים לכל המוקדם. מעבר גושים שגרתי עם חיץ דיסוציאציה ללא אנזימים תומך בפלוריפוטנציה של תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים שנוצרו במשך יותר מ-50 מעברים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השוואות גנומיות של פרימטים אנושיים ולא אנושיים (NHPs) חיוניות להבנת ההיסטוריה האבולוציונית שלנו והאבולוציה של תכונות ספציפיות לבני אדם1. בנוסף, השוואות אלה מאפשרות להסיק את התפקוד על ידי זיהוי רצפי דנ"א שמורים2, למשל, כדי לתעדף וריאנטים הקשורים למחלה3. השוואות של פנוטיפים מולקולריים כגון רמות ביטוי גנים חיוניות כדי לפרש טוב יותר השוואות גנומיות ולגלות, למשל, הבדלים פנוטיפיים תאיים. יתר על כן, יש להם - בדומה להשוואות ברמת הדנ"א - פוטנציאל להסיק רלוונטיות תפקודית, ומכאן לפרש טוב יותר שונות רלוונטית מבחינה רפואית בתוך בני אדם4. שילוב נתונים פנוטיפיים מולקולריים מקיפים במחקרים ....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הליך ניסויי זה אושר על ידי הוועדה האתית האחראית לניסויים בבני אדם (20-122, Ethikkommission LMU München). כל הניסויים בוצעו בהתאם להנחיות ולתקנות הרלוונטיות.
הערה: יש לקבל אישור מהוועדה האתית המתאימה לפני תחילת ניסויים העוסקים בדגימות אנושיות ודגימות NHP. כל הליכי הניסוי חייבים להתבצע בהתאם להנחיות ולתקנות הרלוונטיות. כל אחד מהשלבים הבאים צריך להתבצע בטכניקה סטרילית בארון בטיחות ביולוגי. ניתן למצוא את כל הרכבי החיץ והמדיה בטבלה משלימה S1. ודא שכל המדיה מחוממת לטמפרטורת החדר (22 ° C) לפני הוספתה לתאים. כל שלב בצנטריפוגה צריך להתבצע בטמפרטורת החדר, אלא אם צוין אחרת.

1. בידוד תאים מדגימות שתן

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בעת בידוד תאים משתן אנושי ושתן NHP, ניתן לזהות סוגים שונים של תאים ישירות לאחר הבידוד. תאי קשקש, כמו גם תאים עגולים קטנים יותר, מופרשים עם השתן; שתן נשי מכיל הרבה יותר תאי קשקש מאשר שתן זכרי (איור 1B - יום 0; איור משלים S1). לאחר 5 ימים של תרבית בתווך שתן ראשוני, ניתן לראות את התאים המתרבים הדבקים הראשונים (איור 1A,B - יום 5). בשלב זה, מחצית התווך מוחלף בתווך התפשטות REMC מדי יום, עד להופעת המושבות הראשונות. בערך ביום ה-13 התאים.......

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

iPSCs הם סוגי תאים יקרי ערך מכיוון שהם מאפשרים יצירה של סוגי תאים שאינם נגישים אחרת במבחנה. מכיוון שחומרי המוצא לתכנות מחדש, למשל, פיברובלסטים אינם זמינים בקלות מכל מיני הפרימטים, מאמר זה מציג פרוטוקול ליצירת iPSCs מתאים שמקורם בשתן. תאים אלה יכולים להתקבל באופן לא פולשני, אפילו מדגימות שתן של פרימטים לא סטריליים, על ידי השלמת מדיום התרבית עם אנטיביוטיקה רחבת טווח.

כמה שלבים קריטיים בפרוטוקול שווים דיון נוסף. ראשית, בעת בידוד תאים משתן לא סטרילי, חשוב להשלים את המדיום עם מגיב מיקרוביא.......

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על-ידי DFG EN 1093/5-1 (מספר פרויקט מספר 458247426). M.O. נתמך על ידי JSPS Overseas Research Fellowship. כל הדמויות נוצרו עם BioRender.com. ציטומטריית זרימה בוצעה בעזרת ציטומטריית זרימה של מתקן הליבה במרכז הביו-רפואי במינכן. ברצוננו להודות למאקוטו שידה ולטומויו מוטו מ-ASHBi, אוניברסיטת קיוטו, על התמיכה בווידיאוגרפיה.

....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Accumax&Trade; פתרון ניתוק תאים (פתרון ניתוק)Sigma-AldrichSCR006
Amphotericin B-SolutionMerckA2941-100ML
אנטי אנושי TRA-1-60 נוגדן עכבר דילול תאי גזע60064: 1/200
נוגדן מצומד PE TRA-1-60 אנטי אנושי Miltenyi Biotec130-122-965דילול: 1/50
Bambanker™ (מדיום הקפאת תאים)Nippon GeneticsBB01
סרום בקר אלבומין (BSA)Sigma-AldrichA3059-100G
צלחת תרבית תאים, 12 בארות CELLSTARGreiner BIO-ONE665180
Countess™ II מונה תאים אוטומטיThermo Fisher ScientificAMQAX1000
CryoKing® צינורות 1.5 מ"ל עם ברקוד דו-ממדי (Cryotubes)Sued-Laborbedarf52 95-0213ניתן להשתמש בסוגים שונים של Cryotubes להקפאה. לצינורות הברקוד הדו-ממדיים יש יתרון שניתן לאחסן את המידע לדוגמה במסד נתונים עם מידע ייחודי על שפופרות.
CytoTune™ EmGFP Sendai Fluorencence Reporter (GFP Sendai virus)Thermo Fisher ScientificA16519
CytoTune™-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit (Sendai virus reprogramming kit)Thermo Fisher ScientificA16518
DAPI 4',6-Diamidine-2'-phenylindole dihydrochlorideSigma-Aldrich10236276001
DMEM High גלוקוזTH. GeyerL0102
DMEM/F12 w L-גלוטמיןפישר סיינטיפיק15373541
חמור נגד עכבר IgG (H+L) נוגדן משני בעל ספיחה צולבת גבוהה, Alexa Fluor™ 488Thermo Fisher ScientificA-21202דילול: 1/500
חמור נגד ארנב IgG (H+L) נוגדן משני בעל ספיחה צולבת גבוהה, Alexa Fluor™ 594Thermo Fisher ScientificA-21207דילול: 1/500
DPBS ללא סידן ללא מגנזיוםTH. GeyerL0615-500
EpCAM נוגדן ארנב רב-שבטי רקומביננטי (22 HCLC)דילול 710524 מדעי של תרמו פישר: 1/500
חומצה אתילנדיאמין טטראצטית (EDTA)קארל רוטCN06.3
צינור פלקון 15 מ"ל גריינר תחתון חרוטיBIO-ONE188271-N
צינור פלקון 50 מ"ל גריינר תחתון חרוטיBIO-ONE227261
סרום בקר עוברי, מוסמך, מושבת בחום, ברזיל (FBS)Thermo Fisher Scientific10500064
FlowJo V10.8.2FlowJo 
ג'לטין מעור חזירSigma-AldrichG1890-1KG
Geltrex ™ ללא LDEV, מוסמך hESC, גורם גדילה מופחת מטריצת ממברנת מרתףThermo Fisher ScientificA1413301
GlutaMAX ™ תוסףThermo Fisher Scientific35050038
Heracell™ חממת CO2 240iFisher Scientific16416639
Heraeus HeraSafe ארון בטיחותKendro51017905
Human EGF, בדרגת פרימיוםMiltenyi Biotec130-097-749
ImageJ פיג'יגרסה 2.9.0
MEM תמיסת חומצות אמינו לא חיוניות (100X)Thermo Fisher Scientific11140035
צינור מיקרוצנטריפוגה PP, 1.5 מ"לNerbe Plus04-212-1000
מיקרוסקופ ניקון ליקוי חמה TE2000-SNikonTE2000-S
עכבר נוגדן נגד חלבון עובריאלפא R& דילול MAB1368 מערכות D: 1/100
עכבר אנטי-אלפא-שריר חלק נוגדן אקטיןR& D SystemsMAB1420דילול: 1/100
עכבר אנטי-בטא-III נוגדן טובוליןR& D SystemsMAB1195דילול: 1/100
mTeSR™ 1STEMCELL Technolgies85850
Nanog (D73G4) XP Rabbit mAb טכנולוגיית איתות תאים4903Sדילול: 1/400
נורמוקור וסחר; (מגיב אנטי-מיקרוביאלי)נוגדן ארנב Invivogenant-noc
Oct-4 טכנולוגיית איתות תאיםדילול 2750S: 1/400
פרפורמלדהיד (PFA)סיגמא-אולדריץ'441244-1KG
פניצילין-סטרפטומיצין (10.000 יח'/מ"ל) (PS)Thermo Fisher Scientific15140122מכילה 100 U/mL פניצילין ו-100 ומיקרו; גרם/מ"ל סטרפטומיצין.
רקומביננטי אנושי FGF-בסיסיPeproTech100-18B
רקומביננטי אנושי PDGF-ABPeproTech100-00AB
צנטריפוגה שולחנית מקוררתSIGMA 4-16KS
תא אפיתל כליה בסיסי בינוניATCCPCS-400-030
ערכת צמיחת תאי אפיתל כליהATCCPCS-400-040
Sox2 (L1D6A2) עכבר mAb #4900טכנולוגיית איתות תאים4900Sדילול: 1/400
SSEA4 (MC813) עכבר mAbNEB4755Sדילול: 1/500
StemFit® Basic02Nippon Genetics3821.00הייצור של מדיום זה הופסק, השתמש במקום זאת ב-StemFit Basic04CT עבור קווי תאים אנושיים או ב-StemFit Basic03 עבור פרימטים שאינם אנושיים.
טריטון X-100 סיגמא-אולדריץ'T8787-50 מ"ל
TrypLE™ Select Enzyme (1x), ללא פנול אדום (Dissociation Enzyme)ThermoFisher Scientific12563011
Waterbath Precision GP 05Thermo Fisher ScientificTSGP05
Y-27632, מלח דיהידרוכלוריד (מעכב סלעים)BiozolBYT-ORB153635
מאגרלהרכב ראה את התוספת טבלה S1
מאגרלהרכב, ראה את הטבלה המשלימה S1
מדיוםלהרכב, ראה את הטבלה המשלימה S1
מדיוםלהרכב, ראה את הטבלה המשלימה S1
מדיוםלהרכב, ראה את הטבלה המשלימה S1
מדיום יצירת PSCלהרכב, עיין בטבלה המשלימה S1
מאגרלהרכב, עיין בטבלה המשלימה S1
663441תערובת פניצילין-סטרפטומיצין של דילול נוגדנים חוסם REMC שתן ראשוני תרבית PSC שטיפת שתן

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pääbo, S. The human condition-a molecular approach. Cell. 157 (1), 216-226 (2014).
  2. Zoonomia Consortium, A comparative genomics multitool for scientific discovery and conservation. Nature. 587 (7833), 240-245 (2020).
  3. Kircher, M., et al.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

t iPSCs

מאמרים קשורים