מאמר שיטה

מדידת קוטר כלי הדם ברשתית מתמונות אנגיוגרפיה פלואורסצנטית של עכבר

DOI:

10.3791/64964

⸱

19 במאי 2023

 ,  , 
1Department of Physiology, Biomedical Center, Faculty of Medicine, University of Iceland, 2Department of Ophthalmology, National University Hospital

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כלי דם ברשתית עכבר מעניינים במיוחד בהבנת המנגנונים של היווצרות תבניות כלי דם. פרוטוקול זה מודד באופן אוטומטי את הקוטר של כלי הדם ברשתית העכבר מתמונות פונדוס אנגיוגרפיה פלואורסצנטית במרחק קבוע מהדיסק האופטי.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

חשוב ללמוד את התפתחות כלי הדם ברשתית ברטינופתיות שבהן צמיחת כלי דם חריגה יכולה בסופו של דבר להוביל לאובדן ראייה. מוטציות בגן גורם השעתוק הקשור למיקרופתלמיה (Mitf) מראות היפופיגמנטציה, מיקרופתלמיה, ניוון רשתית ובמקרים מסוימים עיוורון. הדמיה In vivo של רשתית העכבר באמצעים לא פולשניים חיונית לחקר העיניים. עם זאת, בהתחשב בגודלו הקטן, הדמיית פונדוס עכבר היא קשה ועשויה לדרוש כלים מיוחדים, תחזוקה והכשרה. במחקר זה פיתחנו תוכנה ייחודית המאפשרת ניתוח של קוטר כלי הדם ברשתית בעכברים באמצעות תוכנה אוטומטית הכתובה ב-MATLAB. צילומי פונדוס התקבלו באמצעות מערכת מצלמות פונדוס מסחרית לאחר הזרקה תוך צפקית של תמיסת מלח פלואורסצאין. התמונות שונו כדי לשפר את הניגודיות, ותוכנת MATLAB אפשרה לחלץ את קוטר כלי הדם הממוצע באופן אוטומטי במרחק מוגדר מראש מהדיסק האופטי. השינויים בכלי הדם נבדקו בעכברי בר ובעכברים עם מוטציות שונות בגן Mitf על ידי ניתוח קוטר כלי הדם ברשתית. תוכנת MATLAB הכתובה בהתאמה אישית שפותחה כאן היא מעשית, קלה לשימוש, ומאפשרת לחוקרים לנתח את הקוטר הממוצע ואת הקוטר הכולל הממוצע, כמו גם את מספר כלי הדם מכלי הדם ברשתית העכבר, בנוחות ובאמינות.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ייתכן שמיטת כלי הדם הנחקרת ביותר בגוף היא כלי הדם ברשתית. עם תחכום טכני הולך ומשתפר, כלי דם ברשתית מצולמים בקלות בחולים חיים ומשמשים בתחומי מחקר רבים1. בנוסף, כלי הדם ברשתית העכבר במהלך הפיתוח הוכיחו את עצמם כמערכת מודל יעילה מאוד למחקר בביולוגיה הבסיסית של צמיחת כלי הדם. המטרה העיקרית של כלי הדם ברשתית היא לספק לחלק הפנימי של הרשתית תמיכה מטבולית באמצעות רשת נימים למינרית המחלחלת לרקמה העצבית2. עם זאת, מצב הרשתית, וכתוצאה מכך כל תפקוד לקוי או ניוון, יכול להיות בעל השפעות משמעותיות הן על התפצלויות כלי הדם ברשתית והן על קוטר העורקים, מה שמדגים יחסי גומלין בין תאי הרשתית לבין כלי הדם 3,4. ידוע כי מחלות עיניים רבות, כולל רטינופתיה של פגות (ROP), רטינופתיה סוכרתית (DR), ניוון מקולרי תלוי גיל (AMD), גלאוקומה, וניאווסקולריזציה של הקרנית, יכולים לגרום לאנגיוגנזה עינית לא תקינה5. במקרה של כלי הדם ברשתית, מודלים עכבריים של ניוון רשתית מציגים לעתים קרובות שינויים דומים לאלה שנצפו במחלות כלי דם אנושיות 6,7. משפחת הסופרגנים Myc של גורמי שעתוק סליל-לולאה-סליל-רוכסן כוללת את הגן גורם שעתוק הקשור למיקרופתלמיה (Mitf) המתבטא באפיתל פיגמנט הרשתית (RPE)8,9,10.

איברים רבים, כולל העין, האוזן, מערכת החיסון, מערכת העצבים המרכזית, הכליות, העצם והעור, הוכחו כמוסדרים על ידי Mitf 9,11,12,13.גילינו כי המבנה והתפקוד של RPE מושפעים בעכברים הנושאים מוטציות שונות בגן Mitf, וכתוצאה מכך במקרים מסוימים של ניוון רשתית, ובסופו של דבר, אובדן ראייה10. לאחרונה הוכח כי מספר כלי הדם וקוטר כלי הדם שונים באופן משמעותי בין מוטנט Mitf לבין עכברי ברמסוג 14. חוקרים ורופאים יכולים כעת לכמת במדויק את כלי הדם ברשתית in vivo עקב התפתחויות הדמיה ברשתית. מאז 1800, חוקרים ורופאים ניצלו את היתרון של הדמיה של כלי הדם ברשתית, ואנגיוגרפיה פלואורסצאין (FA) הראתה הן זרימת דם ברשתית והן השפלה של מחסום הדם-רשתית15.

מאמר זה מדגים כיצד לנתח את קוטר כלי הדם ברשתית מתמונות FA של עכבר באמצעות קוד שנכתב בהתאמה אישית בתוכנת MATLAB.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל הניסויים אושרו על ידי רשות המזון והווטרינריה האיסלנדית (רישיון MAST מס '2108002). כל המחקרים בבעלי חיים נערכו על פי הצהרת האגודה לחקר הראייה והעיניים (ARVO) לשימוש בבעלי חיים בחקר העיניים והראייה. במחקר זה נעשה שימוש בעכברים זכרים ונקבות C57BL/6J ו-Mitfmi-vga9/+ . עכברי C57BL/6J (n = 7) שימשו כבקרה. סוגי הבר הושגו באופן מסחרי (ראו טבלת חומרים), אך כל העכברים המוטנטים (n = 7) גודלו וגודלו במתקנים לבעלי חיים במרכז הביו-רפואי באוניברסיטת איסלנד. במחקר הנוכחי נעשה שימוש בבעלי חיים בני 3 חודשים; עם זאת, הפרוטוקול חל גם על בעלי חיים בני חודש ומעלה.

1. הכנה ניסיונית

  1. הכינו את תערובת ההרדמה. יש ליטול אמפולה אחת של תמיסת מלאי קטמין במינון 2 מ"ל (25 מ"ג/מ"ל) ותמיסת מלאי קסילזין בנפח 250 מ"ל (2%) להכנת תמיסת עבודה של תערובת קטמין/קסילזין (25 מ"ג/מ"ל קטמין ו-20 מ"ג/מ"ל קסילזין) (ראו טבלת חומרים).
  2. להרדים את העכבר בהזרקה תוך צפקית של תערובת קטמין/קסילזין, עם נפח נוזל הגדול פי ארבעה ממשקל גופו של העכבר; לדוגמה, עכבר במשקל 20 גרם זקוק ל-35 מיקרוליטר של תמיסת עבודה של קסילזין/קטמין כדי לקבל מנת עבודה של תערובת קסילזין (4 מ"ג/ק"ג משקל גוף) וקטמין (40 מ"ג/ק"ג משקל גוף).
  3. להרחיב את האישונים עם טיפת עיניים של 10% phenylephrine hydrochloride ו 1% tropicamide מיד לאחר ההרדמה.
  4. חכו עד שבעל החיים מורדם לחלוטין ואישוניו מורחבים באופן נרחב.
  5. הכינו תמיסת מלח פלואורסצאין. הוסף 9 מ"ל של מלוחים חוצצי פוספט (PBS; 1x) ל- 1 מ"ל של תמיסת פלואורסצאין (ריכוז מלאי של 100 מ"ג/מ"ל) (ראה טבלת חומרים). פתרון העבודה בריכוז הסופי הוא 10 מ"ג / מ"ל.

2. הדמיית In vivo של כלי דם ברשתית באמצעות מערכת הדמיית רשתית מכרסמים

  1. יש לתת תמיסת עבודה פלואורסצאין תוך צפקית (5 מיקרוליטר/גרם משקל גוף) לחיה המורדמת.
  2. יש למרוח טיפה של ג'ל מתילצלולוז 2% על פני הקרנית ולאחר מכן להניח את בעל החיים על שלב המיקום של מערכת ההדמיה (ראה טבלת חומרים).
  3. מקם את עדשת מצלמת ההדמיה של הרשתית כדי לגעת בקרנית העכבר באופן ישיר ועדין. כדי למקם את ראש עצב הראייה באמצע שדה הראייה, כוונן מעט את היישור.
  4. עברו לערוץ הפלואורסצנטי הירוק במצלמת הפונדוס.
  5. התמקדו בכלי הרשתית כדי לצלם תמונות.
  6. כדי למצוא את נקודת הזמן האידיאלית, צלם מספר תמונות ב- 1, 3, 5 ו- 10 דקות (אך לא יותר מ -10 דקות) לאחר הזרקת פלואורסצאין.
    הערה: יש להשלים את טיפול FA תוך 10 דקות, מכיוון שלאחר זמן זה הפלואורסצאין עלול להיות מפוזר מדי, וכלי הדם הופכים לבלתי ניתנים לגילוי.
  7. עם השלמת ההדמיה, כאשר העכבר עדיין מורדם, להרדים אותו על ידי נקע צוואר הרחם.

3. ניתוח קוטר כלי הדם ברשתית

  1. פתחו את תוכנית MATLAB (ראו טבלת חומרים).
  2. הורד ושמור את הקוד "fundusDiameter.m" (ראה קובץ קידוד משלים 1, קובץ קידוד משלים 2 וקובץ קידוד משלים 3).
  3. פתח את התיקיה שבה נשמר הקוד. גררו את הקוד ושחררו אותו מעל התיקייה הנוכחית ב-MATLAB.
  4. גררו ושחררו את תמונת ה-FFA (תמונת אנגיוגרפיה פלואורסצנטית פונדוס) או תמונות שברצונכם לנתח בתיקייה הנוכחית ב-MATLAB .
  5. לחצו על הכלי הפעלה מסרגל הכלים MATLAB.
  6. יופיע חלון מוקפץ. כתוב את שם הקובץ של התמונה המעניינת בתיבה הזן שם קובץ ולחץ על אישור.
    הערה: אל תשנה או תשנה את שאר הפרמטרים.
  7. בחר את מרכז הדיסק האופטי ולאחר מכן בחר את קצה הדיסק האופטי. התוכנה מחשבת כעת את עוצמת הפיקסלים בתמונות פונדוס העכבר במעגל עם רדיוס כפול מזה של הדיסק האופטי, בכיוון השעון ממרכז הדיסק האופטי (איור 1).
  8. לאחר מכן, ודא שהתוכנה משרטטת את הקוטר הממוצע של כלי השיט (בפיקסלים) של כל כלי בפונדוס כפונקציה של מספר כלי השיט (איור 2).
  9. לאחר מכן, ודא שהתוכנה מעבירה את נתוני המדידה עבור כל כלי למסמך Excel, שבו מחושבים הממוצע, החציון וסטיית התקן של ערכים אלה (טבלה 1 וטבלה 2).
  10. העבר את הערכים מטבלת התוצאות לתוכנית גיליון אלקטרוני על-ידי בחירת כל הערכים בטבלה. הדבק את הערכים בגיליון האלקטרוני.
  11. שרטט את הגרפים ובצע ניתוח סטטיסטי באמצעות הנתונים שהודבקו בתוכנית גיליון אלקטרוני לפי בחירתך (ראה טבלת חומרים).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

איור 1 מראה את התהליך המשמש לניתוח כלי הדם ברשתית, אשר מוחל על תמונות FFA של עכברים מכל העכברים שנבדקו. רדיוס גדול פי שניים מהדיסק האופטי משמש למדידת עוצמת פיקסלים בכיוון מעגלי בכיוון השעון ממרכז הדיסק האופטי. הוא מסמן פיקסלים עם נקודת התחלה או סיום כאשר הוא נתקל בנקודות מעל ומתחת לסף שצוין על-ידי המשתמש, בהתאמה. זה חוזר על עצמו 30 פעמים, בכל פעם הולך קצת יותר רחוק ממרכז הדיסק האופטי. תמונות FFA מצולמות 5 דקות לאחר הזרקת פלואורסצאין (איור 1A

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המאמר הנוכחי הוא הראשון שמציג שיטה לניתוח קוטר כלי הדם ברשתית וכלי הדם ברשתית מתמונות FA של עכברים. מכיוון שנעשה שימוש רק בהדמיית פונדוס כדי ללכוד תמונות של כלי הדם ברשתית, לשיטה יש מספר חסרונות, אחד מהם הוא שניתן להסיק רק שינויים בשכבות השטחיות של כלי הדם ברשתית בעכברים שנבדקו במחקר זה; עדיין לא ידוע על הבדלים בשכבות העמוקות יותר.

שיטת ניתוח תמונה ייחודית של טומוגרפיה קוהרנטית אופטית (OCTA) באמצעות מעקב כלי דם אוטומטי וקוטר כלי דם הוצגה16. עם זאת, שיטה זו דורשת מדידת ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים כי לא קיימים אינטרסים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי מענק פוסט-דוקטורט מקרן המחקר האיסלנדית (217796-052) (A.G.L.) ומקרן הזיכרון Helga Jónsdóttir and Sigurlidi Kristjánsson Memorial Fund (A.G.L ו-T.E). המחברים מודים לפרופ' Eiríkur Steingrímsson על אספקת העכברים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
1% טרופיקמיד (Mydriacyl)Alcon Inc Laboratoriesסוכן Mydriatic
2% MethocelOmniVision Eye Careהידרוקסיפרופריל מתיל צלולוז ג'ל
C57BL/6JJackson Laboratory000664עכברים מסוג פרא
Excel עבור Microsoft 365Microsoft Incחבילת תוכנה
פלואורסצאין נתרן מלחסיגמא-אולדריץ'28803-100Gאנגיוגרפיה פלואורסצנטית
Matlab 8.0The MathWorks, Inc.חבילת תוכנה
Micron IV מצלמת פונדוס מכרסמיםPhoenix-Micron40-2200צילום פונדוס
פנילפרין 10% w/vBausch & LombMydriatic agent
Phosphate Buffered Saline - 100 טבליותGibco18912-014דילול
Sigmaplot 13Jandel חבילת תוכנה מדעית
S-קטמין, 25 מ"ג/מ"לפייזר בע"מ.PAA104470הרדמה IP

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cheung, C. Y., Ikram, M. K., Chen, C., Wong, T. Y. Imaging retina to study dementia and stroke. Progress in Retinal and Eye Research. 57, 89-107 (2017).
  2. Selvam, S., Kumar, T., Fruttiger, M. Retinal vasculature development in health and disease. Progress in Retinal and Eye Research. 63, 1-19 (2018).
  3. Ma, Y., et al. Quantitative analysis of retinal vessel attenuation in eyes with retinitis pigmentosa. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (7), 4306-4314 (2012).
  4. Eysteinsson, T., Hardarson, S. H., Bragason, D., Stefansson, E. Retinal vessel oxygen saturation and vessel diameter in retinitis pigmentosa. Acta Ophthalmologica. 92 (5), 449-453 (2014).
  5. Al-Latayfeh, M., Silva, P. S., Sun, J. K., Aiello, L. P. Antiangiogenic therapy for ischemic retinopathies. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (6), 006411(2012).
  6. Wang, S., Villegas-Perez, M. P., Vidal-Sanz, M., Lund, R. D. Progressive optic axon dystrophy and vacuslar changes in rd mice. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41 (2), 537-545 (2000).
  7. Liu, H., et al. Photoreceptor cells influence retinal vascular degeneration in mouse models of retinal degeneration and diabetes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (10), 4272-4281 (2016).
  8. Steingrimsson, E., Copeland, N. G., Jenkins, N. A. Melanocytes and the microphthalmia transcription factor network. Annual Review of Genetics. 38, 365-411 (2004).
  9. Arnheiter, H. The discovery of the microphthalmia locus and its gene. Mitf. Pigment Cell & Melanoma Research. 23 (6), 729-735 (2010).
  10. Garcia-Llorca, A., Aspelund, S. G., Ogmundsdottir, M. H., Steingrimsson, E., Eysteinsson, T. The microphthalmia-associated transcription factor (Mitf) gene and its role in regulating eye function. Scientific Reports. 9 (1), 15386(2019).
  11. Bharti, K., Liu, W., Csermely, T., Bertuzzi, S., Arnheiter, H. Alternative promoter use in eye development: the complex role and regulation of the transcription factor MITF. Development. 135 (6), 1169-1178 (2008).
  12. Lu, S. Y., Li, M., Lin, Y. L. Mitf induction by RANKL is critical for osteoclastogenesis. Molecular Biology of the Cell. 21 (10), 1763-1771 (2010).
  13. Pillaiyar, T., Manickam, M., Jung, S. H. Recent development of signaling pathways inhibitors of melanogenesis. Cellular Signalling. 40, 99-115 (2017).
  14. Danielsson, S. B., Garcia-Llorca, A., Reynisson, H., Eysteinsson, T. Mouse microphthalmia-associated transcription factor (Mitf) mutations affect the structure of the retinal vasculature. Acta Ophthalmologica. 100 (8), 911-918 (2022).
  15. Burns, S. A., Elsner, A. E., Gast, T. J. Imaging the retinal vasculature. Annual Review of Vision Science. 7, 129-153 (2021).
  16. Wei, W., et al. Automated vessel diameter quantification and vessel tracing for OCT angiography. Journal of Biophotonics. 13 (12), e202000248(2020).
  17. Salas, M., et al. Compact akinetic swept source optical coherence tomography angiography at 1060 nm supporting a wide field of view and adaptive optics imaging modes of the posterior eye. Biomedical Optics Express. 9 (4), 1871-1892 (2018).
  18. Albanna, W., et al. Non-invasive evaluation of neurovascular coupling in the murine retina by dynamic retinal vessel analysis. PLoS One. 13 (10), e0204689(2018).
  19. Moult, E. M., et al. Evaluating anesthetic protocols for functional blood flow imaging in the rat eye. Journal of Biomedical Optics. 22 (1), 16005(2017).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

MATLAB

מאמרים קשורים