מאמר שיטה

עריכת בסיס יעילה ללא PAM עבור דגי זברה מידול של מחלות גנטיות אנושיות עם zSpRY-ABE8e

DOI:

10.3791/64977

⸱

17 בפברואר 2023

 ,  ,  ,  ,  , 
1Key Laboratory of Brain, Cognition and Education Science, Ministry of Education, 2Institute for Brain Research and Rehabilitation, Guangdong Key Laboratory of Mental Health and Cognitive Science, South China Normal University, 3Institute of Modern Aquaculture Science and Engineering, Guangdong Provincial Engineering Technology Research Center for Environmentally Friendly Aquaculture, Guangdong Provincial Key Laboratory for Healthy and Safe Aquaculture, School of Life Sciences, South China Normal University, 4Department of Pathology, Guangdong Provincial People's Hospital, Guangdong Academy of Medical Sciences

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר כיצד לבצע עריכה יעילה של בסיס אדנין ללא הגבלת PAM כדי לבנות מודל מדויק של מחלת דגי זברה באמצעות zSpRY-ABE8e.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טכנולוגיית CRISPR/Cas9 הגדילה את ערכם של דגי זברה למידול מחלות גנטיות אנושיות, חקר פתוגנזה של מחלות וסינון תרופות, אך מגבלות המוטיב הסמוך של פרוטוספייסר (PAM) מהוות מכשול עיקרי ליצירת מודלים מדויקים של בעלי חיים של הפרעות גנטיות אנושיות הנגרמות על ידי גרסאות של נוקלאוטידים בודדים (SNVs). עד כה, כמה גרסאות SpCas9 עם תאימות PAM רחבה הראו יעילות בדגי זברה. היישום של עורך בסיס אדנין בתיווך SpRY (ABE), zSpRY-ABE8e, ו-gRNA שעבר שינוי סינתטי בדגי זברה איפשר המרה יעילה של בסיס אדנין-גואנין ללא הגבלת PAM. מתואר כאן פרוטוקול לעריכה יעילה של בסיס אדנין ללא הגבלת PAM בדגי זברה באמצעות zSpRY-ABE8e. על ידי הזרקת תערובת של zSpRY-ABE8e mRNA ו-gRNA מהונדס באופן סינתטי לעוברים של דגי זברה, נבנה מודל מחלת דגי זברה עם מוטציה מדויקת המדמה אתר פתוגני של גורם ההתבגרות של הריבוזום TSR2 (tsr2). שיטה זו מספקת כלי רב ערך לביסוס מודלים מדויקים של מחלות לחקר מנגנוני מחלה וטיפולים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

וריאנטים חד-נוקלאוטידים (SNVs) הגורמים למוטציות שגויות או שטויות הם המקור הנפוץ ביותר למוטציות בגנום האנושי1. כדי לקבוע אם SNV מסוים הוא פתוגני, ולשפוך אור על הפתוגנזה שלו, נדרשים מודלים מדויקים של בעלי חיים2. דגי זברה הם מודלים טובים למחלות אנושיות, המציגים רמה גבוהה של הומולוגיה פיזיולוגית וגנטית עם בני אדם, מחזור התפתחותי קצר ויכולת רבייה חזקה, המהווה יתרון למחקר במאפיינים ומנגנונים פתוגניים, כמו גם לבדיקת תרופות3.

מערכת CRISPR/Cas9 (ראשי תיבות של Clustered regular interspaced short palindromic repeats) מיושמת באופן נרחב בעריכת גנום של מינים שונים, כולל דגי זברה4. בעזרת הנחיית gRNA, מערכת CRISPR/Cas9 יכולה ליצור שברים דו-גדיליים של DNA (DSB) באתר המטרה, אשר לאחר מכן מאפשרים החלפה של בסיס יחיד באמצעות שילוב מחדש של אתר המטרה עם תבניות DNA של תורם באמצעות מסלול תיקון מכוון הומולוגיה (HDR). עם זאת, היעילות של שיטת החלפת בסיס זו נמוכה למדי מכיוון שתהליך תיקון הדנ"א התאי מתבצע בעיקר על ידי מסלול הצטרפות קצה לא הומולוגי (NHEJ), המלווה בדרך כלל במוטציות החדרה ומחיקה (indel)5. למרבה המזל, טכנולוגיית עריכה חד-בסיסית מבוססת CRISPR/Cas9 מקלה באופן משמעותי על בעיה זו באמצעות עורכי בסיס, המאפשרים עריכה יעילה יותר בבסיס יחיד מבלי לגרום ל-DSB. שני סוגים עיקריים של עורכי בסיס, עורכי בסיס אדנין (ABEs) ועורכי בסיס ציטוזין (CBEs), פותחו כדי ליישם עריכת החלפת בסיס עבור A· T עד G· C ו- C·G עד T· A, בהתאמה 6,7,8,9,10,11. ארבעת הסוגים האלה של תחליפי בסיס מכסים 30% מהגרסאות הפתוגניות האנושיות12. שני סוגי עורכי הבסיס, כולל PmCDA1, מערכת BE, CBE4max, ABE7.10 ו-ABE8e, דווחו כעובדים בדגי זברה, כאשר BE4max ו-ABE8e דווחו במיוחד כבעלי פעילות עריכה גבוהה 13,14,15,16,17,18,19.

חלבוני Cas9 ממינים שונים, כולל Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes ו- S. canis, יושמו בעריכת גנים של דגי זברה, כאשר Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9) נמצא בשימוש הנרחב ביותר20,21,22,23. עם זאת, SpCas9 יכול לזהות רק אתרי מטרה עם מוטיב סמוך של פרוטוספייסר NGG (PAM), אשר מגביל את טווח העריכה שלו ויכול לגרום לכך שלא יימצא רצף מתאים ליד האתר הפתוגני המעניין24. כדי להרחיב את טווח היעד, מגוון גרסאות SpCas9 תוכננו לזהות PAMs שונים באמצעות אבולוציה מכוונת ועיצוב מונחה מבנה. עם זאת, גרסאות מעטות יעילות בבעלי חיים, במיוחד בדגי זברה, מה שמגביל את היישום של דגי זברה במחקר מחלות הקשורות ל- SNV25,26,27,28. לאחרונה, דווח על שתי גרסאות של SpCas9, SpG ו- SpRY, עם מגבלות PAM פחות מחמירות (NGN עבור SpG ו- NNN עבור SpRY עם העדפה גבוהה יותר ל- NRN מאשר NYN) כמציגות פעילות עריכה גבוהה בתאים ובצמחים אנושיים 29,30,31,32. לאחר מכן, דווח כי SpG ו- SpRY, כמו גם מספר עורכי הבסיס המתווכים שלהם, כגון CBEs בתיווך SpRY ו- ABEs בתיווך SpRY, עובדים גם בדגי זברה, אשר ישפרו את היישום של מודלים של דגי זברה במחקר המכניסטי וסינון תרופות של מחלות הקשורות ל- SNV 18,33,34,35. יתר על כן, i-Silence הוצע כאסטרטגיה יעילה ומדויקת לנוקאאוט גנטי באמצעות המרת קודון התחלה בתיווך ABE מ-ATG ל-GTG או ACG36. השילוב של אסטרטגיית i-Silence ועורך הבסיס בתיווך SpRY zSpRY-ABE8e מספק שיטה חדשה למידול מחלות18. פרוטוקול זה מדגים כיצד לבצע עריכה גנטית באמצעות zSpRY-ABE8e בדגי זברה כדי לבנות מודל tsr2 (M1V) באמצעות אסטרטגיית i-Silence. יעילות העריכה והפנוטיפים המופיעים במודלים של דגי זברה הוערכו ונותחו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה נערך תוך ציות קפדני להנחיות ועדת הטיפול והשימוש של האוניברסיטה הרגילה של דרום סין.

1. הכנת gRNA מהונדס באופן סינתטי ו-zSpRY-ABE8e mRNA

  1. תכנון ה-gRNA על פי פרסומים קודמים37,38.
    1. העדיפו לבחור NRN כרצף PAM, שכן zSpRY-ABE8e מראה העדפה גבוהה יותר ל-NRN PAM מאשר NYN PAM (כאשר R הוא A או G, ו-Y הוא C או T)18. ודא שנוקלאוטיד המטרה אדנין נמצא בחלון העריכה הפעיל ביותר (נוקלאוטיד שלישי עד תשיעי לאורך הפרוטוספייסר).
  2. סדר EasyEdit sgRNA (EE gRNA) שונה עם 2′-O-methyl-3′-phosphorothioate (MS) בשני הקצוות (איור 1).
    הערה: יש להמיס את ה-EE gRNA במים נטולי RNase ולאחסן בטמפרטורה של -80°C.
  3. לינארית את zSpRY-ABE8e plasmid18.
    1. לינאריות 6 מיקרוגרם של פלסמיד עם אנזים XbaI (טבלה של חומרים) באמבט מתכת ב 37 ° C במשך 3 שעות.
    2. לטהר את הפלסמיד הלינארי באמצעות ערכת טיהור הדנ"א (ראה טבלת חומרים) בהתאם להוראות היצרן.
  4. תמלל את ה-mRNA באמצעות ערכת השעתוק במבחנה (Table of Materials).
    1. תמלל את zSpRY-ABE8e mRNA עם פלסמיד ליניארי כתבנית בהתאם להוראות היצרן.
      הערה: כל הפעולות המערבות mRNA ו-gRNA דורשות שימוש בציוד מעבדה נטול RNase.
  5. השתמש בערכת טיהור RNA (רשימת חומרים) כדי לטהר את ה- mRNA בהתאם להוראות היצרן.
    הערה: לפני הפליטה, יש לייבש את האתנול כדי למנוע ציטוטוקסיות, ויש לאחסן את ה-mRNA בטמפרטורה של -80°C אם לא משתמשים בו מיד.

2. הכנת נימי זכוכית מיקרו-הזרקה

  1. הגדירו את מערכת המושך מיקרופיפטה, וחממו מראש למשך 30 דקות לפחות.
  2. הפעל בדיקת רמפה כדי לקבוע את ערך החום הדרוש להמסת נימי זכוכית בורוסיליקט (בקוטר חיצוני של 1 מ"מ וקוטר פנימי של 0.58 מ"מ) בהתאם להוראות היצרן.
  3. בחר תוכנית ולחץ על המספר במקלדת כדי להזין את ערכי הפרמטרים. הגדר את הפרמטרים הבאים למשיכת נימי הזכוכית: חום = ערך בדיקת רמפה, משיכה = 50, מהירות = 100, זמן = 50 ולחץ = 30.
  4. התקן את צינור הנימים, וודא שהוא נמצא בחריץ. לחץ על PULL START/STOP כדי להפעיל את התוכנית.
  5. שמרו על הנימים שנמשכו על ידי הכנסתם לקצף המכיל רווחים, תוך שמירה על המחט תלויה.

3. מיקרו-הזרקה של תערובת zSpRY-ABE8e mRNA ו-EE gRNA לעוברים של דגי זברה

  1. הקימו מיכלי רבייה בלילה שלפני ההזרקה. הכניסו מחיצה, הניחו שתי נקבות וזכר אחד של דג זברה מזן AB (בן 3-18 חודשים) בכל מיכל, וכסו במכסה. עיין בפרסומים קודמים להבחנות מגדריות39.
    הערה: כדי להשיג עוברים נוספים, בחר דגים שלא התרבו במשך שבוע אחד לפחות.
  2. למחרת בבוקר לפני ההזרקה, הפשירו את zSpRY-ABE8e mRNA ו-EE gRNA על קרח. ערבבו את ה-mRNA וה-gRNA לריכוזים סופיים של 400 ננוגרם/מיקרוליטר ו-200 ננוגרם/מיקרוליטר, בהתאמה.
    1. בצע את כל ההליך על קרח באמצעות טיפים וצינורות ללא RNase, ולטפל עם כפפות.
  3. הגדר את המיקרו-מזרק הפנאומטי. סגור את שסתום הלחץ החלקי של משאבת האוויר ופתח תחילה את השסתום הראשי, פתח את בלון הגז וכוונן את הלחץ של שסתום הלחץ החלקי ל- 0.2 MPa/29 psi.
    1. הפעל את המיקרו-מזרק הפנאומטי, הגדר את המצב ל-TIMER והתאם את ערך לחץ הפרמטר הראשוני ל-20.0 psi ואת ערך TIMER ל-0.040 שניות.
  4. השתמש במלקחיים עדינים כדי לשבור בזהירות את המחטים של נימי הזכוכית שנמשכו תחת סטריאומיקרוסקופ, וודא שהמחטים נחתכות בזווית כדי להקל על פירסינג של הכוריון והביצה.
    הערה: נקודת השבירה של המחט צריכה להיות במקום הנכון ולהיות חזקה מספיק כדי לנקב את הביצה, אך דקה מספיק כדי למזער את הנזק לביצה.
  5. הוסף את התערובת של zSpRY-ABE8e mRNA ו- gRNA לקצה של נימי זכוכית באמצעות קצה פיפטה microloader, הימנעות בועות נימים. חבר את המחט למיקרומניפולטור, והגדר את הלחץ ואת ערך TIMER של המזרק כדי להבטיח 2 nL של תערובת מיוצר בכל הזרקה באמצעות microcap.
  6. נתקו את מחיצות מיכלי הרבייה, ואפשרו לדגים להתרבות במשך 10-15 דקות. אספו את הביצים באמצעות מסננת, ובחנו את שלב התא ואיכות הביצים תחת סטריאומיקרוסקופ. בחר את הביציות במצב תא יחיד להזרקה כדי לשפר את יעילות העריכה.
  7. מרפדים את הביציות על צלחת הזרקת אגרוז 1.5%, ומזריקים 2 nL של התערובת לתוך התא, לא החלמון, של העוברים תחת מיקרוסקופ כדי לשפר את יעילות העריכה. לשמור לפחות 15 ביציות כקבוצת הביקורת.
  8. השתמש 1x E3 חיץ לאסוף את הביצים בצלחות פטרי, ומניחים אותם באינקובטור ב 28 ° C. הסר את הביציות המתות, ושנה את מאגר התרבית כל 12 שעות עד 48 שעות לאחר ההפריה (HPF).

4. ניתוח יעילות של עריכת בסיס עם EditR

  1. ב 48 hpf, לאסוף שלושה מאגרים של שישה עוברים מוזרקים שנבחרו באופן אקראי ושישה עוברי ביקורת שנבחרו באופן אקראי לתוך צינורות PCR בהתאמה. השתמש פיפטה כדי לשאוף את מאגר E3 השיורי.
  2. הוסף 40 μL של 50 mM NaOH לתוך צינורות PCR. שים את הצינורות באמבט מתכת ב 95 ° C במשך 20 דקות, ולאחר מכן מערבולת במשך 15 שניות.
  3. הוסף 4 μL של 1 M Tris· HCl (pH 8.0) לתוך כל צינור כדי לנטרל את NaOH. צנטריפוגה קצרה במהירות של 2,000 x גרם למשך 10 שניות בטמפרטורת החדר כדי להסיר טיפות מדופן הצינור. אספו את הסופרנאטנט לתוך צינורות PCR חדשים, ואחסנו אותם בטמפרטורה של -20°C.
  4. תכננו פריימרים מתאימים במעלה ובמורד הזרם של אתרי המטרה של gRNA. השתמש 1 μL של supernatant לעיל כתבנית עבור תגובות PCR של נפח 50 μL. הפריימרים ששימשו ל-PCR במחקר זה מפורטים בטבלה משלימה 1.
  5. בצע אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז DNA כדי להבטיח רצועות נכונות וספציפיות, ולאחר מכן ריצוף סנגר כפי שתואר קודם40.
  6. נתח את נתוני רצף Sanger עם תוכנית EditR (1.0.10)41.
    1. העלה את קובץ הרצף (פורמט ab1) לתיבה "העלה קובץ .ab1".
    2. הזן את רצף gRNA של 20 bp בכיוון 5′-3′ בתיבה "הזן רצף gRNA".
    3. פתח את קובץ הרצף (פורמט ab1), ואשר את מיקומי הבסיס שבהם רצף gRNA של 20 bp מתחיל ומסתיים. הזן את מיקום הבסיס המתאים בתיבות "5′ התחלה" ו- "3′ סוף".
    4. לחץ על עריכה חזויה כדי להשיג את יעילות העריכה הבסיסית. בדוק את איכות נתוני הריצוף ליד רצף המטרה של gRNA כדי למנוע פסגות או indels לא מסודרים.
      הערה: באופן כללי, ניתן להסיר ביעילות את הפסגות הלא מסודרות על ידי התאמת טמפרטורת החישול של PCR.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

דווח כי המוטציה של TSR2 גורמת לאנמיה של Diamond Blackfan (DBA)42. כאן, מודל דג זברה DBA נבנה עם מוטציה tsr2 (M1V) באמצעות אסטרטגיית i-Silence. האדנין של קודון ההתחלה של דג הזברה tsr2 הומר בהצלחה לגואנין באמצעות zSpRY-ABE8e (איור 3).

ניתוח EditR של תוצאות ריצוף Sanger הראה שיש חפיפה בין A/G בבסיס האדנין של קודון ההתחלה tsr2 (איור 4).

לאחר שמייסדי F0...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר את הבנייה של מודל מחלת דגי זברה באמצעות עורך הבסיס zSpRY-ABE8e. בהשוואה למסלול HDR המסורתי להחלפת בסיס, פרוטוקול זה יכול להשיג עריכת בסיס יעילה יותר ולהפחית את התרחשות האינדלים. במקביל, פרוטוקול זה כולל יישום אסטרטגיית הנוקאאוט הגנטי i-Silence שהוצעה לאחרונה בדגי זברה. יחד, zSpRY-ABE8e ישפר את היישום של מודלים של דגי זברה בחקר מחלות.

אפקטים מחוץ למטרה הם בעיה נפוצה במערכות CRISPR/Cas9. בהתחשב בהגבלה ללא PAM, ההשפעה מחוץ למטרה של zSpRY-ABE8e עשויה להיות גבוהה יותר, גם אם לא נמצ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים לברברה גרברס, PhD, מליוואן ביאנג'י (אדנז) על עריכת הטקסט באנגלית של טיוטה של כתב יד זה. עבודה זו נתמכה על ידי תוכנית המחקר והפיתוח של אזור המפתח של מחוז גואנגדונג (2019B030335001), תוכנית המו"פ הלאומית של סין (2019YFE0106700), הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (32070819, 31970782), ותוכנית קרן המחקר של מעבדת המפתח המחוזית של גואנגדונג לביולוגיה פתוגנית ואפידמיולוגיה לבעלי חיים כלכליים ימיים (PBEA2020YB05).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
אגרוזסיגמא-אולדריץ'A95391.5% אגרוז המשמש לייצור נימי
זכוכית בורוסיליקט הזרקה מנגנון הרווארדBS4 30-0016
כלי תרבית תאים Falcon351029
ClonExpress Ultra One Step ערכתVazymeC115לשיבוט עירוי 
שירות אופטימיזציה של קודוןSangon Biotech
Drummond MicrocapsDrummond MicrocapsP1299-1PAKאורך: 32 מ"מ, קיבולת: 0.5 μ L
שירות EasyEdit gRNAGenScript
מלקחיים עדיניםמכשיר מדעי משובח11254-20משמש לשבירת
חולץ מיקרופיפטה בוער/חום מכשיר גמגוםP-97משמש למשיכת נימי הזכוכית
HotStart Taq PCR StarMixGenstarA033-101משמש לתגובת PCR
תיבת אקלים מלאכותית אינטליגנטיתTENLINPRX-1000Aמשמש לתרבית עוברי דג זברה
MethylcelluloseSigma-AldrichM0512משמש לתיקון דג הזברה בעת צילום
קצות פיפטה של Microloader& נ.ב.פ;mMACHINE 5242956003
 
Mut Express II ערכת מוטגנזה מהירה V2VazymeC214-01ערכת למוטגנזה מכוונת אתר
מיקרו-מזרק פנאומטיZGene BiotechZGPCP-1500 PLUS
pT3TS-zSpCas9Addgene46757
RNeasy FFPE kit ערכת Qiagen73504לטיהור RNA
שירות ריצוף סנגר סנגרסנגון ביוטק
נתרן הידרוקסיד, סנגון גרגיריA100173-0500NaOH המשמש למיצוי גנום
מיקרוסקופ סטריאואולימפוס SZX10משמש לצילום של פנוטיפ
סדרת SZ זום סטריאו מיקרוסקופCNOPTECSZ650
T3mMESSAGE AmbionAM1348ערכת לתמלול במבחנה 
ערכת TIANprep מיני פלסמידTIANGENDP103-03ערכת מיצוי פלסמיד
ערכת טיהור מיני TIANquick ערכת TIANGENDP203-02לטיהור לפלסמיד ליניארי
TricaineSigma-AldrichE10521משמש להרדמת דג זברה
Tris (hydroxymethyl) aminomethaneSangonA600194-0500רכיב של Tris· HCl המשמש למיצוי גנום
XbaINew England BiolabsR0145Sאנדונוקלאז הגבלה המשמש לליניאריזציה של פלסמיד
ערכת שיבוט ערכת Eppendorf

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Eichler, E. E., et al. Completing the map of human genetic variation. Nature. 447 (7141), 161-165 (2007).
  2. Koukouli, F., et al. Nicotine reverses hypofrontality in animal models of addiction and schizophrenia. Nature Medicine. 23 (3), 347-354 (2017).
  3. Kalueff, A. V., Stewart, A. M., Gerlai, R. Zebrafish as an emerging model for studying complex brain disorders. Trends in Pharmacological Sciences. 35 (2), 63-75 (2014).
  4. Anzalone, A. V., Koblan, L. W., Liu, D. R. Genome editing with CRISPR-Cas nucleases, base editors, transposases and prime editors. Nature Biotechnology. 38 (7), 824-844 (2020).
  5. Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nature Biotechnology. 32 (4), 347-355 (2014).
  6. Komor, A. C., Kim, Y. B., Packer, M. S., Zuris, J. A., Liu, D. R. Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage. Nature. 533 (7603), 420-424 (2016).
  7. Nishida, K., et al. Targeted nucleotide editing using hybrid prokaryotic and vertebrate adaptive immune systems. Science. 353 (6305), (2016).
  8. Gaudelli, N. M., et al. Directed evolution of adenine base editors with increased activity and therapeutic application. Nature Biotechnology. 38 (7), 892-900 (2020).
  9. Liu, Z., et al. Highly efficient RNA-guided base editing in rabbit. Nature Communications. 9, 2717(2018).
  10. Levy, J. M., et al. Cytosine and adenine base editing of the brain, liver, retina, heart and skeletal muscle of mice via adeno-associated viruses. Nature Biomedical Engineering. 4 (1), 97-110 (2020).
  11. Liu, Z., et al. Efficient generation of mouse models of human diseases via ABE- and BE-mediated base editing. Nature Communications. 9, 2338(2018).
  12. Landrum, M. J., et al. ClinVar: Public archive of interpretations of clinically relevant variants. Nucleic Acids Research. 44, 862-868 (2016).
  13. Qin, W., et al. Precise A•T to G•C base editing in the zebrafish genome. BMC Biology. 16 (1), 139(2018).
  14. Tanaka, S., et al. In vivo targeted single-nucleotide editing in zebrafish. Scientific Reports. 8, 11423(2018).
  15. Carrington, B., Weinstein, R. N., Sood, R. BE4max and AncBE4max are efficient in germline conversion of C:G to T:A base pairs in zebrafish. Cells. 9 (7), 1690(2020).
  16. Zhang, Y., et al. Programmable base editing of zebrafish genome using a modified CRISPR-Cas9 system. Nature Communications. 8, 118(2017).
  17. Rosello, M., et al. Precise base editing for the in vivo study of developmental signaling and human pathologies in zebrafish. eLife. 10, 65552(2021).
  18. Liang, F., et al. SpG and SpRY variants expand the CRISPR toolbox for genome editing in zebrafish. Nature Communications. 13, 3421(2022).
  19. Qin, W., Lu, X., Lin, S. Programmable base editing in zebrafish using a modified CRISPR-Cas9 system. Methods. 150, 19-23 (2018).
  20. Feng, Y., et al. Expanding CRISPR/Cas9 genome editing capacity in zebrafish using SaCas9. G3. 6 (8), 2517-2521 (2016).
  21. Liu, Y., et al. Genome editing in zebrafish by ScCas9 recognizing NNG PAM. Cells. 10 (8), 2099(2021).
  22. Kleinstiver, B. P., et al. Engineered CRISPR-Cas9 nucleases with altered PAM specificities. Nature. 523 (7561), 481-485 (2015).
  23. Liu, K., Petree, C., Requena, T., Varshney, P., Varshney, G. K. Expanding the CRISPR toolbox in zebrafish for studying development and disease. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 13(2019).
  24. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  25. Hu, J. H., et al. Evolved Cas9 variants with broad PAM compatibility and high DNA specificity. Nature. 556 (7699), 57-63 (2018).
  26. Nishimasu, H., et al. Engineered CRISPR-Cas9 nuclease with expanded targeting space. Science. 361 (6408), 1259-1262 (2018).
  27. Endo, M., et al. Genome editing in plants by engineered CRISPR-Cas9 recognizing NG PAM. Nature Plants. 5, 14-17 (2019).
  28. Li, J., et al. Plant genome editing using xCas9 with expanded PAM compatibility. Journal of Genetics and Genomics. 46 (5), 277-280 (2019).
  29. Ren, Q., et al. PAM-less plant genome editing using a CRISPR-SpRY toolbox. Nature Plants. 7, 25-33 (2021).
  30. Xu, Z., et al. SpRY greatly expands the genome editing scope in rice with highly flexible PAM recognition. Genome Biology. 22 (1), 6(2021).
  31. Walton, R. T., Christie, K. A., Whittaker, M. N., Kleinstiver, B. P. Unconstrained genome targeting with near-PAMless engineered CRISPR-Cas9 variants. Science. 368 (6488), 290-296 (2020).
  32. Li, J., et al. Genome editing mediated by SpCas9 variants with broad non-canonical PAM compatibility in plants. Molecular Plant. 14 (2), 352-360 (2021).
  33. Vicencio, J., et al. Genome editing in animals with minimal PAM CRISPR-Cas9 enzymes. Nature Communications. 13, 2601(2022).
  34. Rosello, M., et al. Disease modeling by efficient genome editing using a near PAM-less base editor in vivo. Nature Communications. 13, 3435(2022).
  35. Cornean, A., et al. Precise in vivo functional analysis of DNA variants with base editing using ACEofBASEs target prediction. eLife. 11, 72124(2022).
  36. Wang, X., et al. Efficient gene silencing by adenine base editor-mediated start codon mutation. Molecular Therapy. 28 (2), 431-440 (2020).
  37. Hanna, R. E., Doench, J. G. Design and analysis of CRISPR-Cas experiments. Nature Biotechnology. 38 (7), 813-823 (2020).
  38. Doench, J. G., et al. Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9. Nature Biotechnology. 34 (2), 184-191 (2016).
  39. Kossack, M. E., Draper, B. W. Genetic regulation of sex determination and maintenance in zebrafish (Danio rerio). Current Topics in Developmental Biology. 134, 119-149 (2019).
  40. Crossley, B. M., et al. Guidelines for Sanger sequencing and molecular assay monitoring. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 32 (6), 767-775 (2020).
  41. Kluesner, M. G., et al. EditR: A method to quantify base editing from Sanger sequencing. The CRISPR Journal. 1 (3), 239-250 (2018).
  42. Gripp, K. W., et al. Diamond-Blackfan anemia with mandibulofacial dystostosis is heterogeneous, including the novel DBA genes TSR2 and RPS28. American Journal of Medical Genetics Part A. 164 (9), 2240-2249 (2014).
  43. Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).
  44. Ramakrishna, S., et al. Gene disruption by cell-penetrating peptide-mediated delivery of Cas9 protein and guide RNA. Genome Research. 24 (6), 1020-1027 (2014).
  45. Fu, Y., Reyon, D., Joung, J. K. Targeted genome editing in human cells using CRISPR/Cas nucleases and truncated guide RNAs. Methods in Enzymology. 546, 21-45 (2014).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

PAMCRISPR Cas9gRNA

מאמרים קשורים