הפרוטוקול הנוכחי מתאר כיצד להשתמש בפציעה בתיווך FeCl3 כדי לגרום לפקקת עורקים, וכיצד לאסוף ולהכין דגימות פגיעה עורקית בשלבים שונים של פקקת לצורך ניתוח מיקרוסקופ אלקטרונים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
פקקת עורקים המושרה על ידי ברזל כלוריד ואיסוף דגימות לניתוח מיקרוסקופ אלקטרונים תלת ממדי
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
מחלות לב וכלי דם הן גורם מוביל לתמותה ותחלואה ברחבי העולם. פקקת חריגה היא תכונה נפוצה של מצבים סיסטמיים כמו סוכרת והשמנת יתר, ומחלות דלקתיות כרוניות כמו טרשת עורקים, סרטן ומחלות אוטואימוניות. בעת פגיעה בכלי הדם, בדרך כלל מערכת הקרישה, טסיות הדם והאנדותל פועלים באופן מתוזמר למניעת דימום על ידי יצירת קריש במקום הפגיעה. הפרעות בתהליך זה מובילות לדימום מוגזם או פקקת בלתי מבוקרת / פעילות אנטי-טרומבוטית לא מספקת, המתורגמת לחסימת כלי דם ולהמשך שלה. מודל פציעת התרדמה המושרה על ידי FeCl3 הוא כלי רב ערך בחקירת האופן שבו פקקת מתחילה ומתקדמת in vivo. מודל זה כולל נזק/דנודציה של אנדותל והיווצרות קריש דם לאחר מכן באתר הפגוע. הוא מספק בדיקה כמותית רגישה ביותר לניטור נזק לכלי דם והיווצרות קריש דם בתגובה לדרגות שונות של נזק לכלי הדם. לאחר אופטימיזציה של טכניקה סטנדרטית זו, ניתן להשתמש בה כדי לחקור את המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס פקקת, כמו גם את השינויים האולטרה-מבניים בטסיות הדם בפקקת הולכת וגדלה. בדיקה זו שימושית גם כדי ללמוד את היעילות של סוכני antithrombotic ו antiplatelet. מאמר זה מסביר כיצד ליזום ולנטר פקקת עורקים FeCl3 וכיצד לאסוף דגימות לניתוח במיקרוסקופ אלקטרונים.
מבוא
פקקת היא היווצרות של קריש דם שחוסם באופן חלקי או מלא כלי דם, ומעכב את הזרימה הטבעית של הדם. זה מוביל לאירועים קרדיווסקולריים חמורים וקטלניים, כגון מחלת לב איסכמית ושבץ. מחלות לב וכלי דם הן הגורם המוביל לתחלואה ולתמותה, וגורמות לאחד מכל ארבעה מקרי מוות ברחבי העולם 1,2,3. למרות פקקת מתבטאת כתפקוד לקוי של מערכת כלי הדם, זה יכול להיות תוצאה של זיהום מיקרוביאלי או ויראלי הבסיסי, הפרעה חיסונית, ממאירות, או מצב מטבולי. זרימת הדם נשמרת על ידי אינטראקציה מורכבת בין מרכיבים שונים של מערכת כלי הדם, כולל תאי אנדותל, תאי דם אדומים/לבנים, טסיות דם וגורמי קרישה4. במק....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל הניסויים הנדונים כאן נבדקו ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) באוניברסיטת קנטקי.
הערה: כלי ניתוח מפורטים באיור 1 ובטבלת החומרים. נעשה שימוש בעכברי C57BL/6J, בני 8-10 שבועות, זכר/נקבה או זנים רלוונטיים שעברו מניפולציה גנטית (נוקאאוט או נוקין).
1. פגיעה בעורק התרדמההנגרמת על ידי FeCl 3
- השראת הרדמה בעכבר
- שקלו את העכבר.
- מרדימים את העכבר על ידי הזרקת 0.2 גרם / ק"ג תמיסת tribromoethanol intraperitoneally (i.p). ודא שתמיסת ההרדמה היא בטמפרטורת החדר (RT) לפני הזרקתה. מינון זה מספיק כדי להרג....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
הנתונים מוצגים בדרך כלל כזמן לחסימה, או הזמן הדרוש ליצירת פקקת חסימה מלאה. ניתן לשרטט את הנתונים האלה כעקומת הישרדות קפלן-מאייר (איור 4A)19, תרשים נקודתי עם עמודות המראות את זרימת הדם הסופית בזמן הפסקת זרימת הדם או סיום ניסוי (איור 4B), או כגרף קווי (איור 4C). יציבות פקקת ניתן ללמוד באמצעות טכניקה זו. ברוב המקרים, עם פציעת FeCl3, פקקת נוצרת בהדרגה, וככל שהיא גדלה, זרימת הדם פוחתת בהדרגה, ומגיעה לאפ.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
היישום המקומי של FeCl3 בכלי הדם כדי לגרום לפקקת הוא טכניקה נפוצה, והיא סייעה בקביעת תפקידים עבור קולטני טסיות שונים, מסלולי איתות ליגנד, ומעכביהם20,21,22,23. המנגנון שבאמצעותו FeCl3 גורם פקקת הוא רב פנים; בעבר, דנודציה של האנדותל נחשבה לגורם לפקקת, אולם בשנים האחרונות, דיווחים רבים הציעו את תפקידם של תאי הדם האדומים וחלבוני הפלזמה בתהליך זה24,25,26,27
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין ניגודי אינטרסים הקשורים למחקר זה.
פרופילי ORCID: S.J.: 0000-0001-6925-2116; ש.ו.ו: 00000-0001-5577-0473.
תודות
המחברים מודים לחברי מעבדת לב לבן על העיון המדוקדק בכתב היד הזה. העבודה נתמכה על ידי מענקים מה-NIH, NHLBI (HL56652, HL138179 ו-HL150818), ופרס הצטיינות של המחלקה לענייני חיילים משוחררים ל-S.W.W., R01 HL 155519 ל-B.S., ומענק תוכנית NIBIB ל-R.D.L.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 0.9% מי מלח | פישר סיינטיפיק | BP358-212 | NaCl משמש לייצור תמיסה של 0.9% מי מלח |
| מזרק 1 מ"ל | בקטון, דיקינסון ושות' | ||
| 190 אתנול הוכחה | קופטק | V1101 | משמש להכנת תמיסת אתנול 70% לשימוש להכנת העכבר לניתוח |
| 2,2,2 Tribromoethanol | Sigma Aldrich | 48402 | |
| תפר משי קלוע שחור 25 יארד (5-0) | DEKNATEL | 136082-1204 | |
| 26G x 3/8 מחט | בקטון, דיקינסון ושות' | 305110 | |
| 2-מתיל-2-בוטנול | סיגמא אולדריץ' | 240486 | |
| פיפט העברה של 7.5 מ"ל, בוגר ל-3 מ"ל | גלובוס סיינטיפיק בע"מ. | 135010 | |
| רפידות הכנה לאלכוהול (70% אלכוהול איזופרופיל | מדליין | MDS090735 | |
| Araldite GY 502 | שירותי מיקרוסקופיה אלקטרונית | 10900 | |
| צלחת תרבית תאים 35 מ"מ X 10 מ"מ | קורנינג אינקורפורייטד | ||
| משקל קומפקטי | המדע של וורד | 470314-390 | |
| מכשיר דיוק עולמי | באורך 12.5 ס"מ | 15922-G | |
| DMP-30 מפעיל | שירותי מיקרוסקופיה אלקטרונית | 13600 | |
| דודניל סוקסיניק אנהידריד / שירותי | מיקרוסקופיה אלקטרונית DDSA | 13700 | |
| שקיות קקי כלבים/שקית סילוק פגר בעלי חיים | מוצרי כתר | PP-RB-200 | |
| דופלר FlowProbe | Transonic Systems Inc. | MA0.5PSB | |
| EMBED 812 שרף | שירותי מיקרוסקופיה אלקטרונית | 14900 | |
| אלכוהול אתילי, נטול מים 200 הוכחה | שירותי מיקרוסקופיה אלקטרונית | 15055 | |
| מלקחיים להלבשת עיניים, 4 אינץ' מעוקל מלא, סטנדרטי, 0.8 מ"מ טיפים רחבים | Integra Miltex | 18-784 | |
| נייר סינון | VWR | 28310-106 | |
| מספריים עדינים - כלים מדעיים עדינים חדים-בוטים | 14028-10 | ||
| אגרוף אוזניים לולאת אצבע | כלים מדעיים | 24212-01 | |
| ספוגי גזה 2 "x 2" – 12 שכבות | Dukal Corporation | 2128 | |
| Glutaraldehyde (תמיסה 10%) | שירותי מיקרוסקופיה אלקטרונית | 16120 | |
| Integra Miltex פלדת פחמן להב כירורגי #10 | Integra® Miltex® | 4110 | |
| ברזל (III) כלוריד | SIGMA-ALDRICH | 157740-100G | |
| ידית סכין Miltex® פלדת אל-חלד עדינה במיוחד מידה 3 | Integra Lifesciences | 157510 | |
| חומצה L-אספרטית | סיגמא פישר | A93100 | |
| חומצה L-אספרטית | פישר סיינטיפיק | BP374-100 | |
| עופרת חנקתית | פישר סיינטיפיק | מיקרוסקופ L-62 | |
| LEICA S8AP0 | LEICA | אינו זמין עוד | לא זמין עוד מחברת |
| LEICA S8AP0 מעמד מיקרוסקופ | LEICA | 10447255 | כבר לא זמין מהחברה |
| מגבי טישו קלים | VWR | 82003-822 | |
| מלקחיים מיקרו ניתוח; שיניים 1x2, עקומה מלאה; רוחב קצה 0.8 מ"מ; חברת | מכשירים כירורגיים באורך | RS-5157 | |
| אוסמיום טטרוקסיד 4% תמיסה מימית | שירותי מיקרוסקופיה אלקטרונית | 19150 | |
| פרפורמלדהיד (תמיסה של 16%) | שירותי מיקרוסקופיה אלקטרונית | 15710 | |
| אשלגן פריציאניד | SIGMA-ALDRICH | P-8131 | |
| תחמוצת פרופילן, מגיב ACS | שירותי מיקרוסקופיה אלקטרונית | 20401 | |
| Rainin Classic Pipette PR-10 | Rainin | 17008649 | |
| מד זרימה למחקר | טרנסוניק סיסטמס בע"מ | דגם T402B01481 | : T402 |
| סקוטש מג'יק בלתי נראה, 3/4 אינץ' x 1000 אינץ', | סקוטש שקוף | ||
| 305289 כרית מחוממת לבעלי חיים קטנים | K& H ייצור בע"מ | דגם: HM10 | |
| מאגר נתרן קקודילאט 0.2M, שירותי | מיקרוסקופיה אלקטרונית | 11623 | |
| אפליקטורים סטריליים עם קצה כותנה | מוצרים רפואיים פוריטניים | 25-806 1WC | |
| Steromaster Illuminator | פישר סיינטיפיק | 12-562-21 | כבר לא זמין מחברת |
| Surgical Dumont #7 מלקחיים | כלים מדעיים | 11271-30 | |
| Thiocarbohydrazide (TCH) | SIGMA-ALDRICH | 88535 | |
| טעינה מחדש של קצה פיפטה אוניברסלי עם שמירה נמוכה (0.1-10 ומיקרו; L) | VWR | 76323-394 | |
| שירותי מיקרוסקופיה אלקטרונית | אורניל אצטט& | 22400 | |
| Veet ג'ל קרם מסיר שיער | Reckitt Benckiser | 3116875 | |
| לבן אנטי סטטי משושה שוקל, בינוני, 64 x 15 x 19 מ"מ | פישר סיינטיפיק | תוכנת S38975 | |
| WinDAQ/100 עבור Windows | DATAQ Instruments, Inc. | גרסה 3.38 | זמינה להורדה בחינם. https://www.dataq.com/products/windaq/ |
| ZEISS AxioCam ICC 1 | ZEISS | 57615 |
מקורות
- Lozano, R., et al. Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010. Lancet. 380 (9859), 2095-2128 (2012).
- Raskob, G. E., et al.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
תגיות
