הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

פקקת עורקים המושרה על ידי ברזל כלוריד ואיסוף דגימות לניתוח מיקרוסקופ אלקטרונים תלת ממדי

3K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/64985

⸱

17 במרץ 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular and Cellular Biochemistry, University of Kentucky, 2Department of Physiology and Cell Biology, University of Arkansas for Medical Sciences, 3Laboratory of Cellular Imaging and Macromolecular Biophysics, National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering, National Institutes of Health

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

הפרוטוקול הנוכחי מתאר כיצד להשתמש בפציעה בתיווך FeCl3 כדי לגרום לפקקת עורקים, וכיצד לאסוף ולהכין דגימות פגיעה עורקית בשלבים שונים של פקקת לצורך ניתוח מיקרוסקופ אלקטרונים.

תקציר

מחלות לב וכלי דם הן גורם מוביל לתמותה ותחלואה ברחבי העולם. פקקת חריגה היא תכונה נפוצה של מצבים סיסטמיים כמו סוכרת והשמנת יתר, ומחלות דלקתיות כרוניות כמו טרשת עורקים, סרטן ומחלות אוטואימוניות. בעת פגיעה בכלי הדם, בדרך כלל מערכת הקרישה, טסיות הדם והאנדותל פועלים באופן מתוזמר למניעת דימום על ידי יצירת קריש במקום הפגיעה. הפרעות בתהליך זה מובילות לדימום מוגזם או פקקת בלתי מבוקרת / פעילות אנטי-טרומבוטית לא מספקת, המתורגמת לחסימת כלי דם ולהמשך שלה. מודל פציעת התרדמה המושרה על ידי FeCl3 הוא כלי רב ערך בחקירת האופן שבו פקקת מתחילה ומתקדמת in vivo. מודל זה כולל נזק/דנודציה של אנדותל והיווצרות קריש דם לאחר מכן באתר הפגוע. הוא מספק בדיקה כמותית רגישה ביותר לניטור נזק לכלי דם והיווצרות קריש דם בתגובה לדרגות שונות של נזק לכלי הדם. לאחר אופטימיזציה של טכניקה סטנדרטית זו, ניתן להשתמש בה כדי לחקור את המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס פקקת, כמו גם את השינויים האולטרה-מבניים בטסיות הדם בפקקת הולכת וגדלה. בדיקה זו שימושית גם כדי ללמוד את היעילות של סוכני antithrombotic ו antiplatelet. מאמר זה מסביר כיצד ליזום ולנטר פקקת עורקים FeCl3 וכיצד לאסוף דגימות לניתוח במיקרוסקופ אלקטרונים.

מבוא

פקקת היא היווצרות של קריש דם שחוסם באופן חלקי או מלא כלי דם, ומעכב את הזרימה הטבעית של הדם. זה מוביל לאירועים קרדיווסקולריים חמורים וקטלניים, כגון מחלת לב איסכמית ושבץ. מחלות לב וכלי דם הן הגורם המוביל לתחלואה ולתמותה, וגורמות לאחד מכל ארבעה מקרי מוות ברחבי העולם 1,2,3. למרות פקקת מתבטאת כתפקוד לקוי של מערכת כלי הדם, זה יכול להיות תוצאה של זיהום מיקרוביאלי או ויראלי הבסיסי, הפרעה חיסונית, ממאירות, או מצב מטבולי. זרימת הדם נשמרת על ידי אינטראקציה מורכבת בין מרכיבים שונים של מערכת כלי הדם, כולל תאי אנדותל, תאי דם אדומים/לבנים, טסיות דם וגורמי קרישה4. במקרה של פגיעה בכלי הדם, טסיות הדם מתקשרות עם חלבוני הדבק על המטריצה התת-אנדותלית ומשחררות את תכולתן הגרגירית, אשר מגייסת יותר טסיות5. במקביל, מפל הקרישה מופעל, המוביל להיווצרות פיברין ותצהירו. בסופו של דבר, נוצר קריש דם, המכיל טסיות דם ותאי דם אדומים הכלואים בתוך רשת פיברין6. למרות שתרופות נוגדות טסיות ונוגדות קרישה זמינות כדי לווסת פקקת, דימום מזויף נותר דאגה מרכזית בטיפולים אלה, הדורשים כוונון עדין של המינונים והשילובים של תרופות אלה. לכן, יש עדיין צורך דחוף לגלות תרופות אנטי טרומבוטיות חדשות7.

פקקת נחקרת במספר שיטות לגרימת פגיעה בכלי הדם: מכנית (קשירת כלי דם), תרמית (פגיעה בלייזר) ופגיעה כימית (FeCl3/Rose Bengal application). אופי הפקקת משתנה בהתאם למיקום (עורקי לעומת ורידי), שיטה או היקף הפגיעה. בין כל הסוגים הללו, FeCl 3-induced vascular injury היא השיטה הנפוצה ביותר. הוא שימש בעכברים, חולדות, ארנבות, שרקנים וכלבים 8,9,10,11,12. השיטה פשוטה יחסית, קלה לשימוש, ואם הפרמטרים העיקריים מתוקננים, היא רגישה וניתנת לשחזור במערכות כלי דם שונות (למשל, עורקים [קרוטיד ועצם הירך], ורידים [jugular] ועורקים [cremaster ו mesenteric]) (טבלה משלימה 1).

מודל זה יכול לשמש גם כדי לקדם את הבנתנו את המכניקה והמורפולוגיה של היווצרות קרישי דם. טכניקה זו מציעה באופן ייחודי את היתרון של עצירת פקקת בנקודות קצב זרימה שונות, כדי ללמוד את שלבי הביניים של התהליך לפני שהוא הופך להיות חוסם. ההתקדמות האחרונה במחקר פקקת השתמשה במודל זה כדי למקד את תשומת הלב בשיטות לא פרמקולוגיות של טרומבוליזה13 או משלוח לא פולשני של חומרים אנטי טרומבוטיים ו / או פיברינוליטיים14,15. מספר קבוצות הראו כי כאשר קרומי טסיות הדם מצופות בטיפולים אלה, ניתן להפעיל את התרופות בגירוי תרמי כדי להתמקד בקרישי דם16. הטכניקות המתוארות כאן יכולות להיות שימושיות למחקרים כגון אימות ממצאיהם ברמת טסיות הדם היחידה. בכתב יד זה, פרוטוקול 1 מתאר את ההליך הבסיסי של פגיעה בכלי דם בתיווך FeCl3, ואילו פרוטוקול 2 מתאר את השיטה לאסוף ולתקן את דגימת הפגיעה בכלי הדם לניתוח נוסף במיקרוסקופ אלקטרונים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל הניסויים הנדונים כאן נבדקו ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) באוניברסיטת קנטקי.

הערה: כלי ניתוח מפורטים באיור 1 ובטבלת החומרים. נעשה שימוש בעכברי C57BL/6J, בני 8-10 שבועות, זכר/נקבה או זנים רלוונטיים שעברו מניפולציה גנטית (נוקאאוט או נוקין).

1. פגיעה בעורק התרדמההנגרמת על ידי FeCl 3

  1. השראת הרדמה בעכבר
    1. שקלו את העכבר.
    2. מרדימים את העכבר על ידי הזרקת 0.2 גרם / ק"ג תמיסת tribromoethanol intraperitoneally (i.p). ודא שתמיסת ההרדמה היא בטמפרטורת החדר (RT) לפני הזרקתה. מינון זה מספיק כדי להרגיע את העכבר במשך כ 1 שעה.
    3. בדוק את רפלקס הבוהן על ידי צביטת הבוהן 5 דקות לאחר ההזרקה כדי לוודא שהעכבר מורדם. אם העכבר אינו מורדם, הוא ימשוך את הבוהן שלו משם. אם זה קורה, המתן 5 דקות ובדוק שוב.
    4. אם העכבר עדיין לא הרגיע לחלוטין, לנהל 1/4 של המנה הראשונית ולחכות 5 דקות.
    5. במהלך ההליך, מעת לעת לפקח על מישור ההרדמה של העכבר באמצעות צביטת בוהן. בנוסף, ניתן לעקוב אחר קצב הנשימה וטמפרטורת הגוף כדי לשמור על הרדמה אופטימלית.
  2. לשתק את העכבר
    1. הניחו את העכבר על כרית החימום (37°C) במצב שכיבה והשתמשו בסרט הדבקה כדי לשתק את הגפיים.
    2. השתמש בחוט כירורגי (0.1 מ"מ) כדי למשוך בעדינות את השיניים הקדמיות העליונות של העכבר כדי להאריך את אזור צוואר הרחם / הצוואר. זה חשוב להדמיה טובה יותר של אזור הניתוח ויציבות של בדיקת דופלר. גודל החוט אינו חשוב, מכיוון שהוא משמש רק כדי למשוך את השיניים הקדמיות של החיה כדי להאריך את הצוואר.
  3. החתך
    1. רססו את אזור הניתוח באתנול 70% או נגבו אותו במגבון אלכוהול.
    2. בעזרת צמר גפן, יש למרוח כמות קטנה של קרם להסרת שיער על אזור הניתוח. המתן 1-2 דקות ולאחר מכן השתמש במגבת נייר רטובה או טישו כדי להסיר את הקרם.
      הערה: שלב זה חשוב לאזור כירורגי נקי.
    3. בעזרת מספריים ומלקחיים (איור 1B11,1B13), בצעו חתך בקו האמצע מהלסת התחתונה לחריץ העל-חזה. משכו את העור לאחור כדי לקבל הדמיה טובה יותר של האזור (איור 2A).
  4. חשיפה לעורק התרדמה
    1. באמצעות מלקחיים כירורגיים ומלקחיים לניתוח זעיר, נתחו את הפאשיה השטחית המכסה והסירו אותה כדי לחשוף את עורק התרדמה השמאלי (איור 1B12,1B13). הקפידו לא להשתמש במספריים בשלב זה כדי להימנע מפגיעה בכלי דם אחרים באזור זה.
    2. הסר רקמות נוספות העוטפות את עורק התרדמה. הימנע דיסקציה מוגזמת של הרקמה שמסביב, שכן אזור זה מכיל את עצב הואגוס ואת עורק החוליות.
    3. הפרידו את עורק התרדמה מהרקמה הסובבת אותו על-ידי ניתוחו באמצעות מלקחיים כירורגיים וקושרי תפרים (איור 1B12,1B15,2C). הקפד לא להאריך או למשוך את העורק כדי למנוע כל פגיעה מכנית בעורק או בכלי הדם שמסביב.
    4. הניחו חתיכת פלסטיק מתחת לעורק כדי לסמן את מיקום הפציעה (איור 2D). השתמש בדף שקיפות צבעוני כדי להקל על הראייה בשדה הניתוח.
  5. מיקום בדיקת הזרימה
    1. הניחו את בדיקת הזרימה הטרנסונית דופלר בתמיסת מלח (0.9% NaCl ב-dH2O) למשך כ-10 דקות לפני הניתוח. הכנס את הקצה השני של הגשושית לקובץ מצורף במד הזרימה כדי להקל על קריאת הזרימה. חבר את מד הזרימה למחשב.
      הערה: בין ניתוחים, בדיקת הזרימה הטרנסונית של דופלר צריכה להיות במי מלח. הקפידו לשמור על הבדיקה לחה ונקייה לאורך כל ההליך.
    2. הניחו את בדיקת הזרימה הטרנסונית של דופלר האולטרסאונד סביב העורק במעלה הזרם של הפלסטיק (איור 2D). ודאו שאזור מחזיק כלי השיט של הגשושית אינו מורחב מדי (איור 1C, חץ אדום).
      הערה: במידת הצורך, תמכו בבדיקה עם רפידות גזה (איור 1B1) כדי להשיג גובה מתאים של הגשוש, מה שיקל על תנוחת הקריאה האופטימלית.
    3. אם אזור הניתוח יבש בשלב זה, הוסיפו כמה טיפות של מי מלח RT כדי לשמור על האזור לח. עקוב אחר קריאת בדיקת הזרימה. הקריאה האופטימלית משתנה עבור כל בעל חיים ויכולה להיות בין 0.6-1.2 מ"ל/דקה. אם הוא פחות או לא יציב, שנה את מיקום בדיקת הזרימה כדי לקבל קריאה אופטימלית.
      הערה: ודא שצוואר העכבר אינו מוארך מדי, ושאזור הניתוח נקי.
  6. הקלט את קו הבסיס של הזרימה
    1. לאחר ביצוע הבדיקה, עקוב אחר זרימת הדם במשך 2 דקות כדי לוודא שהזרימה יציבה. לאחר מכן, תיעדו את הזרימה במשך 2 דקות (איור 3B) כקו בסיס. לתיאור מפורט של מד הזרימה, עיין ב- Subramaniam et al.17.
    2. כדי להקליט את זרימת הדם, הפעל את תוכנת WinDAQ. לחץ על קובץ אפשרות ולאחר מכן לחץ על הקלט. צור תיקיה וקובץ חדשים והתחל להקליט. כדי לעצור את ההקלטה, לחץ על עצור בקטע הקובץ.
      הערה: תוכנת WinDAQ זמינה באופן חופשי מהמוציא לאור: https://www.dataq.com/products/windaq/.
  7. פציעה
    1. עצור את הקלטת הזרימה. הקפד לא לשנות את מיקום הבדיקה כך שהקריאות יישארו עקביות לאחר הפציעה.
    2. יבשו את האזור ביסודיות עם מגבון/מגבת נייר.
      הערה: אפילו כמות קטנה של נוזל שיורי עלולה לשנות את הריכוז של תמיסת FeCl3 המשמשת לגרימת פגיעה בכלי הדם. זה מוביל לתוצאות משתנות ומשפיע על יכולת השחזור. כאשר האזור יבש לחלוטין, הגשושית אינה מסוגלת למדוד את הזרימה.
    3. בסירת שקילה מפלסטיק, שים נייר סינון עגול (קוטר 1 מ"מ, חתוך עם ניקוב אוזניים בקוטר 1 מ"מ). יש להוסיף 1 μL של תמיסת FeCl3 6% (מיוצרת ב-dH2O) על נייר הסינון.
      הערה: הקפד להוסיף פתרון FeCl3 ממש לפני השימוש בנייר הסינון. השריית הנייר מוקדם מדי עלולה להוביל לאידוי תמיסת FeCl3 ולשנות את חומרת הפגיעה.
    4. בעזרת מלקחיים עדינים, הרימו את נייר הסינון והניחו אותו על העורק במעלה הזרם של הגשוש, על החלק של העורק המסומן על-ידי הפלסטיק (איור 2D,E). פלסטיק זה משמש כסמן וספייסר. הוא מסמן את האזור הפגוע ומונע דילול מקרי של FeCl3 על ידי הימנעות ממגע עם האזור הלח שמסביב.
      הערה: ודא שנייר הסינון ישר, לא מכווץ או מקופל בדרך אחרת. לאחר שהונח על העורק, אל תשנה את המיקום של נייר הסינון; פעולה זו משנה את היקף הפגיעה.
    5. לאחר הנחת נייר הסינון, הפעל את הטיימר ורשום את זרימת הדם. לאחר 3 דקות, הסר את הנייר והוסף מי מלח במקום הפציעה כדי להסיר את FeCl3 ולעצור את תהליך הפציעה. זה גם עושה את האזור לח. בשלב זה, זרימת הדם צריכה לחזור לרמה הבסיסית, כפי שנרשם לפני הפציעה.
    6. נטר והקלט את הזרימה עד שהיא מצטמצמת ל -10% מההקלטה המקורית או מגיעה לאפס. יש ירידה מתמדת ברגע שהפקקת מתחילה להיווצר באתר הפציעה (איור 3C). שימו לב לתנודות משמעותיות בזרימה במהלך תקופה זו.
    7. כדי ללמוד את יציבות פקקת, לרשום את העלייה המהירה בזרימת הדם לאחר כל ירידה משמעותית ועקבית. האירועים האלה מסווגים כתסחיף עקב פקקת לא יציבה (איור 4D). לאחר ירידה עקבית בזרימה, המפעיל מסוגל לראות את הפגיעה בעורק בסיום הניסוי (איור 2F, חץ כחול/אליפסה מנוקדת).
    8. זמן חסימת כלי הדם מוגדר כהפסקה מוחלטת של זרימת הדם למשך דקה אחת לפחות. רשום את הזמן שבו נוצר פקקת חסימה, כפי שמוצג על ידי קריאת אפס או ירידה משמעותית בזרימה.
    9. סיים את הניסוי ב -30 דקות. אם הפקקת אינה נוצרת תוך 30 דקות מהניטור, הקלט את הזרימה, עצור את ההקלטה והסר את הבדיקה.
    10. נקו את הבדיקה עם אתנול 70% ומברשת כדי להסיר שאריות רקמה/שיער או לכלוך. יבש את הבדיקה לחלוטין לפני הצבתה בקופסת האחסון. יבשו את הבדיקה לחלוטין לפני הכנסתה לקופסת האחסון לאחסון לטווח ארוך.
    11. הרדימו את העכבר על ידי נקע צוואר הרחם. הניחו את הפגר בשקית לסילוק הפגרים, עם תווית שם המעבדה והתאריך.

2. איסוף והכנת דגימות למחקרי מיקרוסקופ אלקטרונים לסריקת פנים טורית (SBF-SEM) לאחר FeCl 3-induced Injury

הערה: פרוטוקול EM המוצג מתאים להכנת דגימה עבור SBF-SEM. טכניקת הדמיה זו מציעה יכולת חסרת תקדים לחקור את המבנה התלת-ממדי של טסיות הדם בקריש. בטכניקה זו, הדגימה מוצגת באופן חזותי כסדרה של תמונות SEM בלוק רציפות, הנוצרות ככל שמתקדמים בדגימה. נקודות עיקריות להכנה זו הן: 1) הדגימה חייבת להיות מוכתמת במתכות כבדות שהוטבעו מראש; ו-2) יש לחתוך את דגימת הפלסטיק המשובצת כראוי להרכבה בתוך ה-SEM (ראה איור 6 לתצוגה חזותית של דגימות גזוזות). צביעה לאחר הטבעה אינה אפשרית בתוך SEM. בעת איסוף דגימה מפגיעה בכלי דם המושרה על ידי FeCl3 לצורך ניתוח EM, יש לבצע את השינויים הבאים בעת ביצוע הניתוח. השינויים בפרוטוקול ניתוח FeCl3 המוצג חלים גם על כל צורה של מיקרוסקופ אלקטרונים. תנאי ההרדמה והשלבים לביצוע חתך וחשיפת עורק התרדמה זהים לפרוטוקול 1.

  1. לאחר חשיפת עורק התרדמה, סמן את מקום הפציעה על-ידי הקפת האזור באופן רופף בין שני חוטים כירורגיים (גודל: 0.1 מ"מ) (איור 5A,B).
  2. הניחו את הגשושית מתחת לעורק, דיסטלית מהחוט התחתון (איור 5C).
  3. הכניסו את פיסת הפלסטיק מתחת לעורק בין שני החוטים כדי לסמן את האתר לפגיעה ב-FeCl3 (איור 5C).
  4. בצע מדידות זרימה לפני ביצוע פציעה כדי לציין את הזרימה הבסיסית. מדידות אלה משמשות כדי להחליט באיזה שלב תיאסף הדגימה.
    הערה: ודא שהקיבוע (3% paraformaldehyde/PFA + 0.1% glutaraldehyde, שניהם מיוצרים ב-1x PBS) מוכן וב-RT. לחלופין, ניתן להשתמש גם בקיבוע עם 2.5% גלוטראלדהיד על רקע מלוחים.
    אזהרה: גם פרפורמאלדהיד וגם גלוטראלדהיד רעילים ומגרים מאוד. בעת הטיפול בהם יש להשתמש בכפפות, מגן עיניים ומסכות כדי להגן עליהם מפני חשיפה. כל פתרונות הקיבוע רעילים, ושלבי הקיבוע צריכים להתבצע במכסה אדים.
  5. בצע את הפציעה על ידי הנחת נייר פילטר FeCl 3 ספוג על העורק (8% FeCl 3 משמש) במשך3 דקות (זמן זה יכול להשתנות גם כן). לאחר 3 דקות, הסר את נייר הסינון והוסף מי מלח במקום הפציעה כדי להסיר שאריות FeCl3 עודפות. שלב זה נחוץ כדי למנוע את ההיקף המשתנה של הפגיעה ולהקל על ספירת הזרימה על ידי הגשושית (איור 5D).
  6. עקוב אחר קריאת הזרימה. כאשר הזרימה יורדת מתחת ל-50% מהערך ההתחלתי, הסר את הבדיקה. יבשו במהירות את האזור והוסיפו את הקיבוע באזור כדי לתקן חיצונית את אזור הפציעה.
  7. החזיקו מיד את העורק ליד אזור הפציעה עם מלקחיים, וחתכו במורד הזרם של החוט התחתון ובמעלה הזרם של החוט העליון. במידת הצורך, בקש מאדם אחר לעזור לחתוך קצה אחד. שים את הרקמה על צלחת תרבית רקמת פלסטיק באותו כיוון כפי שהוא נאסף, ולהוסיף כמה טיפות של קיבוע.
    הערה: חיתוך העורק גורם לדימום נרחב מיידי, לכן הקפד להחזיק את העורק לפני שחותכים אותו בפעם הראשונה. בתרחיש זה, העכבר הוא exsanguinated. העכבר מורדם על ידי exsanguination ו נקע צוואר הרחם.
  8. בעזרת אזמל, נקו את הרקמה הנוספת סביב העורק. שימו לב לתעד את כיוון זרימת הדם. כדי לסמן זאת, חתכו קצה אחד אופקית ואת הקצה השני מחודד/אלכסוני (איור 5E).
  9. שמור את הדגימה בקיבוע (3% PFA ו- 0.1% גלוטראלדהיד) למשך שעה אחת ב- RT. לאחר מכן, אחסנו את הדגימה ב-1% PFA בטמפרטורה של 4°C עד לשליחתה על קרח רטוב למעבדת עיבוד הדגימות לצורך ניתוח EM.
    הערה: אין להקפיא את הדגימות. האתגרים בשיטה זו של איסוף דוגמאות הם:
    1. הקריאה הראשונית עשויה שלא להיות אופטימלית או להשתנות לאחר הפציעה. הדבר עשוי להשפיע על מידת הפגיעה שנבחרה למעצר לצורך ניתוח EM. כדי לטפל בבעיה זו, הקפד להקליט את קריאת קו הבסיס במשך מספר דקות, לאחר שניסית מיקומים שונים של הצבת הגשושית כדי להחליט איזו עמדה היא אופטימלית.
    2. הזמן לעצור את הפגיעה על ידי הוספת חיתוך חיצוני מקובע ובפועל של קטע העורקי לניתוח עשוי להוסיף שונות למידת פקקת. היו זריזים במהלך איסוף הדגימה לאחר תיקון חיצוני.
  10. קבל את הדגימות לעיבוד לניתוח EM ב- 1% PFA על קרח רטוב. שטפו את הדגימות במשך 3 דקות, על קרח, עם חיץ קקודילט 0.1M כדי להתחיל עיבוד נוסף.
  11. תקן את הדגימות במשך שעה אחת על קרח ב 0.1 M cacodylate buffer + 2.5% glutaraldehyde + 2 mM CaCl2.
  12. השליכו את הקיבוע ושטפו את הדגימות עם חיץ נתרן קקודילט קר של 0.1 M המכיל 2 mM CaCl2 (5 x 3 דקות) (איור 6A).
  13. תקן את הדגימות עם תמיסת אוסמיום (3% אשלגן פרוציאניד [K 4 C 6 N6Fe] +חיץ קקודילט 0.3 M + 4 mM CaCl 2 מעורבב עם נפח שווה של 4% אוסמיום טטרוקסיד מימי [OsO4; ב- ddH2 O]) למשך שעה אחת על קרח.
  14. בזמן שהדגימות מתקבעות, הכינו תמיסת הידרט טריכלורואצטאלדהיד (TCH) טרייה 1% ב-ddH2O. דגרו על התמיסה ב-60°C למשך שעה אחת תוך ערבוב עדין.
  15. לאחר התיקון, שטפו את הדגימות עם ddH2O ב- RT למשך 5 x 3 דקות.
  16. דגרו על הדגימות בתמיסת 1% TCH מסוננת (מיוצרת ב-ddH2O) למשך 20 דקות ב-RT.
  17. שטפו את הדגימות עם ddH2O ב-RT (5 x 3 דקות).
  18. תקן את הדגימות ב 2% osmium tetroxide ב ddH2O במשך 30 דקות ב RT.
  19. שטפו את הדגימות עם ddH2O ב-RT במשך 5 x 3 דקות כל אחת.
  20. מניחים את הדגימות באורניל אצטט 1% (מימי) ודגורים למשך הלילה ב -4 מעלות צלזיוס.
  21. שטפו את הדגימות עם ddH2O ב-RT במשך 5X3 דקות כל אחת, ועבדו אותן עם צביעת עופרת אספרטט של וולטון.
  22. En bloc צביעת עופרת אספרטט של וולטון3:
    1. הכינו 30 mM תמיסת חומצה L-אספרטית ב-ddH2O.
      הערה: החומצה האספרטית מתמוססת מהר יותר אם ה-pH מועלה ל-3.8. פתרון מלאי זה יציב למשך 1-2 חודשים אם מקורר.
    2. הפוך 20 mM עופרת חנקתית פתרון ב 10 מ"ל של מלאי חומצה אספרטית, ולהתאים את ה- pH ל 5.5 עם 1 N KOH.
    3. הניחו את הדגימות בתמיסת עופרת אספרטט בטמפרטורה של 60°C למשך 30 דקות, לאחר חמש שטיפות עם ddH2O ב-RT, כל אחת למשך 3 דקות.
  23. יש לייבש את הדגימות עם סדרת אתנול מדורגת. השתמש בהתייבשות כימית לפי פרוטוקול ואלדיביה18.
    1. שטפו את הדגימות בכל אחד מהתמיסות הבאות כדי לייבש את הדגימה בהדרגה (איור 6B):
      25% אלכוהול אתילי למשך 3 דקות
      50% אלכוהול אתילי למשך 3 דקות
      75% אלכוהול אתילי למשך 3 דקות
      95% אלכוהול אתילי למשך 3 דקות
      100% אלכוהול אתילי במשך 10 דקות, וחזור על הצעד פעמיים (סה"כ שלוש כביסות).
  24. שטפו את הדגימות ב-100% פרופילן אוקסיד (PO) במשך 10 דקות, וחזרו על השלב פעמיים (סה"כ שלוש שטיפות).
  25. יש לדגור ב-50%/50% PO/שרף עם מפעיל DMP 30 למשך הלילה ב-RT, ולהטמיע ב-100% Araldite 502/embed 812/DDSA עם מפעיל DMP30 למשך 48 שעות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

הנתונים מוצגים בדרך כלל כזמן לחסימה, או הזמן הדרוש ליצירת פקקת חסימה מלאה. ניתן לשרטט את הנתונים האלה כעקומת הישרדות קפלן-מאייר (איור 4A)19, תרשים נקודתי עם עמודות המראות את זרימת הדם הסופית בזמן הפסקת זרימת הדם או סיום ניסוי (איור 4B), או כגרף קווי (איור 4C). יציבות פקקת ניתן ללמוד באמצעות טכניקה זו. ברוב המקרים, עם פציעת FeCl3, פקקת נוצרת בהדרגה, וככל שהיא גדלה, זרימת הדם פוחתת בהדרגה, ומגיעה לאפ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

היישום המקומי של FeCl3 בכלי הדם כדי לגרום לפקקת הוא טכניקה נפוצה, והיא סייעה בקביעת תפקידים עבור קולטני טסיות שונים, מסלולי איתות ליגנד, ומעכביהם20,21,22,23. המנגנון שבאמצעותו FeCl3 גורם פקקת הוא רב פנים; בעבר, דנודציה של האנדותל נחשבה לגורם לפקקת, אולם בשנים האחרונות, דיווחים רבים הציעו את תפקידם של תאי הדם האדומים וחלבוני הפלזמה בתהליך זה24,25,26,27

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין ניגודי אינטרסים הקשורים למחקר זה.

פרופילי ORCID: S.J.: 0000-0001-6925-2116; ש.ו.ו: 00000-0001-5577-0473.

תודות

המחברים מודים לחברי מעבדת לב לבן על העיון המדוקדק בכתב היד הזה. העבודה נתמכה על ידי מענקים מה-NIH, NHLBI (HL56652, HL138179 ו-HL150818), ופרס הצטיינות של המחלקה לענייני חיילים משוחררים ל-S.W.W., R01 HL 155519 ל-B.S., ומענק תוכנית NIBIB ל-R.D.L.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.9% מי מלח פישר סיינטיפיק BP358-212NaCl משמש לייצור תמיסה של 0.9% מי מלח 
מזרק 1 מ"ל בקטון, דיקינסון ושות' 
190 אתנול הוכחה קופטקV1101 משמש להכנת תמיסת אתנול 70% לשימוש להכנת העכבר לניתוח 
2,2,2 TribromoethanolSigma Aldrich48402
תפר משי קלוע שחור 25 יארד (5-0)DEKNATEL136082-1204
26G x 3/8 מחט בקטון, דיקינסון ושות' 305110
2-מתיל-2-בוטנולסיגמא אולדריץ'240486
פיפט העברה של 7.5 מ"ל, בוגר ל-3 מ"לגלובוס סיינטיפיק בע"מ.135010
רפידות הכנה לאלכוהול (70% אלכוהול איזופרופילמדלייןMDS090735
Araldite GY 502 שירותי מיקרוסקופיה אלקטרונית 10900
צלחת תרבית תאים 35 מ"מ X 10 מ"מ קורנינג אינקורפורייטד 
משקל קומפקטי המדע של וורד 470314-390
מכשיר דיוק עולמיבאורך 12.5 ס"מ15922-G
DMP-30 מפעיל שירותי מיקרוסקופיה אלקטרונית 13600
דודניל סוקסיניק אנהידריד / שירותימיקרוסקופיה אלקטרונית DDSA 13700
שקיות קקי כלבים/שקית סילוק פגר בעלי חייםמוצרי כתר PP-RB-200
דופלר FlowProbeTransonic Systems Inc.MA0.5PSB
EMBED 812 שרף שירותי מיקרוסקופיה אלקטרונית 14900
אלכוהול אתילי, נטול מים 200 הוכחה שירותי מיקרוסקופיה אלקטרונית 15055
מלקחיים להלבשת עיניים, 4 אינץ' מעוקל מלא, סטנדרטי, 0.8 מ"מ טיפים רחביםIntegra Miltex18-784
נייר סינון VWR28310-106
מספריים עדינים - כלים מדעיים עדינים חדים-בוטים 14028-10
אגרוף אוזניים לולאת אצבע כלים מדעיים 24212-01
ספוגי גזה 2 "x 2" – 12 שכבות Dukal Corporation2128
Glutaraldehyde (תמיסה 10%)שירותי מיקרוסקופיה אלקטרונית 16120
Integra Miltex פלדת פחמן להב כירורגי #10Integra® Miltex®4110
ברזל (III) כלוריד SIGMA-ALDRICH157740-100G
ידית סכין Miltex® פלדת אל-חלד עדינה במיוחד מידה 3Integra Lifesciences 157510
חומצה L-אספרטיתסיגמא  פישר  A93100
חומצה L-אספרטיתפישר סיינטיפיק BP374-100
עופרת חנקתית פישר סיינטיפיק מיקרוסקופ L-62
LEICA S8AP0LEICAאינו זמין עודלא זמין עוד מחברת
LEICA S8AP0 מעמד מיקרוסקופ LEICA10447255כבר לא זמין מהחברה
מגבי טישו קלים VWR82003-822
מלקחיים מיקרו ניתוח; שיניים 1x2, עקומה מלאה; רוחב קצה 0.8 מ"מ; חברתמכשירים כירורגיים באורךRS-5157
אוסמיום טטרוקסיד 4% תמיסה מימית שירותי מיקרוסקופיה אלקטרונית 19150
פרפורמלדהיד (תמיסה של 16%)שירותי מיקרוסקופיה אלקטרונית 15710
אשלגן פריציאנידSIGMA-ALDRICHP-8131
תחמוצת פרופילן, מגיב ACS שירותי מיקרוסקופיה אלקטרונית 20401
Rainin Classic Pipette PR-10Rainin17008649
מד זרימה למחקר טרנסוניק סיסטמס בע"מדגם T402B01481: T402
סקוטש מג'יק בלתי נראה, 3/4 אינץ' x 1000 אינץ',סקוטש שקוף 
305289 כרית מחוממת לבעלי חיים קטניםK& H ייצור בע"מדגם: HM10
מאגר נתרן קקודילאט 0.2M, שירותימיקרוסקופיה אלקטרונית11623
אפליקטורים סטריליים עם קצה כותנה מוצרים רפואיים פוריטניים 25-806 1WC
Steromaster Illuminator פישר סיינטיפיק 12-562-21כבר לא זמין מחברת
Surgical Dumont #7 מלקחיים כלים מדעיים 11271-30
Thiocarbohydrazide (TCH)SIGMA-ALDRICH88535
טעינה מחדש של קצה פיפטה אוניברסלי עם שמירה נמוכה (0.1-10 ומיקרו; L)VWR76323-394
שירותי מיקרוסקופיה אלקטרוניתאורניל אצטט&22400
Veet ג'ל קרם מסיר שיערReckitt Benckiser3116875
לבן אנטי סטטי משושה שוקל, בינוני, 64 x 15 x 19 מ"מפישר סיינטיפיק תוכנת S38975
WinDAQ/100 עבור WindowsDATAQ Instruments, Inc.גרסה 3.38זמינה להורדה בחינם. https://www.dataq.com/products/windaq/
ZEISS AxioCam ICC 1ZEISS57615
309659)430165מספריים לניתוח, 4 אינץ' pH7.4 nbsp;

מקורות

  1. Lozano, R., et al. Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010. Lancet. 380 (9859), 2095-2128 (2012).
  2. Raskob, G. E., et al. Thrombosis: a major contributor to global disease burden. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (11), 2363-2371 (2014).
  3. Walton, J. Lead aspartate, an en bloc contrast stain particularly useful for ultrastructural enzymology. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 27 (10), 1337-1342 (1979).
  4. Palta, S., Saroa, R., Palta, A. Overview of the coagulation system. Indian Journal of Anaesthesia. 58 (5), 515-523 (2014).
  5. Joshi, S., Whiteheart, S. W. The nuts and bolts of the platelet release reaction. Platelets. 28 (2), 129-137 (2017).
  6. Periayah, M. H., Halim, A. S., Mat Saad, A. Z. Mechanism action of platelets and crucial blood coagulation pathways in hemostasis. International Journal of Hematology-Oncology and Stem Cell Research. 11 (4), 319-327 (2017).
  7. Alexopoulos, D., Katogiannis, K., Sfantou, D., Lekakis, J. Combination antiplatelet treatment in coronary artery disease patients: A necessary evil or an overzealous practice. Platelets. 29 (3), 228-237 (2018).
  8. Kurz, K. D., Main, B. W., Sandusky, G. E. Rat model of arterial thrombosis induced by ferric chloride. Thrombosis Research. 60 (4), 269-280 (1990).
  9. Denis, C. V., et al. Towards standardization of in vivo thrombosis studies in mice. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 9 (8), 1641-1644 (2011).
  10. Marsh Lyle, E., et al. Assessment of thrombin inhibitor efficacy in a novel rabbit model of simultaneous arterial and venous thrombosis. Thrombosis and Haemostasis. 79 (3), 656-662 (1998).
  11. Kato, Y., et al. Inhibition of arterial thrombosis by a protease-activated receptor 1 antagonist, FR171113, in the guinea pig. European Journal of Pharmacology. 473 (2-3), 163-169 (2003).
  12. Huttinger, A. L., et al. Ferric chloride-induced canine carotid artery thrombosis: a large animal model of vascular injury. Journal of Visualized Experiments. (139), e57981(2018).
  13. Zhang, W., et al. Antithrombotic therapy by regulating the ROS-mediated thrombosis microenvironment and specific nonpharmaceutical thrombolysis Using Prussian blue nanodroplets. Small. 18 (15), 2106252(2022).
  14. Liu, B., et al. Platelet membrane cloaked nanotubes to accelerate thrombolysis by thrombus clot-targeting and penetration. Small. , 2205260(2022).
  15. Refaat, A., et al. Near-infrared light-responsive liposomes for protein delivery: Towards bleeding-free photothermally-assisted thrombolysis. Journal of Controlled Release. 337, 212-223 (2021).
  16. Li, S., et al. Biomimetic nanoplatelets to target delivery hirudin for site-specific photothermal/photodynamic thrombolysis and preventing venous thrombus formation. Small. 18 (51), 2203184(2022).
  17. Subramaniam, S., Kanse, S. M. Ferric chloride-induced arterial thrombosis in mice. Current Protocols in Mouse Biology. 4 (4), 151-164 (2014).
  18. Cocchiaro, J. L., Kumar, Y., Fischer, E. R., Hackstadt, T., Valdivia, R. H. Cytoplasmic lipid droplets are translocated into the lumen of the Chlamydia trachomatis parasitophorous vacuole. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (27), 9379-9384 (2008).
  19. Kaplan, E. L., Meier, P. Nonparametric-estimation from incomplete observations. Journal of the American Statistical Association. 53 (282), 457-481 (1958).
  20. Chauhan, A. K., Kisucka, J., Lamb, C. B., Bergmeier, W., Wagner, D. D. von Willebrand factor and factor VIII are independently required to form stable occlusive thrombi in injured veins. Blood. 109 (6), 2424-2429 (2007).
  21. Andre, P., et al. CD40L stabilizes arterial thrombi by a beta3 integrin--dependent mechanism. Nature Medicine. 8 (3), 247-252 (2002).
  22. Ni, H., et al. Persistence of platelet thrombus formation in arterioles of mice lacking both von Willebrand factor and fibrinogen. Journal of Clinical Investigation. 106 (3), 385-392 (2000).
  23. Bergmeier, W., et al. The role of platelet adhesion receptor GPIbalpha far exceeds that of its main ligand, von Willebrand factor, in arterial thrombosis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (45), 16900-16905 (2006).
  24. Ciciliano, J. C., et al. Resolving the multifaceted mechanisms of the ferric chloride thrombosis model using an interdisciplinary microfluidic approach. Blood. 126 (6), 817-824 (2015).
  25. Eckly, A., et al. Mechanisms underlying FeCl3-induced arterial thrombosis. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 9 (4), 779-789 (2011).
  26. Woollard, K. J., Sturgeon, S., Chin-Dusting, J. P. F., Salem, H. H., Jackson, S. P. Erythrocyte hemolysis and hemoglobin oxidation promote ferric chloride-induced vascular injury. Journal of Biological Chemistry. 284 (19), 13110-13118 (2009).
  27. Shim, Y., et al. Characterization of ferric chloride-induced arterial thrombosis model of mice and the role of red blood cells in thrombosis acceleration. Yonsei Medical Journal. 62 (11), 1032-1041 (2021).
  28. Ghosh, S., et al. Evaluation of the prothrombotic potential of four-factor prothrombin complex concentrate (4F-PCC) in animal models. PLoS One. 16 (10), 0258192(2021).
  29. Wilbs, J., et al. Cyclic peptide FXII inhibitor provides safe anticoagulation in a thrombosis model and in artificial lungs. Nature Communications. 11 (1), 3890(2020).
  30. Wei, Y., Deng, X., Sheng, G., Guo, X. B. A rabbit model of cerebral venous sinus thrombosis established by ferric chloride and thrombin injection. Neuroscience Letters. 662, 205-212 (2018).
  31. Jacob-Ferreira, A. L., et al. Antithrombotic activity of Batroxase, a metalloprotease from Bothrops atrox venom, in a model of venous thrombosis. International Journal of Biological Macromolecules. 95, 263-267 (2017).
  32. Zhou, X., et al. A rabbit model of cerebral microembolic signals for translational research: preclinical validation for aspirin and clopidogrel. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 14 (9), 1855-1866 (2016).
  33. Yang, X., et al. Effect of evodiamine on collagen-induced platelet activation and thrombosis. BioMed Research International. 2022, 4893859(2022).
  34. Li, W., McIntyre, T. M., Silverstein, R. L. Ferric chloride-induced murine carotid arterial injury: A model of redox pathology. Redox Biology. 1 (1), 50-55 (2013).
  35. Li, W., Nieman, M., Sen Gupta, A. Ferric chloride-induced murine thrombosis models. Journal of Visualized Experiments. (115), e54479(2016).
  36. Holly, S. P., et al. Ether lipid metabolism by AADACL1 regulates platelet function and thrombosis. Blood Advances. 3 (22), 3818-3828 (2019).
  37. Bird, J. E., et al. Prediction of the therapeutic index of marketed anti-coagulants and anti-platelet agents by guinea pig models of thrombosis and hemostasis. Thrombosis Research. 123 (1), 146-158 (2008).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

ferricCarotid Artery
פקקת עורקים המושרה על ידי ברזל כלוריד ואיסוף דגימות לניתוח מיקרוסקופ אלקטרונים תלת ממדי
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.