מאמר שיטה

שיטות לחקר האופטיקה, הפיזיולוגיה והביוכימיה של עין תרכובת הזבוב

24 במרץ 2023

 , 
1Department of Medical Neurobiology, Faculty of Medicine and the Edmond and Lily Safra Center for Brain Sciences (ELSC), Hebrew University

במאמר זה

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מאמרים שנדונו:

Muñoz Arias, M., Douglass, J. K., Wehling M. F., Stavenga, D. G. תרשימים אוטומטיים של המרחב החזותי של עיניים מורכבות של זבובי בית. כתב העת לניסויים חזותיים. (181), e63643 (2022).

Wagner, K., Smylla, T. K., Zeger, M., Huber, A. חקר סחר בחלבוני ממברנה בתאי קולטני אור של דרוזופילה באמצעות חלבונים מתויגים eGFP. כתב העת לניסויים חזותיים. (179), e63375 (2022).

Gutorov, R., Katz, B., Minke, B. שיטות אלקטרופיזיולוגיות למדידת רמות פוטופיגמנט בקולטני אור דרוזופילה. כתב העת לניסויים חזותיים. (184), e63514 (2022).

Liu, J., Liu, Y., Chen, W., Ding, Y., Lan, X., Liu, W. טיהור תעלות פוטנציאליות של קולטן חולף דרוזופילה אנדוגני. כתב העת לניסויים חזותיים. (178), e63260 (2021).

Panda, A., Thakur, R., Kumari, A., Raghu, P. ניתוח איתות שומנים בקולטני אור דרוזופילה באמצעות ספקטרומטריית מסה. כתב העת לניסויים חזותיים. (181), e63516 (2022).

מאמר מערכת

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עין תרכובת הזבוב היא מערכת מודל ביולוגית חשובה להבהרת מנגנונים ביולוגיים בסיסיים. חלק מהמנגנונים שנחקרו באמצעות מערכת זו כוללים את הדברים הבאים: ראיית עין מורכבת עם שדה ראייה כמעט פנורמי1; הביופיזיקה, הרכבת החלבונים והביוגנזה של קולטן ה-G הרגיש לאור 2,3,4; מערכת העברת האותות בתיווך פוספוליפאז Cβ 5,6; הפעלה ואפנון של ערוץ TRP ברקמה מקומית 5,6; ההרכבה והתפקוד של קומפלקס האיתות הרב-חלבוני 7,8; המבנה המולקולרי, הביוכימיה והתפקוד של מיחזור אינוזיטול-פוספוליפידים 9,10; והטרנסלוקציה התת-תאית בתיווך אותות של חלבוני איתות11,12. המבנה האנטומי והאופטיקה הייחודיים של עין תרכובת הזבוב נחקרו בהרחבה, וחשפו מנגנוני התפתחות בסיסיים ויכולות ראייה.

אוסף שיטות זה כולל את עבודתם של מדענים מובילים שפיתחו ושכללו שיטות לחקר חלק מהמנגנונים הנ"ל בעין תרכובת הזבוב. מוניוז ועמיתיו מתארים שיטה לניתוח כמותי של הסידור האופטי של עין הזבוב המספקת תיאור מדויק של העין המורכבת והארגון המרחבי שלה13. שיטה זו חיונית לחקר העיבוד העצבי של מידע חזותי בפירוט. חשוב לציין, נעשו ניסיונות רבים לייצר עיניים מלאכותיות בהשראת ביו, ואלה הסתמכו על מחקרים כמותיים של עיניים מורכבות קיימות. וגנר ועמיתיו משתמשים בפסאודו-אישון עמוק, תופעה אופטית ייחודית של העין המורכבת, ומיקרוסקופ הגברה גבוהה עם נטרול אופטי של הקרנית כדי למקם חלבונים מתויגים eGFP בתוך תאי קולטני האור של דרוזופילה 14. שיטה זו מאפשרת איתור פגמים מבניים ברבדומרים עקב ניוון קולטני אור ולוקליזציה תאית וסחר בחלבוני איתות חשובים. גוטורוב ועמיתיו משתמשים במדידות אלקטרופיזיולוגיות מכל העין או מתאי קולטני אור בודדים כדי למדוד את רמת מצבי הפוטופיגמנט in vivo ואת המודולציות שלהם על ידי מוטציות ספציפיות בחלבוני איתות15. שיטה זו מנצלת את תזוזות המטען בתוך מצב פיגמנט חזותי (R) המושרה על ידי ספיגת פוטונים, מה שמביא להיווצרות מצב פיגמנט שני יציב בחושך (M). שיטה נוספת משתמשת בדפולריזציה ממושכת לאחר כיבוי אור (PDA) המנצלת את התכונות הדו-יציבות הכהות של הפיגמנט החזותי ואת ההבדלים בספקטרום הספיגה של מצבי R ו-M של הזבוב. מכיוון שה-PDA תלוי בהמרה של כמות גדולה של פוטופיגמנט, אפילו הפגם הקל ביותר בביוגנזה של הפוטופיגמנט עלול להוביל ל-PDA חריג הניתן לזיהוי בקלות. ואכן, מוטציות של דרוזופילה המציגות PDA לא תקין הובילו לגילוי חלבוני איתות חדשים. דוגמה יוצאת דופן לכך היא גילוי קומפלקס החלבון החדש המורכב מהפעלת חלבון הפיגום אך ללא פוטנציאל לוואי D (INAD), החלבון קינאז C הספציפי לעין (eyePKC), הפוספוליפאז Cβ (PLCβ) ותעלת פוטנציאל הקולטן החולף (TRP). בפעם הראשונה, ליו ועמיתיו מציגים טכניקה לטיהור ערוץ ה-TRP של דרוזופילה 16. שיטת טיהור זיקה שונה זו משתמשת באסטרטגיית תחרות המבוססת על מנגנון ההרכבה של מתחם האיתות INAD. אסטרטגיה זו מאפשרת טיהור של תעלת ה- TRP האנדוגנית. על פי שיטה זו, תחילה שבר PLCβ הקשור לחרוזי ניקל מתויג בהיסטידין ומשמש למשיכת קומפלקס החלבון האנדוגני INAD המתקבל מהומוגנטים של ראש דרוזופילה . לאחר מכן, מקטעי TRP המתויגים עם גלוטתיון S-transferase (GST) מטוהר יתר על המידה מתווספים לחרוזי ה-Ni כדי להתחרות בערוץ ה-TRP האנדוגני הקשור ל-INAD. לבסוף, כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל משמשת להפרדת שברי ערוץ ה-TRP המתויגים בסופרנטנט מערוץ ה-TRP האנדוגני. פנדה ועמיתיו מדווחים על טכניקה רגישה לזיהוי וכימות מספר סוגים של ליפידים בתאי קולטני אור דרוזופילה באמצעות ספקטרומטריית מסה17. הפעלת PLCβ חיונית לפוטו-טרנסדוקציה, מכיוון שהדבר מוביל להידרוליזה של פוספטידילינוזיטול 4,5 ביספוספט (PI(4,5)P2) בקרום פני השטח. תגובה זו מובילה בסופו של דבר להפעלת ערוץ ה- TRP. בנוסף, פעילות PLCβ מביאה ליצירת מיני שומנים רבים. הוצע כי כמה ממיני השומנים הללו עשויים לקחת חלק בהפעלת TRP ולמלא תפקידי מפתח בארגון התפקודי של קולטני אור לאופטימיזציה של התמרה חושית. במחקר של Panda et al.17, ממצאים אלה הוערכו על ידי בידוד מוטציות דרוזופילה המכילות אנזימים פגומים השולטים ברמות של שומנים ספציפיים.

עין תרכובת הזבוב היא מערכת ניסויית שימושית להבהרת מנגנונים בסיסיים בביולוגיה. ניתן להשתמש במתודולוגיה הגנטית רבת העוצמה שפותחה בדרוזופילה כדי לנתח ולגלות את חלבוני האיתות המעורבים בפוטו-טרנסדוקציה של זבובים. אוסף שיטות זה מתאר בפירוט טכניקות עיקריות לחקירת המנגנונים הבסיסיים של ראיית זבובים, כולל ניתוח אנטומי ואופטי של העין המורכבת והמרכיבים המולקולריים והתגובות הביוכימיות של תאי קולטני האור. מאמרי הווידיאו כוללים גם עצות חשובות לגבי הקשיים הגלומים במתודולוגיות אלה. איסוף שיטות זה אמור להועיל גם למדענים מחוץ לתחום מחקר זה מכיוון שניתן להתאים טכניקות אלה לתכשירים ביולוגיים אחרים.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחבר אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחבר אין אישורים.

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Douglass, J. K., Wehling, M. F. Rapid mapping of compound eye visual sampling parameters with FACETS, a highly automated wide-field goniometer. Journal of Comparative Physiology A: Neuroethology, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 202 (12), 839-851 (2016).
  2. Xiong, L., et al. ER complex proteins are required for rhodopsin biosynthesis and photoreceptor survival in Drosophila and mice. Cell Death and Differentiation. 27 (2), 646-661 (2020).
  3. Rosenbaum, E. E., et al. XPORT-dependent transport of TRP and rhodopsin. Neuron. 72 (4), 602-615 (2011).
  4. Vought, B. W., et al. Characterization of the primary photointermediates of Drosophila rhodopsin. Biochemistry. 39 (46), 14128-14137 (2000).
  5. Randall, A. S., et al. Speed and sensitivity of phototransduction in Drosophila depend on degree of saturation of membrane phospholipids. The Journal of Neuroscience. 35 (6), 2731-2746 (2015).
  6. Minke, B., Pak, W. L. The light-activated TRP channel: The founding member of the TRP channel superfamily. Journal of Neurogenetics. 36 (2-3), 55-64 (2022).
  7. Huber, A., et al. The transient receptor potential protein (Trp), a putative store-operated Ca 2+ channel essential for phosphoinositide-mediated photoreception, forms a signaling complex with NorpA, InaC and InaD. The EMBO Journal. 15 (24), 7036-7045 (1996).
  8. Tsunoda, S., et al. A multivalent PDZ-domain protein assembles signalling complexes in a G-protein-coupled cascade. Nature. 388 (6639), 243-249 (1997).
  9. Raghu, P., Basak, B., Krishnan, H. Emerging perspectives on multidomain phosphatidylinositol transfer proteins. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1866 (9), 158984(2021).
  10. Raghu, P., Yadav, S., Mallampati, N. B. Lipid signaling in Drosophila photoreceptors. Biochimica et Biophysica Acta. 1821 (8), 1154-1165 (2012).
  11. Bahner, M., et al. Light-regulated subcellular translocation of Drosophila TRPL channels induces long-term adaptation and modifies the light-induced current. Neuron. 34 (1), 83-93 (2002).
  12. Schopf, K., Huber, A. Membrane protein trafficking in Drosophila photoreceptor cells. European Journal of Cell Biology. 96 (5), 391-401 (2017).
  13. Muñoz Arias, M., Douglass, J. K., Wehling, M. F., Stavenga, D. G. Automated charting of the visual space of housefly compound eyes. Journal of Visualized Experiments. (181), e63643(2022).
  14. Wagner, K., Smylla, T. K., Zeger, M., Huber, A. Studying membrane protein trafficking in Drosophila photoreceptor cells using eGFP-tagged proteins. Journal of Visualized Experiments. (179), e63375(2022).
  15. Gutorov, R., Katz, B., Minke, B. Electrophysiological methods for measuring photopigment levels in Drosophila photoreceptors. Journal of Visualized Experiments. (184), e63514(2022).
  16. Liu, J., Liu, Y., Chen, W., Ding, Y., Lan, X., Liu, W. Purification of endogenous Drosophila Transient Receptor Potential channels. Journal of Visualized Experiments. (178), e63260(2021).
  17. Panda, A., Thakur, R., Kumari, A., Raghu, P. Analysis of lipid signaling in Drosophila photoreceptors using mass spectrometry. Journal of Visualized Experiments. (181), e63516(2022).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

DrosophilaPhotoreceptor CellsMembrane Protein TraffickingPhotopigment LevelsElectrophysiological MethodsEndogenous ChannelsLipid SignalingMass SpectrometryVisualized Experiments

מאמרים קשורים