בדיקת ספיגת נוגדנים למעקב אחר אנדוציטוזה מסוג חריץ / דלתא במהלך החלוקה הא-סימטרית של אבות גליה רדיאלית של דגי זברה

סיכום

עבודה זו מפתחת בדיקת ספיגת נוגדנים להדמיית איתות תוך שושלת Notch/DeltaD בחלוקת אבות גליה רדיאלית במוח דג הזברה העוברי.

תקציר

חלוקת תאים אסימטרית (ACD), המייצרת שני תאי בת בעלי גורלות שונים, היא בסיסית ליצירת מגוון תאי. באיברים המתפתחים הן של חסרי חוליות והן של בעלי חוליות, חלוקה א-סימטרית של אבות יוצרת בת נוץ'^היי המתחדשת מעצמה ובת נוץ'^לו מבדילה. במוח של דגי זברה עובריים, אבות גליה רדיאלית (RGPs) – תאי הגזע העצביים העיקריים של בעלי החוליות – עוברים לרוב ACD כדי ללדת RGP אחד ותא עצב מתמיין אחד. הבהירות האופטית והנגישות הקלה של עוברי דגי זברה הופכות אותם לאידיאליים עבור הדמיה בהילוך מהיר in vivo כדי להמחיש ישירות כיצד ומתי אסימטריה של איתות Notch נוצרת במהלך ACD. מחקרים אחרונים הראו כי אנדוציטוזה דינמית של ליגנד Notch ligand DeltaD ממלאת תפקיד מכריע בקביעת גורל התא במהלך ACD, והתהליך מווסת על ידי וסת הקוטביות השמור אבולוציונית Par-3 (הידוע גם בשם Pard3) והקומפלקס המוטורי של הדיניין. כדי להמחיש את דפוסי הסחר in vivo של אנדוזומי איתות Notch ב-RGPs מיטוטיים, פיתחנו את בדיקת ספיגת הנוגדנים הזו. באמצעות הבדיקה, חשפנו את הדינמיקה של אנדוזומים המכילים DeltaD במהלך חלוקת RGP.

מבוא

איתות חריץ שולט בהחלטה ובדפוס של גורל התא במהלך ההתפתחות במטזואנים¹, ומחקרים אחרונים הראו כי איתות Notch בחלוקת תאי גזע תלוי בעיקר בסחר אנדוציטי ^2,3. Endocytosed Notch/Delta יכול להפעיל איתות Notch בגרעין ולשפר את השעתוק של גנים המטרה Notch ^4,5,6. תנועה אנדוזומלית מסוג Directional Notch/Delta נצפתה לראשונה בתאי Drosophila sensory organy precursor (SOP) במהלך חלוקת התאים הא-סימטרית שלה (ACD), וכתוצאה מכך פעילות איתות Notch גבוהה יותר ב-pIIa מאשר ב-pIIb ^7,8. בדיקות ספיגת נוגדנים עם נוגדנים אנטי דלתא ואנטי Notch יושמו כדי לפקח על התהליך האנדוציטי בתאי SOP מיטוטיים. אנדוזומים מסוג Notch/DeltaD נעים יחד עם חלבון קינזין מוטורי אל הציר המרכזי במהלך הציטוקינזיס, ועוברים טרנסלוקציה אסימטרית לתא pIIa עקב המערך האנטי-מקבילי של הציר המרכזי הא-סימטרי ברגע האחרון של חלוקת התא ^3,8. מחקרים אלה שפכו אור על המנגנונים המולקולריים המווסתים חלוקה אסימטרית בתאי SOP דרוזופילה, אך לא ברור אם תהליכים אנדוציטיים דומים מתרחשים באבות גליה רדיאלית של בעלי חוליות (RGPs).

יתר על כן, המנגנונים המולקולריים המווסתים איתות Notch/DeltaD אסימטרי במהלך חלוקת RGP של בעלי חוליות אינם מובנים היטב. בדגי זברה, דווח כי האינטראקציה של Notch ו- Delta מקלה על אנדוציטוזה של ליגנד DeltaD⁹. לא ידוע אם אנדוציטוזה של DeltaD יכולה להשפיע על בחירת גורל התא של תאי בת במוח החוליות המתפתח. מחקרים אחרונים מראים כי הזרקת נוגדנים אנטי-דלתא-D מצומדים פלואורסצנטית לתוך הצינור העצבי יכולה לתייג אנדוזומי Sara באופן ספציפי בתאים נוירואפיתליאליים, ואנדוזומי אנטי-DeltaD המכילים Sara מפרידים באופן מועדף לתאי בת מתרבים¹⁰. הוצע כי איתות Notch מהאנדוזומים יכול לווסת את גורל תאי הבת. תוצאות קודמות הראו שרוב תאי RGP של דגי זברה במוח הקדמי המתפתח עוברים ACD, וקביעת גורל תאי הבת תלויה באיתות Notch/DeltaD¹¹. על מנת להבהיר את טבעו של איתות Notch/DeltaD תוך שושלת בדגי זברה, פיתחנו את בדיקת ספיגת הנוגדנים נגד DeltaD במוח המתפתח של דגי זברה. באמצעות פרוטוקול זה, ביצענו בהצלחה תיוג חי והדמיה של סחר אנדוציטי DeltaD ב- RGPs מיטוטיים.

הנוגדן נגד DeltaD המסומן באופן פלואורסצנטי מופנם ביעילות לתוך RGPs לאורך החדר הקדמי במוח. זה הקל מאוד על גילוי הסחר הכיווני של אנדוזומי DeltaD בחלוקה אסימטרית של RGPs^12,13. בהשוואה לפרוטוקולים קודמים של ספיגת נוגדנים שפותחו עבור תרביות Drosophila notum וחוט השדרה 10 של דג הזברה, פרוטוקול זה השיג תיוג אנטי-DeltaD ארוך טווח ויעיל ביותר בשכבת תאי חדר המוח, במיוחד עם פחות^מ-10 nL של תערובת נוגדנים במיקרו-הזרקה. הזרקת חדר המוח האחורי נוחה מאוד ליישום בדיקת ספיגת הנוגדנים במוח המתפתח, שכן חדר המוח האחורי מורחב היטב בעוברים של דגי זברה ומתמלא בנוזל מוחי שדרתי בשלב ההתפתחות המוקדם¹⁴. על ידי הזרקת תערובת הנוגדנים לחדר המוח האחורי מבלי לפגוע ברקמות מתפתחות חיוניות, הפרוטוקול מזער ככל האפשר נזק אפשרי לאזור הדימות במוח הקדמי. המינון המופחת של הנוגדן הראשוני המוזרק מנע גם מתופעות לוואי אפשריות של הפרעה לאיתות אנדוגני של Delta-Notch in vivo. פרוטוקול זה יכול להיות משולב בקלות עם הפרעות פרמקולוגיות או גנטיות אחרות, בשימוש בשלבים התפתחותיים שונים, ואולי מותאם למוח הבוגר, כמו גם אורגנואידים מוח דו-ממדיים / תלת-ממדיים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים. יחד, הפרוטוקול איפשר להבין כיצד ומתי נוצרת אסימטריה באיתות Notch במהלך ACD. האתגר העיקרי ליישום מוצלח של פרוטוקול זה הוא להשיג אספקה מדויקת של ריכוזים מתאימים של הנוגדן בהתבסס על תנאי ניסוי ספציפיים.

פרוטוקול

השתמשנו בקו מסוג AB פראי וקו מהונדס Tg [ef1a:Myr-Tdtomato] לצורך המחקר. כל הניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) באוניברסיטת קליפורניה, סן פרנסיסקו, ארה"ב (מספר אישור: AN179000).

1. הכנת עוברים של דגי זברה

1. הציבו מכלי חציית דגים בשעות אחר הצהריים לפני השעה 17:00, עם נקבת דג בר אחת ודגי Tg זכר אחד [ef1a:Myr-Tdtomato] על ידי שימוש במחיצות כדי להפריד ביניהם בכל מכל.
2. הסר את המחיצות לפני השעה 11:00 מכל מכלי המעבר למחרת בבוקר. שמור על שקט ואל תפריע לדגים בזמן שהם מזדווגים. ההשרצה מתרחשת בדרך כלל תוך 30 דקות לאחר הסרת החוצצים. הביציות המופרות נשארות בתחתית המיכל.
   1. לאסוף ביצים מופרות מן המיכלים עם מסנן רשת. מעבירים את הביציות על ידי שטיפתן לצלחת פטרי מלאה במי ביצים ובוחנים את העוברים תחת מיקרוסקופ מנתח בהגדלה של פי 10 עד פי 20.
3. העבירו את העוברים המופרים לצלחת פטרי נקייה המכילה כ-20 מ"ל של תווך עובר (100 מ"ל של תמיסת מלאי פי 1,000 מכילה 29.4 גרם NaCl, 1.27 גרם KCl, 4.85 גרם CaCl 2.2H 2 O ו-8.13 גרם MgSO_{4.7H 2}O) עם פיפטות פסטר מזכוכית גדולה. שמור את העוברים ב 28 ° C. שמור 50 עוברים מופרים לכל צלחת פטרי עם 30 מ"ל של עובר בינוני ב 28.5 ° C.
   הערה: זוג דגים אחד מייצר בדרך כלל 100-300 עוברים, ושיעור ההפריה וההישרדות של עוברים בריאים הוא מעל 95% עבור כל הזדווגות.
4. למחרת בבוקר, הוציאו את העוברים מהאינקובטור בשעה 8:00 בבוקר, כאשר העוברים הגיעו לשלב התפתחותי של ~18-20 שעות לאחר ההפריה (hpf). צפו בהם תחת מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי בהגדלה של פי 20, תוך שימוש באור לבן בהתחלה. בשלב זה, עוברי דגי הזברה נמצאים בשלב 20 הסומיט.
   1. השליכו עוברים מתים עכורים או קרועים מתחת למיקרוסקופ באמצעות פיפטה מזכוכית.
5. הפעל את מנורת הפלואורסצנט ובחר את הגדרת מסנן RFP של המיקרוסקופ. לאחר מכן, בחר את העוברים עם פלואורסצנטיות אדומה חזקה ולהעביר אותם לצלחת חדשה עם מי ביצה.
   1. יש לפרק את העוברים ידנית בעזרת שני מלקחיים עדינים (קצות המלקחיים צריכים להיות חדים ולא פגומים) תחת אור לבן (טבלת חומרים).
   2. החזיקו את הכוריון עם זוג מלקחיים אחד ועשו קרע בכוריון עם המלקחיים האחרים. פתחו את הקרע בזהירות בעזרת המלקחיים, והפכו אותו לגדול מספיק כדי שהעובר יוכל לעבור דרכו על ידי דחיפת העובר בעדינות עם קצות המלקחיים האחרים.
6. העבירו את העוברים המפרקים לצלחת פטרי חדשה עם מדיום עוברי טרי לשטיפה מהירה לפני מיקרו-הזרקה.

2. הכנת מיקרו-הזרקה

1. השתמש בנימים (1.2 מ"מ OD, 0.9 מ"מ ID, עם חוט להט) למשיכת מחטי הזרקה עדינות על מושך. תכנן וייעל את תוכנית המשיכה בהתאם למדריך.
2. פתח את קצה המחט עם מלקחיים תחת מיקרוסקופ דיסקציה סטריאו. הפוך את קוטר הקצה סביב 10 מיקרומטר, ואת זווית התחדדות סביב 30°.
3. הצמד את הנוגדן החד-שבטי נגד Dld של העכבר עם האנטי-עכבר-IgG-Atto647N לפני ההזרקה.
   1. עבור כל ניסוי הזרקה, לערבב 0.5 μL של נוגדן anti-Dld (0.5 מ"ג / מ"ל) עם 2 μL של נוגדן נגד עכבר IgG-Atto647N (1 מ"ג / מ"ל) על ידי pipetting 5-10 פעמים. לאחר מכן, דגרו בטמפרטורת החדר לפחות 30 דקות (או על קרח במשך 2-3 שעות).
   2. לאחר הדגירה, הוסף 2.5 μL של חיץ חוסם (10 מ"ג / מ"ל עכבר IgG) ו 0.5 μL של 0.5% פנול אדום לתערובת הנוגדנים, ופיפטה 10x כדי לערבב היטב, כדי לחסום נוגדנים לא מצומדים שנותרו בתערובת.
      הערה: עבור כל ניסוי, הכינו תערובת אחת נוספת ללא נוגדן נגד Dld והשתמשו בה כבקרה.
4. הכינו אגרוז של 1% נקודת התכה נמוכה בתווך העוברי. מחממים את תערובת האגרוז ב-70 מעלות צלזיוס עד שהתערובת הופכת לשקופה.
   1. Aliquot פתרון agarose ב 2 מ"ל צינורות microcentrifuge. שמור את aliquots בלוק חום ב ~ 40 ° C.
5. יש לשטוף את העובר בצינור המכיל 1% נקודת התכה נמוכה למשך 3 שניות.
6. הניחו את העובר על מכסה צלחת פטרי מפלסטיק הפוך יחד עם טיפות בודדות של אגרוז (~30-40 μL) כדי להרכיב כל עובר בנפרד על המכסה, כפי שמוצג באיור 1. הניחו את העוברים שטוחים לרוחב באגרוז ושמרו על תנוחה זו עד שהאגרוז התמצק בטמפרטורת החדר.
7. הר 12 עוברים בשלוש שורות אחד אחד כמו לעיל. מכסים את כל העוברים הרכובים באגרוז עם מדיום ביצית.

3. מיקרו-הזרקה

1. שים את העוברים המשובצים מתחת לסטריאומיקרוסקופ וכסה את האגרוז במי ביצה.
2. מקמו את מזרק לחץ האוויר יחד עם מיקרומניפולטורים, ומקמו אותם קרוב למיקרוסקופים כפי שמוצג באיור 1. השתמש בבלון גז פלדה המכיל חנקן גזי (N₂) בלחץ גבוה כמשאב האוויר.
   1. פתח את שסתום הגז רק לאחר שהעוברים הותקנו באגרוז. לאחר מכן, טען מקדימה את מחט הזכוכית המוכנה עם 2 μL של תערובת נוגדנים על המיקרומניפולטור, כפי שמוצג באיור 1, בעת שימוש במודול המילוי הקדמי של המיקרו-מזרק.
   2. כוונן את לחץ הכניסה ל~80-90 psi, ואת לחץ ההזרקה ל~20 psi.
3. כיול נפח ההזרקה באמצעות מיקרומטר מתחת למיקרוסקופ, כפי שתואר קודם¹⁵. הגדר את משך זמן הכוונון להיות בין 10 אלפיות השנייה ל- 120 אלפיות השנייה, בהתאם לגודל פתח המחט. העבר כל פעימה של הזרקה על ידי הקשה על המשוט. כוונן את נפח ההזרקה של כל מסירה ל~ 4-5 nL.
4. יש לדחוף את קצה מחט המיקרו-הזרקה דרך לוחית הגג הגבית של המוח האחורי לנקודת הציר r0/r1, ולהזריק כ-10 nL (שתיים או שלוש פעימות) של תערובת נוגדנים מבלי לפגוע ברקמת המוח. שימו לב לזרימת נוזלים אדומים בחדר המוח.
   הערה: חדר המוח האחורי הוא אחורי לגבול המוח האחורי של המוח האמצעי. תערובת הנוגדנים המוזרקת המכילה פנול אדום ממלאת את חדר המוח מהמוח האחורי למוח הקדמי באופן מיידי על ידי פיזור עם נוזל מוחי שדרתי.
5. לאחר ההזרקה, להסיר את קצה המחט מן העובר במהירות על ידי סיבוב הידית של micromanipulator. להזרקה מוצלחת, הצבע האדום של התערובת המוזרקת נשאר בחדר המוח ביציבות מבלי לדלוף לתוך האגרוז שמסביב.
6. הזיזו את לוחית ההרכבה מתחת למיקרוסקופ כדי לאתר עובר רכוב אחר במיקום מתאים לחזרות.
   1. לאחר הזרקת שישה עד שמונה עוברים, מקלפים את האגרוז בסכין מיקרוכירורגית כדי לשחרר את העוברים מהאגרוז המשובץ. מעבירים את העוברים המוזרקים לצלחת טרייה עם 30 מ"ל של תווך עובר, ומניחים אותם בטמפרטורת החדר לשלבים הבאים.

4. הדמיה חיה של הרכבה וקיטועי זמן

1. לאחר 30 דקות, להעביר את העוברים שנבחרו ל 10 מ"ל של מדיום העובר. הוסף 420 μL של מלאי טריקאין (4 מ"ג / מ"ל) ל 10 מ"ל של מדיום העובר כדי להרדים את העוברים.
2. כדי להרכיב את העוברים, להכין 0.8% נקודת התכה נמוכה agarose המכיל את אותו ריכוז של tricaine בצינור. שמור את aliquots בלוק חום ב ~ 40 ° C.
3. השתמש פיפטה זכוכית לטבול את העוברים המוזרקים באגרוז חם במשך 3 שניות. לאחר מכן, הוציאו מיד את העוברים מהאגרוז עם אותה פיפטה מזכוכית והניחו את העוברים במרכז צלחות תרבית תחתית זכוכית 35 מ"מ עם טיפת אגרוז מהשפופרת. הניחו על הכוס עובר אחד בלבד בכל טיפה.
4. כוונו את העוברים בעדינות עם בדיקת סיבים או קצה העמסה כדי לשמור על הצד הגבי של המוח העוברי קרוב ככל האפשר לתחתית הזכוכית. כוונן את תנוחת העובר בעדינות כדי להאריך את העובר מבלי לסלסל כאשר האגרוז מתמצק בהדרגה.
5. לאחר מכן, בדקו את מיקום העובר על ידי הפיכת צלחת תחתית הזכוכית. ודא כי כל המוח הקדמי הגבי עם עוברים רכובים כראוי ניתן לראות תחת המיקרוסקופ.
6. הוסף 2-3 מ"ל של 28.5 ° C מחומם מראש תווך עוברי המכיל tricaine כדי לכסות את העובר. הניחו את הצלחת כראוי על השלב מבוקר הטמפרטורה של המיקרוסקופ הקונפוקלי, כפי שמוצג באיור 1. כוונן את הטמפרטורה של תא ההדמיה להיות 28.5 ° C. העובר מוכן כעת להדמיה.
7. בצע הדמיה חיה בהילוך מהיר עם מרווח זמן קבוע באמצעות יעד טבילה במים של 40x.
   1. השתמש בתוכנת בקרת הדימות והמיקרוסקופ (μMANAGER: https://micro-manager.org/)¹⁶.
   2. בחרו את תעלות ההדמיה של 564 ננומטר ו-647 ננומטר לצורך הדמיה של פלואורסצנטיות הממברנה של דגי זברה טרנסגניים MyR-Tdtomato ונוגדי Dld-Atto647N אנדוזומליים בתא (איור 1).
   3. הגדר את עוצמת הלייזר ל- 30% עבור שני הערוצים. השתמש בזמן חשיפה לכל מישור z של 200 אלפיות השנייה עבור כל ערוץ.
   4. עבור כל עובר דג זברה רכוב, השתמש בצעד z סורק של 1 מיקרומטר עבור 20 מישורי z בסך הכל, ובמחזור סריקה של 100 מסגרות זמן.
   5. הגדר את מרווח הזמן בין כל מחזור סריקה ל- 20 שניות ומצב הסריקה כערוץ, פרוסה.

תוצאות

באיור 2A, העוברים שהוזרקו להם Atto647N, ללא קישור עם הנוגדן הראשוני, הראו פלואורסצנטיות רקע בחדר המוח. מעט מאוד חלקיקים פלואורסצנטיים נבלעים ניתן לראות בתאים. עוברי דגי הזברה שהוזרקו נגד Dld-Atto647N הראו כמויות גדולות של חלקיקים פלואורסצנטיים מופנמים ברוב התאים במוח הקדמי המתפתח (איור 2A, פאנל ימני). לאחר התקרבות כדי להתמקד ב-RGPs מיטוטיים, כפי שמוצג באיור 2B, הצלחנו לתעד את התנועה הדינמית של אנדוזומים תוך-תאיים אנטי-Dld-Atto647N ב...

דיון

פיתחנו בדיקת ספיגת נוגדנים לתיוג והדמיה של סחר אנדוזומלי Notch/Delta באבות גליה רדיאלית של דגי זברה ביעילות גבוהה. בהשוואה לשיטות קודמות ששימשו למעקב אחר נוגדנים מסומנים נגד DeltaD בתאי SOP^{דרוזופילה 7,8,} השיטה שלנו השתמשה במיקרו-הזרקה במקום דגירה של דגימות בנוגדן המצומד. נוגדנים מצומדים פלואורסצנטית נגד Dld הוזרקו במיקרו לחדר המוח האחורי; טכניקה זו אינה גורמת לפציעה, כפי שמעידה התפתחות תקינה והתאוששות מלאה של עוברים לאחר ההזרקה. החדרים העובריים הם רציפים, ומאפשרי...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
צלחת תרבית תחתית זכוכית 35 מ"מ	תאגיד MatTek	P35GC-1.5-10-C
מזרק לחץ אוויר	Narishige	IM300
נגד עכבר-IgG-ATTO647N	סיגמא-אולדריץ'	50185
CaCl2.2H2O	נימי Sigma-Aldrich	C3306
1.2 מ"מ OD, 0.9 מ"מ ID, עם נימה	World Precision Instruments	1B120F-6
CSU-W1 דיסק מסתובב/שדה רחב במהירות גבוהה	Nikin	N/A	Nikon  מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך Ti עם שדה ראייה גדול של CSU-W1
פינצטה רפואית Dumont סגנון 5	תומאס סיינטיפיק	72877-D
חולץ Flaming-Brown P897	Sutter Instruments	N/A
https://www.sutter.com/manuals/P-97-INT_OpMan.pdf KCl	Millipore	529552
MgSO4.7H2O
	World Precision Instruments	WPI M3301R
נגד DLD	Abcam	AB_1268496
Mouse IgG חוסם מאגר מבית Zenon	Thermofisher Scientific	Z25008
NaCl	Sigma-Aldrich	S3014
פנול אדום	Sigma-Aldrich	P0290
Stemi 2000	צייס	N/A
Tricaine	Sigma-Aldrich	E10521
UltraPureTM נקודת התכה נמוכה אגרוז	Invitrogen	16520050

, . מיקרומניפולטורים Sigma-Aldrich M2773 עכבר