עבודה זו מפתחת בדיקת ספיגת נוגדנים להדמיית איתות תוך שושלת Notch/DeltaD בחלוקת אבות גליה רדיאלית במוח דג הזברה העוברי.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
בדיקת ספיגת נוגדנים למעקב אחר אנדוציטוזה מסוג חריץ / דלתא במהלך החלוקה הא-סימטרית של אבות גליה רדיאלית של דגי זברה
במאמר זה
סיכום
תקציר
חלוקת תאים אסימטרית (ACD), המייצרת שני תאי בת בעלי גורלות שונים, היא בסיסית ליצירת מגוון תאי. באיברים המתפתחים הן של חסרי חוליות והן של בעלי חוליות, חלוקה א-סימטרית של אבות יוצרת בת נוץ'היי המתחדשת מעצמה ובת נוץ'לו מבדילה. במוח של דגי זברה עובריים, אבות גליה רדיאלית (RGPs) – תאי הגזע העצביים העיקריים של בעלי החוליות – עוברים לרוב ACD כדי ללדת RGP אחד ותא עצב מתמיין אחד. הבהירות האופטית והנגישות הקלה של עוברי דגי זברה הופכות אותם לאידיאליים עבור הדמיה בהילוך מהיר in vivo כדי להמחיש ישירות כיצד ומתי אסימטריה של איתות Notch נוצרת במהלך ACD. מחקרים אחרונים הראו כי אנדוציטוזה דינמית של ליגנד Notch ligand DeltaD ממלאת תפקיד מכריע בקביעת גורל התא במהלך ACD, והתהליך מווסת על ידי וסת הקוטביות השמור אבולוציונית Par-3 (הידוע גם בשם Pard3) והקומפלקס המוטורי של הדיניין. כדי להמחיש את דפוסי הסחר in vivo של אנדוזומי איתות Notch ב-RGPs מיטוטיים, פיתחנו את בדיקת ספיגת הנוגדנים הזו. באמצעות הבדיקה, חשפנו את הדינמיקה של אנדוזומים המכילים DeltaD במהלך חלוקת RGP.
מבוא
איתות חריץ שולט בהחלטה ובדפוס של גורל התא במהלך ההתפתחות במטזואנים1, ומחקרים אחרונים הראו כי איתות Notch בחלוקת תאי גזע תלוי בעיקר בסחר אנדוציטי 2,3. Endocytosed Notch/Delta יכול להפעיל איתות Notch בגרעין ולשפר את השעתוק של גנים המטרה Notch 4,5,6. תנועה אנדוזומלית מסוג Directional Notch/Delta נצפתה לראשונה בתאי Drosophila sensory organy precursor (SOP) במהלך חלוקת התאים הא-סימטרית שלה (ACD), וכתוצאה מכך פעילות איתות Notch גבוהה יותר ב-pIIa מאשר ב-pIIb 7,8
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
השתמשנו בקו מסוג AB פראי וקו מהונדס Tg [ef1a:Myr-Tdtomato] לצורך המחקר. כל הניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) באוניברסיטת קליפורניה, סן פרנסיסקו, ארה"ב (מספר אישור: AN179000).
1. הכנת עוברים של דגי זברה
- הציבו מכלי חציית דגים בשעות אחר הצהריים לפני השעה 17:00, עם נקבת דג בר אחת ודגי Tg זכר אחד [ef1a:Myr-Tdtomato] על ידי שימוש במחיצות כדי להפריד ביניהם בכל מכל.
- הסר את המחיצות לפני השעה 11:00 מכל מכלי המעבר למחרת בבוקר. שמור על שקט ואל תפריע לדגים בזמן שהם מזדווגים. ההשרצה מתרחשת בדרך כלל תוך 30 דקות לאחר הסרת החוצצים. הביציות המופרות נשארות בת....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
באיור 2A, העוברים שהוזרקו להם Atto647N, ללא קישור עם הנוגדן הראשוני, הראו פלואורסצנטיות רקע בחדר המוח. מעט מאוד חלקיקים פלואורסצנטיים נבלעים ניתן לראות בתאים. עוברי דגי הזברה שהוזרקו נגד Dld-Atto647N הראו כמויות גדולות של חלקיקים פלואורסצנטיים מופנמים ברוב התאים במוח הקדמי המתפתח (איור 2A, פאנל ימני). לאחר התקרבות כדי להתמקד ב-RGPs מיטוטיים, כפי שמוצג באיור 2B, הצלחנו לתעד את התנועה הדינמית של אנדוזומים תוך-תאיים אנטי-Dld-Atto647N ב.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
פיתחנו בדיקת ספיגת נוגדנים לתיוג והדמיה של סחר אנדוזומלי Notch/Delta באבות גליה רדיאלית של דגי זברה ביעילות גבוהה. בהשוואה לשיטות קודמות ששימשו למעקב אחר נוגדנים מסומנים נגד DeltaD בתאי SOPדרוזופילה 7,8, השיטה שלנו השתמשה במיקרו-הזרקה במקום דגירה של דגימות בנוגדן המצומד. נוגדנים מצומדים פלואורסצנטית נגד Dld הוזרקו במיקרו לחדר המוח האחורי; טכניקה זו אינה גורמת לפציעה, כפי שמעידה התפתחות תקינה והתאוששות מלאה של עוברים לאחר ההזרקה. החדרים העובריים הם רציפים, ומאפשרי.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין מה לחשוף.
תודות
הפרויקט נתמך על ידי NIH R01NS120218, פרס זרעי מרי אן קודה-קימבל של UCSF לחדשנות, וצ'אן צוקרברג Biohub.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| צלחת תרבית תחתית זכוכית 35 מ"מ | תאגיד MatTek | P35GC-1.5-10-C | |
| מזרק לחץ אוויר | Narishige | IM300 | |
| נגד עכבר-IgG-ATTO647N | סיגמא-אולדריץ' | 50185 | |
| CaCl2.2H2O | נימי Sigma-Aldrich | C3306 | |
| 1.2 מ"מ OD, 0.9 מ"מ ID, עם נימה | World Precision Instruments | 1B120F-6 | |
| CSU-W1 דיסק מסתובב/שדה רחב במהירות גבוהה | Nikin | N/A | Nikon מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך Ti עם שדה ראייה גדול של CSU-W1 |
| פינצטה רפואית Dumont סגנון 5 | תומאס סיינטיפיק | 72877-D | |
| חולץ Flaming-Brown P897 | Sutter Instruments | N/A | |
| https://www.sutter.com/manuals/P-97-INT_OpMan.pdf KCl | Millipore | 529552 | |
| MgSO4.7H2O | |||
| World Precision Instruments | WPI M3301R | ||
| נגד DLD | Abcam | AB_1268496 | |
| Mouse IgG חוסם מאגר מבית Zenon | Thermofisher Scientific | Z25008 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| פנול אדום | Sigma-Aldrich | P0290 | |
| Stemi 2000 | צייס | N/A | |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| UltraPureTM נקודת התכה נמוכה אגרוז | Invitrogen | 16520050 |
מקורות
- Baonza, A., Garcia-Bellido, A. Notch signaling directly controls cell proliferation in the Drosophila wing disc. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (6), 2609-2614 (2000).
- Chitnis, A. Developmental Dynamics. 235 (4), 886-894 (2006).
- Daed....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
