אנו מציגים שיטה לגירוי כימי גמיש ורב-מודאלי ורישום של פעילות עצבית בו זמנית מתולעים רבות של Caenorhabditis elegans . שיטה זו משתמשת במיקרופלואידיקה, חומרה ותוכנה בקוד פתוח, וניתוח נתונים אוטומטי מפוקח כדי לאפשר מדידה של תופעות עצביות כגון הסתגלות, עיכוב זמני וגירוי crosstalk.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
גירוי רב-מודאלי אוטומטי והקלטה עצבית סימולטנית מאורגניזמים קטנים מרובים
במאמר זה
סיכום
תקציר
מדדי סידן פלואורסצנטיים המקודדים גנטית תרמו רבות להבנתנו את הדינמיקה העצבית מרמת תאי עצב בודדים ועד למעגלים שלמים במוח. עם זאת, תגובות עצביות עשויות להשתנות עקב ניסיון קודם, מצבים פנימיים או גורמים סטוכסטיים, ובכך ליצור את הצורך בשיטות שיכולות להעריך תפקוד עצבי אצל אנשים רבים בבת אחת. בעוד שרוב טכניקות ההקלטה בוחנות חיה אחת בכל פעם, אנו מתארים את השימוש במיקרוסקופ רחב שדה כדי להגדיל את ההקלטות העצביות לעשרות Caenorhabditis elegans או אורגניזמים אחרים בקנה מידה תת-מילימטרי בבת אחת. חומרה ותוכנה בקוד פתוח מאפשרות גמישות רבה בתכנות ניסויים אוטומטיים לחלוטין השולטים בעוצמה ובתזמון של סוגי גירויים שונים, כולל גירויים כימיים, אופטיים, מכניים, תרמיים ואלקטרומגנטיים. בפרט, התקני זרימה מיקרופלואידים מספקים בקרה מדויקת, חוזרת וכמותית של גירויים כימו-סנסוריים ברזולוציית זמן של תת-שנייה. צינור ניתוח הנתונים החצי-אוטומטי של NeuroTracker מחלץ תגובות עצביות אינדיבידואליות וכלל אוכלוסייה כדי לחשוף שינויים פונקציונליים ברגישות ובדינמיקה העצבית. מאמר זה מציג דוגמאות למדידת הסתגלות עצבית, עיכוב זמני וגירוי crosstalk. טכניקות אלה מגבירות את הדיוק והחזרתיות של גירוי, מאפשרות לחקור את השתנות האוכלוסיות, והן ניתנות להכללה לאותות פלואורסצנטיים דינמיים אחרים במערכות ביולוגיות קטנות מתאים ואורגנואידים לאורגניזמים שלמים וצמחים.
מבוא
טכניקות הדמיית סידן אפשרו רישום לא פולשני של דינמיקה עצבית in vivo בזמן אמת באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ומדדי סידן מקודדים גנטית המבוטאים בתאי מטרה 1,2,3. חיישנים אלה משתמשים בדרך כלל בחלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP), כגון משפחת הפפטיד GFP-calmodulin-M13 (GCaMP), כדי להגביר את עוצמת הפלואורסצנטיות בעת הפעלה עצבית ורמות סידן תוך-תאיות גבוהות. הדמיית סידן הייתה חזקה במיוחד בנמטודה C. elegans לבחינת האופן שבו נוירונים ומעגלים עצביים מתפקדים בבעלי חיים 4,5,6,7,8,9,10, שכן טבעם השקוף פירושו שלא נדרש תהליך כירורגי לגישה
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. ציוד הדמיה עצבית
הערה: ראו Lawler and Albrecht15 לקבלת הוראות מפורטות על בניית מערכת הדימות והגירוי, אשר שולטת בתזמון ההארה של המיקרוסקופ, ברכישת התמונה ובהעברת הגירוי (איור 1). בקר גירוי Arduino Nano זול מפעיל את השסתומים הזורמים באמצעות אותות דיגיטליים לבקר שסתומים ושולט בתאורה האופטוגנטית באמצעות אותות מתח אנלוגיים לבקר LED. גירויים אחרים, כגון מנועי רטט ומחממים תרמיים, ניתנים לשליטה באמצעות אותות דיגיטליים או אנלוגיים. בקר הגירוי מסנכרן את הגירוי ואת הקלטת התמונה באמצעות אותות מצלמה, כפי שצוין על ידי תוכנת בקרת המיקרוסקופ Micro-Manager (μManager) בקוד
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
אנו מציגים מספר דוגמאות לדפוסי גירוי המעריכים תופעות עצביות שונות, כולל עיכוב זמני, הסתגלות ודיסאינהיביציה. עיכוב זמני הוא דיכוי רגעי של תגובה עצבית למצגת גירוי שנייה המתרחשת זמן קצר לאחר ההצגה הראשונית14. כדי לבחון את התופעה הזו, בניסוי של פולסים זוגיים, הוצגו שמונה תבניות המורכבות משני פולסי ריח של 1 שניות המופרדים במרווח שנע בין 0 שניות ל-20 שניות (איור 6B; ראו איור 3B לקובץ בקרת הגירוי המתאים). הזירה הוקמה עם נוזל גיר.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
בפרוטוקול זה, אנו מתארים מערכת מיקרוסקופיה בגישה פתוחה להערכת תופעות פעילות עצבית באמצעות העברה מדויקת זמנית של דפוסי גירוי שונים. הפלטפורמה המיקרופלואידית מספקת גירויים חוזרים תוך שמירה על עשרות בעלי חיים בשדה הראייה של המיקרוסקופ. מעט חבילות תוכנה מסחריות למיקרוסקופיה מאפשרות תכנות קל של תבניות תזמון גירוי שונות, ואלה שכן דורשות לעתים קרובות הזנה ידנית של כל תבנית או פורמטים קנייניים של קבצים. לעומת זאת, ניסויים מוגדרים במערכת זו על ידי קבצי טקסט, אשר יכולים להיות שנוצרו על ידי מחשב והם קריאים על ידי תוכנת ניתוח. כאן, .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.
תודות
אנו מודים לפוקס אייברי על בדיקת פרוטוקולים אלה וסקירת כתב היד ולאריק הול על הסיוע בתכנות. המימון לשיטות המוצגות כאן ניתן בחלקו על ידי הקרן הלאומית למדע 1724026 (D.R.A).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| <זנים חזקים>חיידקים | |||
| E. coli (OP50) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Cat# OP50 | |
| מודלים ניסיוניים: אורגניזמים/זנים | |||
| C. elegans זנים המבטאים GCaMP (ואופציונלי, ארגמן) בנוירונים רצויים | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) או מחברים מקבילים של עבודה שפורסמה | NZ1091, לדוגמה | |
| כימיקלים, טיפולים ו-Worm Preparation Supplies | |||
| 2,3-Butanedione | Sigma-Aldrich | Cat# B85307 | diacetyl, דוגמה כימית גירוי |
| סידן כלורי, CaCl2 | Sigma-Aldrich | Cat# C3881 | |
| פלואורסצאין, מלח נתרן | Sigma-Aldrich | Cat# F6377 | |
| דוחה מים | מזכוכית Rain-X | Cat #800002250 | טיפול הידרופובי זכוכית (לשימוש חד פעמי) |
| מגנזיום כלוריד, MgCl2 | Sigma-Aldrich | Cat# M2393 | |
| מדיום גידול נמטודות (NGM) אגר | חתול ג'נסי | #: 20-273NGM | |
| צלחות פטרי (60 מ"מ) | Tritech | Cat #T3305 | |
| פולי (דימתיל סילוקסן) (PDMS): Sylgard 184 | Dow Chemical | Cat# 1673921 | |
| אשלגן פוספט מונו-בסיסי | Sigma-Aldrich | Cat# P5655 | |
| אשלגן פוספט דו-בסיסי | Sigma-Aldrich | Cat# P8281 | |
| נתרן כלורי, NaCl | סיגמא-אולדריץ' | Cat# S7653 | |
| (tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)trichlorosilane (TFOCS) | Gelest | CAS# 78560-45-9 | טיפול הידרופובי זכוכית (עמיד) |
| <חזק>תוכנה ואלגוריתמים | |||
| Arduino IDE | Arduino | https://www.arduino.cc/en/software | |
| ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| MATLAB | MathWorks | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | |
| מיקרו-מנהל | מיקרו-מנהל | https://micro-manager.org/ | |
| תוכנת בקרת מיקרוסקופ | Albrecht Lab | https://github.com/albrechtLab/MicroscopeControl | |
| Neurotracker תוכנת ניתוח נתונים | Albrecht Lab | https://github.com/albrechtLab/Neurotracker | |
| <חזק>מערכת מיקרוסקופ וגירוי אוטומטית | |||
| Axio Observer.A1 מיקרוסקופ הפוך שהוגדר עבור אפיפלואורסצנציה (קוביות מסנן GFP, 5 פעמים; אובייקטיבי או דומה) | Zeiss | Cat #491237-0012-000 | |
| Excelitas X-cite XYLIS תאורת LED | Excelitas | Cat #XYLIS | |
| Orca Flash 4.0 מצלמת sCMOS דיגיטלית | Hamamatsu | Cat #C11440-22CU | |
| Arduino nano | Arduino | Cat #A000005 | |
| שסתום בידוד דיאפרגמה מיניאטורי תלת כיווני (LQX12) | Parker | Cat #LQX12-3W24FF48-000 | שסתום 1: בקרה |
| דו-כיוונית סגורה רגילה (NC) | שסתום צביטה Bio-Chem Valve Inc | Cat #075P2-S432 | שסתום 2: שסתום צביטה תלת כיווני יציאה |
| NResearch | Cat #161P091 | שסתום 3: גירוי בחירה | |
| LED ובקר גירוי אופטוגנטי (615 ננומטר) | Mightex | Cat #PLS-0625-030-S ו-#SLA-1200-2 | |
| ValveLink 8.2 בקר שסתומים דיגיטלי/ידני | AutoMate Scientific | Cat #01-18 | |
| חוטים ומחברים | שונים | ראה איור 2 של פרוטוקול Cell STARS (Lawler, 2021) | |
| <חזק>הכנת מכשיר מיקרופלואידי | |||
| חותך סיבובי במהירות משתנה של Dremel 4000 | Dremel | Cat #F0134000AB | הגדר מהירות ל-5k סל"ד לחיתוך זכוכית |
| Dremel מקדחה תחנת עבודה לכלי סיבובי | Dremel | Cat #220-01 | |
| מקדח יהלום | Dremel | Cat #7134 | |
| שקופית זכוכית, 1 חתול VWR עבה מ"מ | #75799-268 | ||
| סופר זכוכית (סופר יהלומים) | חתול טד פלה | #54468 | |
| Luer 3-way stopcock | Cole-Parmer | Cat #EW-30600-07 | |
| Luer 23 G מחט קהה | VWR | Cat #89134-100 | |
| מכשיר מיקרופלואידי: | מחבר או מפברק מקבצי CAD הקשורים למאמר זה | N/A | |
| מהדק מכשיר מיקרופלואידי: | וורנר אינסטרומנטס (או חנות מכונות) | צינורות מיקרופלואידיים P-2 | |
| , 0.02″ ID | Cole-Parmer | Cat #EW-06419-01 | |
| שפופרת 19 גרם, 0.5 ופריים; | חתול צינור קטן בניו אינגלנד | #NE-1027-12 |
מקורות
- Akerboom, J., et al. Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics. Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, 2(2013).
- Badura, A., Sun, X. R., Giovannucci, A., Lynch, L. A., Wang, S. S. -H.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
