מאמר שיטה

גירוי רב-מודאלי אוטומטי והקלטה עצבית סימולטנית מאורגניזמים קטנים מרובים

DOI:

10.3791/65042

⸱

3 במרץ 2023

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Worcester Polytechnic Institute, 2Graduate School of Biomedical Sciences, UMass Chan Medical School, 3Department of Biology and Biotechnology, Worcester Polytechnic Institute

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מציגים שיטה לגירוי כימי גמיש ורב-מודאלי ורישום של פעילות עצבית בו זמנית מתולעים רבות של Caenorhabditis elegans . שיטה זו משתמשת במיקרופלואידיקה, חומרה ותוכנה בקוד פתוח, וניתוח נתונים אוטומטי מפוקח כדי לאפשר מדידה של תופעות עצביות כגון הסתגלות, עיכוב זמני וגירוי crosstalk.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מדדי סידן פלואורסצנטיים המקודדים גנטית תרמו רבות להבנתנו את הדינמיקה העצבית מרמת תאי עצב בודדים ועד למעגלים שלמים במוח. עם זאת, תגובות עצביות עשויות להשתנות עקב ניסיון קודם, מצבים פנימיים או גורמים סטוכסטיים, ובכך ליצור את הצורך בשיטות שיכולות להעריך תפקוד עצבי אצל אנשים רבים בבת אחת. בעוד שרוב טכניקות ההקלטה בוחנות חיה אחת בכל פעם, אנו מתארים את השימוש במיקרוסקופ רחב שדה כדי להגדיל את ההקלטות העצביות לעשרות Caenorhabditis elegans או אורגניזמים אחרים בקנה מידה תת-מילימטרי בבת אחת. חומרה ותוכנה בקוד פתוח מאפשרות גמישות רבה בתכנות ניסויים אוטומטיים לחלוטין השולטים בעוצמה ובתזמון של סוגי גירויים שונים, כולל גירויים כימיים, אופטיים, מכניים, תרמיים ואלקטרומגנטיים. בפרט, התקני זרימה מיקרופלואידים מספקים בקרה מדויקת, חוזרת וכמותית של גירויים כימו-סנסוריים ברזולוציית זמן של תת-שנייה. צינור ניתוח הנתונים החצי-אוטומטי של NeuroTracker מחלץ תגובות עצביות אינדיבידואליות וכלל אוכלוסייה כדי לחשוף שינויים פונקציונליים ברגישות ובדינמיקה העצבית. מאמר זה מציג דוגמאות למדידת הסתגלות עצבית, עיכוב זמני וגירוי crosstalk. טכניקות אלה מגבירות את הדיוק והחזרתיות של גירוי, מאפשרות לחקור את השתנות האוכלוסיות, והן ניתנות להכללה לאותות פלואורסצנטיים דינמיים אחרים במערכות ביולוגיות קטנות מתאים ואורגנואידים לאורגניזמים שלמים וצמחים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טכניקות הדמיית סידן אפשרו רישום לא פולשני של דינמיקה עצבית in vivo בזמן אמת באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ומדדי סידן מקודדים גנטית המבוטאים בתאי מטרה 1,2,3. חיישנים אלה משתמשים בדרך כלל בחלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP), כגון משפחת הפפטיד GFP-calmodulin-M13 (GCaMP), כדי להגביר את עוצמת הפלואורסצנטיות בעת הפעלה עצבית ורמות סידן תוך-תאיות גבוהות. הדמיית סידן הייתה חזקה במיוחד בנמטודה C. elegans לבחינת האופן שבו נוירונים ומעגלים עצביים מתפקדים בבעלי חיים 4,5,6,7,8,9,10, שכן טבעם השקוף פירושו שלא נדרש תהליך כירורגי לגישה אופטית, ומקדמי גנים ספציפיים לתאים מכוונים ביטוי לתאים המעניינים. טכניקות אלה משתמשות לעתים קרובות בהתקנים מיקרופלואידים, המספקים סביבות מבוקרות במדויק לחקר תופעות ביולוגיות, כימיות ופיזיקליות בקנה מידה פיזיקלי קטן11,12. התקנים מיקרופלואידים נמצאים בשפע למדידת פעילות עצבית, עם עיצובים חדשים הנמצאים בפיתוח ללא הרף, והם מיוצרים בקלות במעבדת המחקר. עם זאת, עיצובים רבים לוכדים חיה אחת בכל פעם, ומגבילים את תפוקת הניסוי 7,9,13. תגובות עצביות לעיתים קרובות משתנות באופן משמעותי בין בעלי חיים עקב הבדלים בניסיון קודם, מצבים פנימיים כגון לחץ או רעב, או גורמים סטוכסטיים כגון רמות ביטוי גנים. הבדלים אלה יוצרים צורך בשיטות שיכולות בו זמנית לגרות ולהתבונן בבעלי חיים רבים ולחלץ מידע מפרטים4.

בנוסף, תופעות נוירומודולטוריות מסוימות מתגלות רק בתנאי גירוי ספציפיים, כגון עיכוב זמני14, המתייחס לדיכוי קצר של תגובות כאשר הגירוי מתרחש ברצף מהיר. מערכות אלקטרופיזיולוגיות יכולות להניע פעילות עצבית על פני מרחב גירוי רחב למטרה זו, ומווסת, למשל, את זרם הפולס החשמלי, המתח, התדר, צורת הגל, מחזור העבודה והתזמון של רכבות גירוי תקופתיות. גירוי עקיף על ידי גירויים או מערכות אופטוגנטיות שזוהו באופן טבעי יפיק תועלת מרוחב דומה של מנגנוני בקרה. כיום, גירויים טבעיים רבים מוצגים באופן פשוט "on-off", כגון הצגה והסרה של ריחות, תוך שימוש במערכות מסחריות שהיו איטיות כדי להוסיף גמישות. עם זאת, מיקרו-בקרים זולים יכולים כעת להפוך את המסירה של מספר סוגים של גירויים לאוטומטית באופן הניתן להתאמה אישית לצרכי החוקרים. בשילוב עם מיקרופלואידיקה, מערכות אלה השיגו את המטרה של תפוקה וגמישות ניסויית מוגברת, המאפשרת לתגובות עצביות למגוון גירויים מדויקים להימדד בו זמנית בבעלי חיים רבים 4,6. גירוי רב-מודאלי יכול לשמש לחקירה נוספת של המעגלים העצביים, כגון על ידי ניטור שינויים ברגישות העצבית בעת גירוי עקבי לפני, במהלך ואחרי הפרעה אורתוגונלית כגון חשיפה לסמים4. היתרונות של מערכות מיקרוסקופיה פתוחות וזולות ברורים לקידום המחקר המדעי, אך בפועל, הצורך במיקור חלקים, בנייה ותיקוף ביצועים יכול לעכב את אימוץ טכניקות אלה.

פרוטוקול זה נועד להקל על חלק מהאתגרים הטכניים הללו. בעוד שהפרוטוקולים הקודמים התמקדו בשימוש בהתקנים מיקרופלואידים ובגירוי בסיסי 9,15,17, אנו מתארים כאן את הבנייה והשימוש במערכת העברת גירויים גמישה, אוטומטית ורב-מודאלית לדימות עצבי ב- C. elegans או באורגניזמים קטנים אחרים המשתמשים בהתקנים מיקרופלואידים שתוארו קודם לכן4. מערכת הקוד הפתוח מתוכנתת באמצעות קבצי טקסט פשוטים כדי להגדיר את הניסויים, ותוכנת ניתוח הנתונים NeuroTracker מחלצת באופן חצי אוטומטי את נתוני הפעילות העצבית מסרטוני המיקרוסקופ. אנו מדגימים את המערכת הזו בעזרת דוגמאות להערכת עיכוב זמני, דיסאינהיביציה וגירוי crosstalk באמצעות תא העצב הכימו-סנסורי AWA, אשר מבצע דה-פולריזציה בתגובה לריחות מזון שונים או בתגובה לאור בעת ביטוי תעלות יונים אופטוגנטיות רגישות לאור 5,6.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. ציוד הדמיה עצבית

הערה: ראו Lawler and Albrecht15 לקבלת הוראות מפורטות על בניית מערכת הדימות והגירוי, אשר שולטת בתזמון ההארה של המיקרוסקופ, ברכישת התמונה ובהעברת הגירוי (איור 1). בקר גירוי Arduino Nano זול מפעיל את השסתומים הזורמים באמצעות אותות דיגיטליים לבקר שסתומים ושולט בתאורה האופטוגנטית באמצעות אותות מתח אנלוגיים לבקר LED. גירויים אחרים, כגון מנועי רטט ומחממים תרמיים, ניתנים לשליטה באמצעות אותות דיגיטליים או אנלוגיים. בקר הגירוי מסנכרן את הגירוי ואת הקלטת התמונה באמצעות אותות מצלמה, כפי שצוין על ידי תוכנת בקרת המיקרוסקופ Micro-Manager (μManager) בקוד פתוח16. עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים הקשורים לכל החומרים, הריאגנטים, הציוד והאורגניזמים המשמשים בפרוטוקול זה.

  1. הגדר את ציוד הדימות העצבי, כולל מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי עם אופטיקת GFP, מצלמת sCMOS עם אות פלט חשיפה דיגיטלי ובקר גירוי15.
  2. חבר את בקר הגירוי למערכות הרצויות באמצעות אותות דיגיטליים או אנלוגיים. עבור הדוגמאות המוצגות להלן, נעשה שימוש במערכות הבאות:
    1. השתמש בבקר שסתום לגירוי כימי. חבר את בקר השסתומים לסולנואיד נוזלי או לשסתומי צביטה (איור 1)15.
    2. השתמש בנורית LED אדומה של 615 ננומטר ובבקר לגירוי אופטוגנטי, המותקן מעל שלב המיקרוסקופ.
  3. הגדר את המחשב עם תוכנת בקרת המיקרוסקופ, צור הגדרת תצורה מוגדרת מראש עם הגדרות ציוד, והבטח פעולה תקינה של בקרת הגירוי15.

2. ייצור מכשירים מיקרופלואידים

הערה: ראה Lagoy et al.17 לקבלת מידע מפורט על השגת או ייצור תבניות האב וייצור, שימוש וניקוי של התקנים מיקרופלואידים. שלבים אלה מסוכמים להלן.

  1. השג או ייצר תבנית אב באמצעות קובץ התכנון המיקרופלואידי שסופק (albrechtlab.github.io/microfluidics)17. עבור בוגרים צעירים C. elegans, ודא כי גובה הערוץ הוא 55-70 מיקרומטר.
  2. ערבבו את בסיס PDMS וחומר הריפוי ביחס של 10:1 לפי משקל וערבבו היטב עם פיפטות העברה.
  3. מדגזים למשך 30-60 דקות במייבש ואקום עד שהבועות נעלמות.
  4. מניחים את תבנית האב לתוך צלחת פטרי גדולה (בקוטר 150 מ"מ), ויוצקים את PDMS degassed עד לעומק של 4-5 מ"מ (~ 100 גרם). בדוק והסר אבק או בועות עם פיפטה העברה.
  5. אופים בחום של 180 מעלות על מדף תנור ישר במשך 3 שעות עד לילה.
  6. לאחר שנרפא, השתמש באזמל כדי לחתוך את PDMS מהתבנית ובסכין גילוח ישר כדי להפריד בין המכשירים.
  7. נקבו חורי כניסה ויציאה באמצעות ניקוב עורי של 1 מ"מ, ונקו אותם עם dH 2 O,אתנול, ושוב עם dH2O. יבשו את המכשיר בזרם אוויר (ראו איור 2A).
  8. נקה את שני הצדדים של התקן PDMS עם סרט הדבקה, והסר אבק או לכלוך.
  9. הכינו את שקופיות הזכוכית להשלמת המכשיר המיקרופלואידי כמתואר17. קדח חורי כניסה במגלשה העליונה באמצעות ביט יהלום, והפוך את המגלשה התחתונה להידרופובית על-ידי חשיפה לאדי TFOCS או על-ידי יישום טיפול בזכוכית דוחה מים (איור 2B).
  10. הרכיבו את הכריך של מכשיר PDMS מזכוכית לתוך מהדק (איור 2C).

3. הכנת בעלי חיים

  1. להשיג או ליצור בעלי חיים עם אינדיקטורים סידן מקודדים גנטית לידי ביטוי נוירונים של עניין.
    הערה: לדוגמה, קו NZ1091 (kyIs587 [gpa-6p::GCaMP2.2b; unc-122p::d sRed]; kyIs5662 [odr-7p::Chrimson:SL2:mCherry; elt-2p::mCherry]) מבטא את GCaMP ואת ערוץ הקטיון הרגיש לאור אדום Chrimson בזוג נוירוני החישהAWA 6. שני הטרנסגנים משולבים בגנום לביטוי יציב בכל חיה.
  2. יום לפני הניסוי, הניחו לפחות 20 זחלי L4 שלב C. elegans בכל ניסוי על צלחת אגר בינונית לגידול נמטודות (NGM) שנזרעה עם מדשאה OP50 E. coli. כאשר נשמר ב 20 מעלות צלזיוס, זה יסנכרן את חיות הבר בשלב הבוגר הצעיר למחרת.
    הערה: עבור טרנסגנים של מערך, בחר בעלי חיים באמצעות סטריאוסקופ פלואורסצנטי כדי להבטיח ביטוי טרנסגנים בבעלי החיים שנבחרו.

4. הכנת הפתרון

  1. הכן מאגר בסיסי 1x S (100 mM NaCl ו- 0.05 M KPO4, pH 6.0) מתמיסת מלאי 10x.
  2. הכן חיץ טטרמיסול 1 mM על ידי דילול מלאי 1 M ב- 1x S Basal. השתמש בחיץ משותק זה כדי להכין את כל הגירויים. ניסוי משתמש בדרך כלל בכ-150 מ"ל.
  3. הוסף פלואורסצאין 0.1-1 מיקרוגרם/מ"ל למאגרי החיץ "בקרה" כדי להמחיש את הזרימה.
  4. יצירת פתרונות גירוי על ידי דילול סדרתי לריכוז הסופי הרצוי. לדוגמה, צור דילול של 10-7 של מושך דיאצטיל על ידי יצירת מלאי 10-3 תחילה.
    הערה: ניתן להוסיף כמות קטנה של פלואורסצאין (0.1-1 מיקרוגרם/מ"ל) לתמיסת הגירוי או החיץ כדי לאמת את תזמון הגירוי, אך הריכוז צריך להיות מינימלי כדי למנוע ממצאים בפלואורסצנטיות עצבית.

5. הכנת מכשיר מיקרופלואידי

הערה: ראה Reilly et al.9 לקבלת פרוטוקול וידאו המציג את ייצור המאגר, הגדרת המכשיר וטעינת בעלי החיים. ראה גם Lagoy et al.17 עבור פרוטוקול כתוב הכולל עצות מועילות רבות.

  1. הכינו שלושה מאגרים נוזליים או יותר. עבור כל אחד מהם, חברו מיכל מזרק של 30 מ"ל או 60 מ"ל, מזרק פריימינג של 3 מ"ל וגבעום מחט לשסתום Luer תלת-כיווני (איור 2D). חבר את המחט לצינורות מיקרובור המצוידים בצינור מתכת בקצהו. תייגו את המאגרים, הרכיבו אותם על מדף שמחובר למעמד טבעתי, ומלאו אותם בנוזלי החיץ או הגירוי המתאימים (איור 2E).
  2. Degas המכשיר microfluidic מורכב ב ואקום מייבש במשך ~ 1 שעות.
  3. ממלאים ומסירים את בועות האוויר מצינור המאגר באמצעות מזרק הפריימינג. מלא את צינורות הזרימה בחיץ.
  4. הסר את המכשיר המיקרופלואידי מהוואקום, הכנס במהירות את צינור היציאה והזריק את הנוזל דרך המכשיר עד שטיפה יוצאת מפתח אחד.
  5. בכניסה זו, השתמשו בחיבור "טיפה לטיפה"17 כדי להכניס את צינור הכניסה הנוזלי המתאים (איור 2F). ודא שיש טיפות נוזל הן על צינור הכניסה והן על חור היציאה של המכשיר כדי למנוע יצירת בועה.
  6. הזריקו עוד נוזל מהשקע, חברו את צינור הכניסה הבא וחזרו על הפעולה עד שכל הפתחים מתמלאים. הכנס פין חסימה מוצק בכל פתחי הכניסה שאינם בשימוש וביציאת טעינת התולעת.
  7. ליזום זרימה על ידי פתיחת שסתומי הכניסה והיציאה Luer. בדוק את המכשיר לאיתור נזילות בפתחים ובבסיס הזכוכית. בדוק את ההתקן לאיתור בועות בתעלות הזרימה או בפתחי הזרימה באמצעות תוכנת לכידת התמונות במיקרוסקופ במצב חי.
    הערה: אם קיימות בועות, המתן עד שהן ייספגו בחומר PDMS.

6. העמסת בעלי חיים

הערה: ראה Lagoy et al.17.

  1. העבירו חיות בוגרות צעירות לצלחת אגר NGM ללא זרעים באמצעות "פיק" עם חוט תיל.
  2. הציפו את הצלחת בכ-5 מ"ל של חיץ בסיסי 1x S כך שהחיות שוחות.
  3. משוך את התולעים לתוך מזרק העמסה (מזרק 1 מ"ל או 3 מ"ל עם צינורות מחוברים שמולאו מראש עם 1x S בזל).
    1. באמצעות סטריאוסקופ, הזיזו את קצה הצינור מתחת לפני השטח הנוזליים ביד אחת לכל חיה רצויה, ומשכו אותו לתוך הצינור באמצעות המזרק המוחזק ביד השנייה.
    2. למשוך את התולעים רק לתוך הצינור, לא לתוך המזרק.
      הערה: הצינור מכיל בדרך כלל רק כ-100 מיקרוליטר. ניתן לגרש את בעלי החיים לאזור מקומי ואז למשוך אותם שוב לתוך הצינור עם נפח קטן.
  4. סגור את קו השקע, הסר את פין טעינת התולעת וחבר את מזרק טעינת התולעת למכשיר באמצעות חיבור טיפה לשחרור.
  5. להזרים בעדינות את בעלי החיים לזירה, ליצור זרימת חיץ, ולאפשר עד 1 שעה עבור immobilization על ידי tetramisole.
    הערה: במהלך תקופת ההשתקה, יש לוודא שרק נוזל חיץ נכנס לזירה. ניתן לכבות את מאגרי התמריצים והבקרה במהלך תקופה זו, אך לפתוח אותם ולוודא את הזרימה הנכונה לפני הפעלת ניסויי הגירוי.

7. גירוי אוטומטי והקלטה עצבית

  1. צור קובץ טקסט להגדרת גירוי בשם "הגדרות רכישה מוגדרות על-ידי המשתמש.txt" עם עורך טקסט (לדוגמה, פנקס רשימות) המכיל את הגדרות הגירוי עבור רכישת התמונה האוטומטית (ראה דוגמאות באיור 3). ההגדרות מחולקות לשני חלקים:
    1. הגדרות רכישת מיקרוסקופ: הגדר את סוג הניסוי (גירוי יחיד או רב-תבנית), תזמון חשיפה ועירור, משך ומרווחי זמן של ניסוי ושמור ספרייה.
    2. הגדרות גירוי: הגדר את פרמטרי בקרת הגירוי. "פקודת גירוי" מציינת את הפעולות המתרחשות במסגרות וידאו מסוימות עם התחביר <קוד אותיות><מספר מסגרת>, כאשר קודי האותיות הם A = valve1, B = valve2, C = valve3, L = תאורת LED; בנוסף, אותיות רישיות = מופעלות ואותיות קטנות = כבוי. עוצמת ה- LED נקבעת עם קוד האות "i" וערך של 0 (כבוי) עד 255 (בהירות מרבית).
      הערה: ערך עוצמת LED מ- 0 עד 255 מגדיר את המתח האנלוגי של היציאה מ- 0 V ל- 5 V. לבקר הנוכחי המשמש כאן יש קנה מידה עוצמה ליניארי, ואחרים צריכים להיות מכוילים עם מד כוח אור.
      1. לניסוי של גירוי יחיד עם פקודת גירוי חוזרת אחת בלבד, השתמשו בתבנית שבאיור 3A.
      2. לניסוי Multi-Pattern עם פקודות גירוי מרובות, השתמשו בתבנית באיור 3B. כלול "רצף תבניות" של ספרות המייצג את סדר דפוסי הגירוי. לכל דוגמת מילוי, הזינו פקודת גירוי בשורה נפרדת.
        הערה: רצף פסאודו-אקראי או רצף m יכולים להיות שימושיים לחקר תלות בהיסטוריית גירויים.
  2. הפעל את תוכנת בקרת המיקרוסקופ. ודאו שכל פתחי הנוזלים פתוחים, שהזרימה היא הרצויה בתוך הזירה (ראו איור 2H), ותאי העצב המעניינים נמצאים בפוקוס בתוך החלון החי.
  3. סגור את החלון החי והפעל את הסקריפט "MultiPattern_RunScript.bsh" בתוך התוכנה.
    הערה: כדאי לבצע ניסוי ללא בעלי חיים כדי לוודא זרימה וגירוי תקינים. החלפת ריכוז פלואורסצאין שונה עבור כל נוזל גירוי יכולה לעזור לדמיין ולתעד דפוסי גירוי חדשים.
  4. לאחר הניסוי, לפרק את המכשיר microfluidic, ולשטוף את כל המשטחים, צינורות ומאגרים עם מים.
    הערה: ניתן לעשות שימוש חוזר בכל הרכיבים עשרות פעמים אם שומרים על ניקיון. ודא כי מאגרים, צינורות והתקנים מיקרופלואידים נשמרים רטובים או מיובשים לחלוטין בזרם אוויר כדי למנוע התגבשות מלח, אשר יכול לסתום וקשה להסירו. ניתן לשמור את המכשירים באתנול לעיקור אך יש לייבש אותם לחלוטין לפני שימוש חוזר (>1 שעות ב-65°C)17.

8. ניתוח נתונים באמצעות NeuroTracker

הערה: NeuroTracker 4,18,19 הוא תוסף תוכנה ImageJ/FIJI20 למעקב אחר עוצמת הפלואורסצנטיות של נוירונים ובעלי חיים מרובים, אפילו כשהם נעים במהלך ניסויים. תוסף זה שומר נתונים כקבצי טקסט עם המיקום של כל נוירון ועוצמת פלואורסצנטיות מתוקנת רקע (F). נתוני הפלואורסצנטיות מנורמלים לפלואורסצנטיות הבסיסית (F 0), לדוגמה, הממוצע של מספר שניות לפני הגירוי, כ- Δ F/F 0 = (F -F 0)/F 0, שניתן לממוצע בין אוכלוסיות.

  1. התקן סקריפטים של NeuroTracker לפי ההוראות (github.com/albrechtLab/Neurotracker).
  2. הפעל את NeuroTracker על ידי לחיצה על תוספים | מעקב | NeuroTracker.
  3. בחר בתיקייה המכילה את הסמל . קבצי וידאו TIF שיש לעקוב אחריהם ובחר את ההגדרות הרצויות.
    הערה: אם יש לעקוב רק אחר קבוצת משנה של קבצי הווידאו, בחר את הטווח המספרי של הקבצים שברצונך לנתח בשורת הפקודה. הגדרות המעקב המוגדרות כברירת מחדל מתאימות לבעלי חיים שאינם נעים ברזולוציה של 250 פיקסלים/מ"מ. התאם את הפרמטרים באופן יחסי לרזולוציות אחרות. עיין במדריך למשתמש19 לקבלת מידע נוסף על הגדרות.
  4. קבעו את סף העוצמה כך שתאי העצב יהיו גלויים לבחירה (איור 4).
  5. פתח את חלונות הבקרה בהירות/ניגודיות (שחור/ג) וסף באמצעות התמונה | התאם תפריט.
  6. בחלון B/C, התאימו את המחוונים מינימום ומקסימום עד שניתן יהיה להבחין בבירור בין תאי העצב (איור 4A).
  7. בחלון סף , סמן את רקע כהה ואל תאפס טווח.
  8. החלק את מחוון המסגרת כדי לצפות בתנועה ובשינויים בעוצמה של תא העצב, וציין בעלי חיים שאין לכלול במעקב, למשל עקב חפיפה עם בעלי חיים אחרים.
  9. זהה את תאי העצב למעקב.
  10. עבור כל חיה, התאם את רמת הסף כך שאזור הסף האדום מעל תא העצב ייראה בכל מסגרת לפני, במהלך ואחרי הגירוי.
  11. לחץ על תא העצב כדי לרשום את מיקומו ואת רמת הסף שלו.
  12. חזור על התאמת הסף והבחירה עבור כל חיה ותא עצב למעקב. ראו איור 4C לדוגמה טובה של רמת סף ואיור 4D,E עבור דוגמאות של סף יתר ומתחת לסף. נוירונים שנבחרו בעבר מסומנים על ידי קופסה קטנה.
  13. כאשר כל תאי העצב נבחרים, הקש על מקש הרווח כדי להתחיל במעקב.
    הערה: לקבלת דוגמאות נוספות של NeuroTracker, ראה הפניות קודמות 4,19.
  14. עקוב אחר תהליך המעקב אחר כל בעל חיים, ובצע את כל התיקונים הדרושים.
  15. אם NeuroTracker משתהה, הוא איבד את תא העצב. לחץ מחדש על תא העצב, והתאמת רמת הסף לפי הצורך.
  16. אם תיבת האינטגרציה קופצת לבעל חיים קרוב אחר או למבנה שאינו עצבי, הקש על מקש הרווח כדי להשהות, הזז את המחוון בחזרה למסגרת השגויה הראשונה ולחץ שוב על מיקום תא העצב הנכון.

9. חקר נתונים והדמיה

הערה: סקריפט הניתוח של MATLAB משמש לעיבוד נתונים ולתצוגה חזותית וליצירת מסמכי PDF מסכמים עבור כל ניתוח.

  1. הפעל את הקובץ "NeuroTrackerSummary_pdf.m" ב- MATLAB, ובחר את התיקיה המכילה את קבצי הטקסט של נתוני NeuroTracker.
  2. המתינו להפקת קובץ PDF מסכם, שיאפשר אימות של תהליך המעקב (איור 5). חיות מזוהות על-ידי מספר (איור 5A), וניתן לראות את התגובות העצביות מכל חיה וניסוי כדי להעריך את שונות האוכלוסייה (איור 5B).
  3. השתמשו בפונקציה "databrowse.m" כדי לחקור את הנתונים העצביים, לדוגמה, קיבוץ לפי מספר ניסוי (איור 5C), לפי מספר בעלי חיים (איור 5D), לפי תבנית גירוי או לפי קטגוריה אחרת.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מציגים מספר דוגמאות לדפוסי גירוי המעריכים תופעות עצביות שונות, כולל עיכוב זמני, הסתגלות ודיסאינהיביציה. עיכוב זמני הוא דיכוי רגעי של תגובה עצבית למצגת גירוי שנייה המתרחשת זמן קצר לאחר ההצגה הראשונית14. כדי לבחון את התופעה הזו, בניסוי של פולסים זוגיים, הוצגו שמונה תבניות המורכבות משני פולסי ריח של 1 שניות המופרדים במרווח שנע בין 0 שניות ל-20 שניות (איור 6B; ראו איור 3B לקובץ בקרת הגירוי המתאים). הזירה הוקמה עם נוזל גיר...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בפרוטוקול זה, אנו מתארים מערכת מיקרוסקופיה בגישה פתוחה להערכת תופעות פעילות עצבית באמצעות העברה מדויקת זמנית של דפוסי גירוי שונים. הפלטפורמה המיקרופלואידית מספקת גירויים חוזרים תוך שמירה על עשרות בעלי חיים בשדה הראייה של המיקרוסקופ. מעט חבילות תוכנה מסחריות למיקרוסקופיה מאפשרות תכנות קל של תבניות תזמון גירוי שונות, ואלה שכן דורשות לעתים קרובות הזנה ידנית של כל תבנית או פורמטים קנייניים של קבצים. לעומת זאת, ניסויים מוגדרים במערכת זו על ידי קבצי טקסט, אשר יכולים להיות שנוצרו על ידי מחשב והם קריאים על ידי תוכנת ניתוח. כאן, ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים לפוקס אייברי על בדיקת פרוטוקולים אלה וסקירת כתב היד ולאריק הול על הסיוע בתכנות. המימון לשיטות המוצגות כאן ניתן בחלקו על ידי הקרן הלאומית למדע 1724026 (D.R.A).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<זנים חזקים>חיידקים
E.  coli (OP50)Caenorhabditis Genetics Center (CGC)Cat# OP50
מודלים ניסיוניים: אורגניזמים/זנים
C.  elegans זנים המבטאים GCaMP (ואופציונלי, ארגמן) בנוירונים רצוייםCaenorhabditis Genetics Center (CGC) או מחברים מקבילים של עבודה שפורסמהNZ1091, לדוגמה
כימיקלים, טיפולים ו-Worm Preparation Supplies
2,3-ButanedioneSigma-AldrichCat# B85307diacetyl, דוגמה כימית גירוי
סידן כלורי, CaCl2Sigma-AldrichCat# C3881
פלואורסצאין, מלח נתרןSigma-AldrichCat# F6377
דוחה מיםמזכוכית Rain-XCat #800002250טיפול הידרופובי זכוכית (לשימוש חד פעמי)
מגנזיום כלוריד, MgCl2Sigma-AldrichCat# M2393
מדיום גידול נמטודות (NGM) אגרחתול ג'נסי#: 20-273NGM
צלחות פטרי (60  מ"מ)TritechCat #T3305
פולי (דימתיל סילוקסן) (PDMS): Sylgard 184Dow ChemicalCat# 1673921
אשלגן פוספט מונו-בסיסיSigma-AldrichCat# P5655
אשלגן פוספט דו-בסיסיSigma-AldrichCat# P8281
נתרן כלורי, NaClסיגמא-אולדריץ'Cat# S7653
(tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)trichlorosilane (TFOCS)GelestCAS# 78560-45-9טיפול הידרופובי זכוכית (עמיד)
<חזק>תוכנה ואלגוריתמים
Arduino IDEArduinohttps://www.arduino.cc/en/software
ImageJNIHhttps://imagej.nih.gov/ij/
MATLABMathWorkshttps://www.mathworks.com/products/matlab.html
מיקרו-מנהלמיקרו-מנהלhttps://micro-manager.org/
תוכנת בקרת מיקרוסקופAlbrecht Labhttps://github.com/albrechtLab/MicroscopeControl
Neurotracker תוכנת ניתוח נתוניםAlbrecht Labhttps://github.com/albrechtLab/Neurotracker
<חזק>מערכת מיקרוסקופ וגירוי אוטומטית
Axio Observer.A1 מיקרוסקופ הפוך שהוגדר עבור אפיפלואורסצנציה (קוביות מסנן GFP, 5 פעמים; אובייקטיבי או דומה)ZeissCat #491237-0012-000
Excelitas X-cite XYLIS תאורת LEDExcelitasCat #XYLIS
Orca Flash 4.0 מצלמת sCMOS דיגיטליתHamamatsuCat #C11440-22CU
Arduino nanoArduinoCat #A000005
שסתום בידוד דיאפרגמה מיניאטורי תלת כיווני (LQX12)ParkerCat #LQX12-3W24FF48-000שסתום 1: בקרה
דו-כיוונית סגורה רגילה (NC)שסתום צביטה Bio-Chem Valve IncCat #075P2-S432שסתום 2: שסתום צביטה תלת כיווני יציאה
NResearchCat #161P091שסתום 3: גירוי בחירה
LED ובקר גירוי אופטוגנטי (615 ננומטר)MightexCat #PLS-0625-030-S ו-#SLA-1200-2
ValveLink 8.2 בקר שסתומים דיגיטלי/ידניAutoMate ScientificCat #01-18
חוטים ומחבריםשוניםראה איור 2 של פרוטוקול Cell STARS (Lawler, 2021)
<חזק>הכנת מכשיר מיקרופלואידי
חותך סיבובי במהירות משתנה של Dremel 4000 DremelCat #F0134000ABהגדר מהירות ל-5k סל"ד לחיתוך זכוכית
Dremel מקדחה תחנת עבודה לכלי סיבוביDremelCat #220-01
מקדח יהלוםDremelCat #7134
שקופית זכוכית, 1  חתול VWR עבה מ"מ#75799-268
סופר זכוכית (סופר יהלומים)חתול טד פלה#54468
Luer 3-way stopcockCole-ParmerCat #EW-30600-07
Luer 23 G מחט קההVWRCat #89134-100
מכשיר מיקרופלואידי:מחבר או מפברק מקבצי CAD הקשורים למאמר זהN/A
מהדק מכשיר מיקרופלואידי:וורנר אינסטרומנטס (או חנות מכונות)צינורות מיקרופלואידיים P-2
, 0.02″ IDCole-ParmerCat #EW-06419-01
שפופרת 19 גרם, 0.5 ופריים;חתול צינור קטן בניו אינגלנד#NE-1027-12

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Akerboom, J., et al. Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics. Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, 2(2013).
  2. Badura, A., Sun, X. R., Giovannucci, A., Lynch, L. A., Wang, S. S. -H. Fast calcium sensor proteins for monitoring neural activity. Neurophotonics. 1, 025008(2014).
  3. Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
  4. Larsch, J., Ventimiglia, D., Bargmann, C. I., Albrecht, D. R. High-throughput imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (45), 4266-4273 (2013).
  5. Larsch, J., et al. A circuit for gradient climbing in C. elegans chemotaxis. Cell Reports. 12 (11), 1748-1760 (2015).
  6. Lagoy, R. C., Albrecht, D. R. Automated fluid delivery from multiwell plates to microfluidic devices for high-throughput experiments and microscopy. Scientific Reports. 8, 6217(2018).
  7. Schrödel, T., Prevedel, R., Aumayr, K., Zimmer, M., Vaziri, A. Brain-wide 3D imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans with sculpted light. Nature Methods. 10 (10), 1013-1020 (2013).
  8. Lawler, D. E., et al. Sleep analysis in adult C. elegans reveals state-dependent alteration of neural and behavioral responses. The Journal of Neuroscience. 41 (9), 1892-1907 (2021).
  9. Reilly, D. K., Lawler, D. E., Albrecht, D. R., Srinivasan, J. Using an adapted microfluidic olfactory chip for the imaging of neuronal activity in response to pheromones in male C. elegans head neurons. Journal of Visualized Experiments. (127), e56026(2017).
  10. Han, X., et al. A polymer index-matched to water enables diverse applications in fluorescence microscopy. Lab on a Chip. 21 (8), 1549-1562 (2021).
  11. Whitesides, G. M. The origins and the future of microfluidics. Nature. 442 (7101), 368-373 (2006).
  12. Albrecht, D. R., Bargmann, C. I. High-content behavioral analysis of Caenorhabditis elegans in precise spatiotemporal chemical environments. Nature Methods. 8 (7), 599-605 (2011).
  13. Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nature Methods. 4 (9), 727-731 (2007).
  14. Cohen, R. A. Temporal Inhibition. Encyclopedia of Clinical Neuropsychology. Kreutzer, J. S., DeLuca, J., Caplan, B. , Springer. New York, NY. 2480-2481 (2011).
  15. Lawler, D. E., Albrecht, D. R. Monitoring neural activity during sleep/wake events in adult C. elegans by automated sleep detection and stimulation. STAR Protocols. 3 (3), 101532(2022).
  16. Edelstein, A. D., et al. Advanced methods of microscope control using µManager software. Journal of Biological Methods. 1 (2), 10(2014).
  17. Lagoy, R. C., Larsen, E., Lawler, D., White, H., Albrecht, D. R. Microfluidic devices for behavioral analysis, microscopy, and neuronal imaging in Caenorhabditis elegans. Methods in Molecular Biology. 2468, 293-318 (2022).
  18. NeuroTracker. GitHub. , Available from: https://github.com/albrechtLab/Neurotracker (2022).
  19. NeuroTracker User Guide. GitHub. , Available from: https://github.com/albrechtLab/Neurotracker (2022).
  20. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  21. Galotto, G. Chitin triggers calcium-mediated immune response in the plant model Physcomitrella patens. Molecular Plant-Microbe Interactions. 33 (7), 911-920 (2020).
  22. Qian, X., Song, H., Ming, G. Brain organoids: Advances, applications and challenges. Development. 146 (8), 166074(2019).
  23. Ventimiglia, D., Bargmann, C. I. Diverse modes of synaptic signaling, regulation, and plasticity distinguish two classes of C. elegans glutamatergic neurons. eLife. 6, 31234(2017).
  24. Boulin, T. Reporter gene fusions. WormBook. , (2006).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Caenorhabditis elegansNeuroTracker

מאמרים קשורים