מאמר שיטה

כימות ואפיון גנום שלם של RNA SARS-CoV-2 בדגימות שפכים ואוויר

DOI:

10.3791/65053

⸱

30 ביוני 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Sustainable Processes, University of Valladolid, 2Department of Chemical Engineering and Environmental Technology, University of Valladolid, 3Department of Public Health Microbiology, National Laboratory of Health, Environment and Food, 4ICBAS - School of Medicine and Biomedical Sciences, Porto University, 5Epidemiology Research Unit (EPIUnit), Instituto de Saúde Pública da Universidade do Porto, 6Laboratório para a Investigação Integrativa e Translacional em Saúde Populacional (ITR)

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה נועד לכמת RNA של SARS-CoV-2 בדגימות שפכים ואוויר שישמשו למחקרים אפידמיולוגיים מבוססי שפכים ולהעריך את סיכון החשיפה ל- SARS-CoV-2 באירוסולים פנימיים וחיצוניים. פרוטוקול זה מתאר גם גישת ריצוף ארוך של אמפליקון פרוש עבור אפיון גנום שלם של SARS-CoV-2.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אפידמיולוגיה מבוססת שפכים התפתחה כמערכת מעקב מבטיחה ויעילה עבור SARS-CoV-2 ומחלות זיהומיות אחרות במדינות רבות. התהליך כולל בדרך כלל ריכוז שפכים, מיצוי חומצות גרעין, הגברה של מקטעים גנומיים נבחרים, ואיתור וכימות של המקטע הגנומי המוגבר. באופן דומה, ניתן למנף מתודולוגיה זו כדי לזהות ולכמת גורמים זיהומיים, כגון SARS-CoV-2, בדגימות אוויר. בתחילה, ההנחה הייתה ש- SARS-CoV-2 יתפשט בעיקר באמצעות מגע אישי קרוב עם טיפות שנוצרו על ידי אדם נגוע בזמן דיבור, התעטשות, שיעול, שירה או נשימה. עם זאת, מספר גדל והולך של מחקרים דיווחו על נוכחות של SARS-CoV-2 RNA באוויר של מתקני בריאות, ביסוס שידור מוטס כנתיב קיימא עבור הנגיף. מחקר זה מציג שילוב של פרוטוקולים מבוססים כדי להקל על זיהוי, כימות וריצוף סביבתי של וירוסים הן מדגימות שפכים והן מדגימות אוויר.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בדצמבר 2019 הופיעה מחלה חדשה בשם COVID-19, הנגרמת על ידי נגיף קורונה שלא היה ידוע קודם לכן, SARS-CoV-21. המגפה העולמית שנוצרה כתוצאה מכך הציבה אתגר משמעותי למעבדות קליניות ובריאות הציבור ברחבי העולם, שכן מספר רב של אנשים זקוקים לבדיקות כדי להעריך במדויק את העברת הנגיף ואת שכיחותו בקהילה. עם זאת, באזורים רבים, השגת רמת הבדיקה הנדרשת בזמן ובאופן מקיף מבחינה מרחבית אינה כדאית מבחינה כלכלית 2,3. מערכות המעקב הנוכחיות המבוססות על אבחון קליני פרטני מסתמכות במידה רבה על חומרת הסימפטומים ודיווח פרטני, כמו גם על המידה שבה תסמינים אלה חופפים למחלות קיימות המסתובבות באוכלוסייה 4,5,6,7,8,9,10. כתוצאה מכך, מספר גבוה של מקרים א-סימפטומטיים תורם להערכת חסר משמעותית של נטל התחלואה 7,11.

בשל אתגרים אלה, אפידמיולוגיה מבוססת שפכים (WBE) למעקב אחר COVID-19 הוצעה כאסטרטגיית מעקב משלימה. WBE תואר לראשונה בשנת 200112, ושימש בתחילה להתחקות אחר קוקאין וסמים לא חוקיים אחרים13. גישה זו נשענת על ההנחה שניתן לחשב את הריכוז ההתחלתי של כל חומר שהוא יציב בשפכים ומופרש על ידי בני אדם 8,12. WBE יושמה בהצלחה במדינות רבות כמערכת מעקב משלימה ויעילה עבור SARS-CoV-2 3,8,14,15,16. רוב השיטות לזיהוי וירוסים אנושיים בסביבות ימיות עוקבות אחר השלבים הבאים: ריכוז, מיצוי חומצות גרעין, הגברה של המקטע הגנומי (או המקטעים) שנבחרו, ואיתור/כימות של המקטע הגנומי המוגבר3.

סביבה חשובה נוספת לזיהוי וכימות של SARS-CoV-2 היא בדגימות אוויר. בתחילה, SARS-CoV-2 נחשב מועבר בעיקר באמצעות מגע אישי קרוב עם טיפות נשימה מאירוסולים שנוצרו על ידי אדם נגוע בזמן דיבור, התעטשות, שיעול, שירה או נשימה17. עם זאת, מספר מחקרים החלו לדווח על נוכחות של SARS-CoV-2 RNA באוויר, במיוחד במתקני בריאות ובחללים סגורים אחרים 18,19,20,21. ראיות לכדאיות SARS-CoV-2 בדגימות אוויר שנלקחו במקומות סגורים בבתי חולים ובחללים סגורים אחרים נמצאו כאשר ריכוז הנגיף היה גבוה מספיק22,23,2 4. מחקרים בחוץ בדרך כלל לא מצאו ראיות ל- SARS-CoV-2, למעט בחללים חיצוניים צפופים 21,25,26,27,28,29. נכון לעכשיו, שידור מוטס של SARS-CoV-2 הוכר כמצב שידור30,31. מחקר סקירה שנערך לאחרונה מראה את ההבדלים בין בחוץ, שבו הסיכונים להדבקה באוויר הם מינימליים מחוץ לאזורים צפופים, לבין בתוך הבית, שבו סיכונים גדולים יותר יכולים להיות נוכחים בסביבות מאווררות היטב שבהן מקורות חזקים (כלומר, מספר האנשים הנגועים) יכולים להיות נוכחים. מחקר סקירה מקיף שנערך לאחרונה הדגיש את ההבדלים המשמעותיים בין הסיכונים של שידור באוויר בסביבות חיצוניות לעומת פנימיות, במיוחד באזורים צפופים עם אוורור לקוי. המחקר מצביע על כך שהסיכון להדבקה באוויר הוא מינימלי בסביבות חיצוניות, שבהן יש נפח אוויר גדול יותר זמין לדילול ופיזור חלקיקי הנגיף32. לממצאים אלה יש השלכות חשובות על מדיניות בריאות הציבור והנחיות הקשורות ל-COVID-19. על ידי הכרה בהבדלים המשמעותיים בסיכוני ההעברה בין סביבות פנים וחוץ, קובעי המדיניות יכולים לפתח אסטרטגיות יעילות יותר כדי למתן את התפשטות הנגיף ולהגן על בריאות הציבור.

ישנן מגוון שיטות ופרוטוקולים לאיתור, כימות וריצוף של SARS-CoV-2 מדגימות סביבתיות שונות. מאמר שיטה זה נועד להציג שילוב של פרוטוקולים מבוססים המאפשרים למעבדות עם רמות קיבולת שונות לבצע גילוי סביבתי, כימות וריצוף של וירוסים מדגימות שפכים ואוויר.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל השיטות המתוארות כאן פורסמו במקומות אחרים ומכילות שינויים קטנים מהשיטות המקוריות.

1. איסוף שפכים ועיבוד מקדים של דגימות

הערה: בשל הריכוזים הנמוכים של RNA SARS-CoV-2 בדגימות סביבתיות, יישום שלב ריכוז הוא חיוני לגילוי מוצלח33,34,35. מתוארת כאן השיטה המדווחת הראשונה לאיתור SARS-CoV-2 בשפכים36.

  1. איסוף וריכוז דגימות שפכים
    1. יש לאסוף 1 ליטר של דגימת שפכים מרוכבים של 24 שעות. אחסן את הדגימה ב -4 ° C והמשך עם הפרוטוקול תוך 24 שעות.
    2. הומוגניזציה של הדגימה על ידי ניעור עדין של הבקבוק. לאסוף 70 מ"ל לתוך צינור צנטריפוגלי 100 מ"ל או לחלק את הדגימה לשני צינורות צנטריפוגליים של 50 מ"ל.
    3. ספייק 20 μL של mengovirus (3.2 x 10,3 עותקים / μL) עד 70 מ"ל של כל דגימה כבקרה פנימית של תהליך הריכוז. לחלופין, ספייק 10 μL של mengovirus (3.2 x 103 עותקים / μL) לתוך כל צינור צנטריפוגה 50 מ"ל.
    4. הומוגניזציה של הדגימה והצנטריפוגה ב 700 x גרם במשך 10 דקות כדי להסיר חלקיקים גדולים ואורגניזמים (גלולה).
    5. השתמש בסופרנאטנט המתקבל לריכוז עם התקני אולטרה-סינון צנטריפוגליים עם חיתוך של 10 KDa על ידי צנטריפוגה ב 4,000 x גרם למשך 40 דקות ב -4 ° C. הצה את התרכיז על ידי צנטריפוגה ב 700 x גרם במשך 40 דקות והיפוך המיקום של מכשיר ultrafiltration.
    6. מדוד את נפח התרכיז המתקבל. הנפח ישתנה בהתאם לכמות המוצקים בדגימה שסותמים את המסננים הצנטריפוגליים. במחקר זה, נפחי התרכיז שהתקבלו היו בין 200-1,200 μL.
    7. השתמש בתרכיז המתקבל למיצוי RNA באמצעות ערכה מסחרית או בשיטה פנימית. עבור הדגימות ששימשו במחקר זה, ערכה מסחרית ספציפית למיצוי RNA נגיפי עם נפח elution של 50 μL משמש.
    8. למדוד את ריכוז הרנ"א המופק באמצעות ערכת כימות RNA פלואורומטרית. מחלקים את הרנ"א המופק לאליציטוטים ומקפיאים ב -80 מעלות צלזיוס עד לניתוח נוסף.
      הערה: עבור כל הליך בידוד RNA שנקבע, יש לכלול בקרה שלילית של בידוד (NCI), המכילה רק מאגרים כדי לזהות זיהום אפשרי במהלך החילוץ.
  2. איסוף דגימות אוויר באמצעות דוגם אוויר קומפקטי של קוריוליס
    1. בחר אסטרטגיית דגימה בהתאם למטרת המחקר על ידי הגדרת תדירות הדגימה ומיקומי הדגימה.
    2. הגדר את קצב הזרימה על דוגם האוויר (כאן, 50 ליטר לדקה למשך 30 דקות). שימו לב שקצב זרימה של יותר מ-200 ליטר/דקה עלול לפגוע ב-RNA נגיפי, ולכן מומלץ להשתמש בקצב זרימה נמוך מ-200 ליטר/דקה.
    3. מניחים קונוס סטרילי בדוגם האוויר לפני תחילת האיסוף על ידי פעימת הזינוק. לאחר סיום הדגימה, הוסף 5-15 מ"ל של מלח סטרילי חוצץ פוספט (PBS) לתוך החרוט. מערבלים בעדינות או מנערים את הדגימה ביד במשך 15 שניות. אחסן את הדגימות עד 24 שעות ב- 4 ° C או ב -80 ° C בצינורות קריו.
    4. ניתן לבצע שלב ריכוז אופציונלי. נקו וטהרו את המדוכים לאחר כל ניסוי באמצעות אקונומיקה.
    5. חלצו RNA באמצעות ערכה מסחרית או בשיטה פנימית. עבור הדגימות במחקר זה, ערכה מסחרית ספציפית עבור מיצוי RNA נגיפי עם נפח elution של 50 μL משמש.
    6. למדוד את ריכוז הרנ"א המופק באמצעות ערכת כימות RNA פלואורומטרית. מחלקים את הרנ"א המופק לאליציטוטים ומקפיאים ב -80 מעלות צלזיוס עד לניתוח נוסף.
      הערה: עבור כל הליך בידוד RNA שנקבע, יש לכלול בקרה שלילית של בידוד (NCI), המכילה רק מאגרים כדי לזהות זיהום אפשרי במהלך החילוץ.

2. כימות RNA של SARS-CoV-2 על ידי תגובת שרשרת פולימראז כמותית בזמן אמת (RT-qPCR)

הערה: הפרוטוקול להלן הוא בהתאם ללוח האבחון RT-PCR37 של CDC 2019-Novel Coronavirus (2019-nCoV). חלקו את תערובת הפריימר/בדיקה למספר אליציטוטים כדי למנוע מחזורי הקפאה והפשרה.

  1. הכינו את תערובת המאסטר של התגובה לכל מטרה (מנגו-וירוס; SARS-CoV-2 [גנים N1 ו-N2]) כמו בטבלה 1, במכסה מנוע נקי בחדר ההתקנה של מגיבים. מערבבים את תערובת הפריימרים/בדיקה ואת האנזים על ידי היפוך חמש פעמים. לחלופין, מערבולת פולס קלה את תערובת הפריימרים/בדיקה והאנזים חמש פעמים.
    הערה: יש לשמור על קור של כל הריאגנטים במהלך ההכנה והשימוש. על מנת למזער את מחזורי ההקפאה-הפשרה, מומלץ מאוד להקפיא באליציטוטים.
  2. סובבו כלפי מטה (1,000 x גרם במשך 15-30 שניות) את הצינורות כדי לאסוף את התוכן בתחתית והניחו את הצינורות במדף קר או על קרח.
  3. סמן צינורות מיקרוצנטריפוגות בנפח 1.5 מ"ל עבור כל מטרה. הוסף לכל צינור מיקרוצנטריפוגה את הכמות של כל מגיב הדרוש (נפח לתגובה כפול מספר התגובות, כולל הבקרות הדרושות). מערבבים על ידי פיפטינג למעלה ולמטה וצנטריפוגה במשך 5 שניות כדי לאסוף את התכולה בתחתית.
  4. שמור את צינורות הצנטריפוגות במדף קר ושחרר 15 μL לתוך צינורות PCR רצועה או צלחת 96 באר במדף קירור. מכסים את הצלחת ומעבירים אותה לאזור הטיפול בחומצות גרעין (שומרים אותה במדף קירור).
  5. מפשירים אליקוט של RNA מופק ומערבלים בעדינות במשך 5 שניות. פיפטה 5 μL של RNA (בנוסף ל-5 μL של בקרה שאינה תבנית [NTC], בקרה שלילית של בידוד [NCI], ובקרה חיובית [PC]) לכל באר תגובה או צינור המכיל את תערובת המאסטר שהוכנה קודם לכן. החליפו כפפות לעתים קרובות לפי הצורך כדי למנוע זיהום צולב.
  6. מכסים את כל לוחית התגובה או הצינורות ומערבלים בעדינות. צנטריפוגה (1,000 x גרם עבור 15-30 שניות) הצלחת או צינורות PCR.
  7. הפעל את 25 μL RT-qPCR עם תנאי המחזור הבאים: שעתוק לאחור ב 45 ° C למשך 10 דקות; הפעלת פולימראז ב 95 ° C במשך 10 דקות; 45 מחזורים של דנטורציה ב 95 °C (75 °F) במשך 15 שניות; וחישול/הרחבה ב-60°C למשך 45 שניות.
  8. חישוב יעילות ההתאוששות של בקרות מנגווירוס כפי שדווח על ידי Conte et al.38:
    figure-protocol-1 × 100

3. ריצוף וריאנטים בשפכים וניתוח נתונים

הערה: הפרוטוקול המתואר הוא פרוטוקול שונה שנוצר על-ידי Quick et al.39,40. הוא משתמש בשני סטים של פריימרים להגברת הגנום של SARS-CoV-2 על ידי מתודולוגיית ריצוף PCR - פריימרים ARTIC ופריימרים של VarSkip. שילוב של פריימרים משמש כדי להבטיח את כיסוי הגנום הטוב ביותר ולמזער את האפשרות של מוטציות חדשות הגורמות לפריימרים מסוג אחד להיכשל. באופן כללי, הפרוטוקול מחולק לשלושה חלקים: תמלול הפוך (RT) ויצירת אמפליקון, הכנת ספריית ריצוף, ורצף וניתוח נתונים.

  1. שעתוק לאחור ויצירת אמפליקון
    1. ודא שלדגימות הקלט יש ערך סף מחזור qPCR ידוע (Ct) כדי לדלל אותן כראוי במים בדרגת PCR. ערך Ct מתקבל במהלך הכימות עם qPCR. הדילולים הם כדלקמן: אם ערך Ct הוא 12-15, לדלל את הדגימות 1:100; אם ערך ה- Ct הוא 15-18, דלל את הדגימות 1:10; אם ערך Ct הוא 18-35, אין לדלל את הדגימה. לדגימות מעל ערך Ct של 35 יש סיכוי גבוה לא לעבוד.
    2. בצלחת PCR, פיפטה 16 μL של כל דגימה למיקומה על הצלחת. הוסף 4 μL של תערובת מופת של שעתוק לאחור (RT) (5x). כסו את הצלחת והתחילו את תגובת ה-PCR בתנאים הבאים: 25°C למשך 2 דקות, 55°C למשך 20 דקות ו-95°C למשך דקה אחת.
    3. הכינו דילול של 10 מיקרומטר מכל ערכת פריימר (בריכה ארקטית A ובריכה B, ובריכה A ובריכה B של VarSkip ). הכינו את המאסטרמיקס לכל ערכת פריימרים (ערכת ARTIC A ו-B, וערכת VarSkip A ו-B) כמו בטבלה 2. ארבעה תערובות מופת ינבעו מכך.
    4. על צלחת PCR חדשה, פיפטה 20 μL של mastermix לכל באר המתאימה. הוסף 5 μL של דגימת RT לכל תערובת.
      הערה: לכל דגימה יהיו ארבע תערובות תגובה - מאגר ARTIC A ו-B, ומאגר VarSkip A ו-B.
    5. לכסות את הצלחת ולהתחיל את תגובת PCR כדלקמן: הפעלת פולימראז ב 98 ° C במשך 30 שניות; 35 מחזורים של דנטורציה ב 98 °C (75 °F) במשך 15 שניות; וחישול/הארכה ב-65°C למשך 4 דקות. סובבו כלפי מטה (1,000 x גרם במשך 15-30 שניות) את הצלחת. שלב את בריכות התגובה הארקטית ושלב בנפרד את בריכות התגובה של VarSkip. לכל דגימה יהיו שתי תגובות אמפליקון של 50 μL.
    6. הוסף 50 μL של מגיב מבוסס חרוזים לטיהור PCR לכל באר ומערבבים היטב על ידי pipetting. יש לדגור בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות.
      הערה: לפני כל שימוש, ערבבו במרץ את מגיב טיהור ה-PCR כדי להשעות מחדש את החרוזים.
    7. מניחים את הצלחת על מעמד הפרדה מגנטי ומחכים שהחרוזים יוצרים גלולה והנוזל יתנקה (~ 5 דקות). פיפטה ולהשליך את הסופרנטנט. שמור את לוחית ה-PCR על המעמד המגנטי.
    8. שמירה על לוחית ה-PCR על המעמד המגנטי, יש להוסיף 200 μL של 80% אתנול לכל דגימה מבלי לגעת בגלולת החרוז. מוציאים את האתנול.
    9. חזור על השלב הקודם. השאירו את הצלחת על המעמד המגנטי חשופה למשך 30 שניות כדי לאפשר לאתנול להתאדות.
    10. הסר את הצלחת מהמעמד המגנטי והוסף 15 μL של מים ברמת PCR לכל דגימה. להשהות את הגלולה על ידי pipetting. יש לדגור בטמפרטורת החדר למשך 2 דקות.
    11. הניחו את הצלחת בחזרה על המעמד המגנטי והניחו לחרוזים לגלול (2 דקות). בזהירות פיפטה 15 μL של supernatant מכל דגימה לצלחת PCR חדשה.
    12. למדוד את הריכוז של כל דגימה עם ערכת כימות RNA פלואורומטרי . קח בערך 50 ng של כל דגימה ב 12.5 μL לשלב הבא. במידת הצורך, יש לדלל את הדגימה במים בדרגת PCR.
  2. הכנת הספרייה
    1. הוסף 1.75 μL של מאגר תגובה מערכת הכנת ספריית ה- DNA של Illumina ו- 0.75 μL של תערובת אנזימים לכל דגימה. מכסים את הצלחת, מערבלים לזמן קצר ומסתובבים כלפי מטה (1,000 x גרם למשך 15-30 שניות). יש לדגור בטמפרטורה של 21°C למשך 5 דקות ובטמפרטורה של 65°C למשך 5 דקות.
    2. בצלחת חדשה, פיפטה 3 μL של מים בדרגת PCR עבור כל דגימה לצלחת PCR חדשה. הוסף 0.75 μL של הדגימות המוכנות, 1.25 μL של ברקודים להכנת הספרייה ריצוף, ו 5 μL של T4 DNA ligase mastermix. מערבבים היטב על ידי פיפט, מסתובבים לזמן קצר (1,000 x גרם במשך 15-30 שניות) בצנטריפוגה ודגרים ב 21 ° C במשך 20 דקות וב 65 ° C במשך 10 דקות.
      הערה: אם אתה משתמש בפחות מ- 25 דגימות, הכפל את כל אמצעי האחסון בשלב זה.
    3. אסוף את כל הדגימות יחד על ידי הוספת 10 μL מכל דגימה לאותה צינור בעל קשירה נמוכה. קח 480 μL לשלב הבא.
    4. הוסף 192 μL של מגיב מבוסס חרוזים לטיהור PCR לבריכה וערבב היטב על ידי pipetting. יש לדגור בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.
    5. הניחו את הצינור על מעמד מגנטי והמתינו עד שהסופרנאטנט יתנקה וייווצר כדור חרוז. הסר את supernatant. הסר את הצינור מהמעמד המגנטי.
    6. מוסיפים 700 μL של חיץ השבר הקצר (SFB) ומערבבים על ידי פיפט. הניחו בחזרה על המעמד המגנטי והמתינו עד שהגלולה תיווצר והנוזל יתנקה (~5 דקות). פיפטה מוציאה את הסופרנאטנט ומשליכה אותו.
    7. חזור על השלב הקודם. השאירו את הצינור על המעמד המגנטי. מוסיפים 100 μL של 80% אתנול מבלי לגעת בחרוז. פיפטה החוצה אתנול ולאפשר את החרוז להתייבש במשך 30 שניות.
      הערה: אין לאפשר לחרוז להתייבש יתר על המידה.
    8. הסר את הצינור מהמעמד המגנטי והוסף 35 μL מים בדרגת PCR. מערבבים על ידי פיפטינג ודגרים בטמפרטורת החדר במשך 2 דקות. הניחו את הצינור על המעמד המגנטי ואפשרו לחרוז להתנקות ולנוזל להתנקות. פיפטה 35 μL של supernatant לצינור חדש.
    9. למדוד את ריכוז הרנ"א של הספרייה המאוגמת. פיפטה: הנפח הדרוש כדי להגיע לכמות של 30-50 ננוגרם של RNA ולמלא אותו במים בדרגת PCR כדי להגיע לנפח סופי של 30 מיקרוליטר.
    10. הכן את תערובת תגובת הקשירה של המתאם: 30 μL של הספרייה המאוגמת, 5 μL של Adapter Mix II, 10 μL של מאגר תגובת הקשירה (5x) ו- 5 μL של T4 DNA ligase. מערבבים על ידי פיפטינג ו spin-down (1,000 x גרם במשך 15-30 שניות). יש לדגור בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.
    11. הוסף 20 μL של מגיב מבוסס חרוזים לטיהור PCR וערבב על ידי pipetting. יש לדגור במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
    12. מניחים את הצינור על המעמד המגנטי ומחכים שגלולת החרוז תיווצר והסופרנאטנט יהפוך לחסר צבע. בזהירות פיפטה החוצה ולהשליך את supernatant.
    13. הסר מהמעמד המגנטי והוסף 125 μL של SFB. מערבבים על ידי פיפטינג ומניחים בחזרה על המעמד המגנטי כדי להפריד את החרוזים. כאשר הנוזל צלול, פיפטה ולהשליך את supernatant.
    14. חזור על השלב הקודם. השאירו את הצינור פתוח על המעמד המגנטי למשך 30 שניות כדי שחלק משאריות הנוזל יתאדו.
    15. הסר את הצינור מהמעמד המגנטי והוסף 15 μL של חיץ האלוציה. מערבבים היטב על ידי פיפטינג וסיבוב קצר (1,000 x גרם במשך 15-30 שניות). יש לדגור בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות. מניחים על המעמד המגנטי למשך 2 דקות.
    16. פיפטה 15 μL של supernatant לתוך צינור חדש קישור נמוך. זוהי הספרייה הסופית. מדוד את הריכוז באמצעות ערכת כימות DNA פלואורומטרית.
      הערה: בשלב הבא, יש צורך ב-12 μL. אם הריכוז גבוה מאוד ויש צורך בפחות מ -12 מיקרוליטר של הספרייה, מלא עד 12 μL עם מגיב חיץ אלוציה.
  3. טעינה ורצף של תאי זרימה
    1. הכנס את תא הזרימה (R9.4.1) למכשיר ריצוף הדנ"א והרנ"א בזמן אמת.
    2. הכינו את תערובת הפריימינג על ידי הוספת 30 μL של מגיב קשירה סומק (FLT) לשפופרת של מגיב חיץ סומק (FB). מערבולת לערבב ולסובב למטה (1,000 x גרם עבור 15-30 שניות).
    3. פתח את מכסה יציאת הפריימינג. בעזרת פיפטה של 1,000 μL, הגדר ל- 200 μL והכנס את הקצה ליציאת הפריימינג. סובב את גלגל הגדרת עוצמת הקול והגבר את עוצמת הקול עד שיראה את הנוזל שבקצה. מחק את הקצה.
      הערה: סובב את הגלגל רק עד שנראה כמה μL של נוזל בקצה. משיכת כמויות גדולות יותר עלולה לפגוע בתא הזרימה.
    4. הוסיפו באיטיות 800 μL של תערובת הפריימינג ליציאת הפריימינג, תוך הקפדה לא להכניס בועות. המתן 5 דקות.
    5. בינתיים, הכינו את הספריות לטעינה. ערבבו 37.5 μL של מאגר הרצף, 25.5 μL של מאגר הטעינה ו-12 μL של הספרייה.
      הערה: יש לערבב את מאגר ההעמסה לפני הפיפט. החרוזים בריאגנט זה מתיישבים מהר מאוד.
    6. פתח את מכסה היציאה. פיפטה 200 μL של תערובת priming לתוך יציאת priming.
      הערה: בעת כניסה ליציאת הפרימינג כאשר יציאת הכיסוי פתוחה, ניתן להבחין בנפילות קטנות המגיעות מפתח הדגימה. פיפטה איטית מספיק כדי שיציאת הדגימה תוכל למשוך את הטיפות פנימה מבלי להישפך.
    7. לפני טעינת הספרייה המוכנה, מערבבים היטב על ידי pipetting. באמצעות פיפטה של 100 μL המוגדרת ל 75 μL, קח את הספרייה ואת פיפטה טיפה אחר טיפה לתוך יציאת הדגימה. אין לגעת ביציאה ולהמתין עד שכל טיפה תיספג ביציאה לפני טעינת הטיפה הבאה כדי למנוע הצפה של הנוזל.
    8. סגור את יציאת הכיסוי ואת יציאת הפריימינג. פתח את התוכנה והתחל את ניסוי הרצף. בחר basecalling On. עבור ספרייה עם 96 דגימות מרובות, 10-12 שעות של רצף מספיקות בדרך כלל כדי להפיק מספיק נתונים.
      הערה: באמצעות התוכנה, ניתן להכניס את הגיליון לדוגמה בפורמט .csv. הגיליון לדוגמה דורש את הנתונים הבאים: flow_cell_id, position_id, sample_id, experiment_id, flow_cell_product_code וערכה. יש צורך במזהה תא הזרימה (המופיע בצד תא הזרימה) יחד עם הערכה שבה נעשה שימוש. עבור הפרוטוקול המוצע, יש לבחור את ערכת LSK109.
  4. ניתוח נתוני רצף
    1. הכנס את קריאות fastq דחוסות לזרימת העבודה wf-artic41. הפעל את זרימת העבודה בנפרד עם שתי סכימות פריימר שונות (ARTIC/V4.1 ו- NEB-VarSkip/v1a). שתיים". הקבצים primertrimmed.rg.sorted.bam" נוצרים עבור כל דגימה.
    2. מזג את קבצי ה- BAM לקובץ יחיד עם הפקודה "samtools merge"42. הכנס את קובץ ה- BAM הממוזג לכלי Freyja, והשאיר הגדרות ברירת מחדל, כדי לשחזר שפע שושלת יחסי43.
    3. כדי ליצור קובץ FSTA, הכנס את קובץ ה- BAM הממוזג לכלים "samtools mpileup" ו- "ivar" עם הגדרות ברירת מחדל44,45. עבור קריאה למוטציות, טען את קובץ FASTA בכלי Nextclade46,47.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

התוצאות המסוכמות בטבלה 3 מציגות דוגמאות לזיהוי וכימות של RNA SARS-CoV-2 בדגימות שפכים ואוויר בשיטה המתוארת במאמר זה. דגימות שפכים נאספו ממתקני טיהור שפכים בספרד ובסלובניה ונחשבו חיוביות אם ה-Ct היה פחות מ-40 לפחות בשניים מתוך שלושת ההעתקים, כאשר הכימות נחשב תקף אם ל-Ct הייתה שונות של פחות מ-5%. בספרד ובפורטוגל נאספו דגימות אוויר פנימיות וחיצוניות, והוחלו אותם כללים. נעשה שימוש בכפילויות עבור דגימות האוויר, ולא בטריפליקטים כמו בדגימות השפכים, שכן מטרת המחקר הייתה לאתר RNA של SARS-CoV-2 ולא לכמת אותו. יתר ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

זיהוי וכימות מיקרוביאליים ונגיפיים באמצעות שיטות (RT-)qPCR זכו להסכמה נרחבת בשל רגישותם יוצאת הדופן. עם זאת, טכניקות אלה עומדות בפני אתגרים רבים בעת ניתוח דגימות סביבתיות. דגימות שפכים מכילות שפע של חומרים מעכבים שיכולים להטות את המדידות ולייצר תוצאות מטעות. כדי להתמודד עם מגבלות אלה ולשפר את הדיוק, נהגה, תוכנן ויושם פרוטוקול מורכב. פרוטוקול זה נתפר על ידי שילוב פרוטוקולים מהספרות המדעית וכדי לתת מענה ספציפי למגבלות הטמונות בשיטות qPCR על ידי שילוב סדרה של בקרות מחמירות בכל שלב של התהליך. על ידי שילוב אמצעי בקרת איכות קפ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין אינטרסים כלכליים מתחרים או ניגודי אינטרסים אחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו בוצעה בתמיכה כספית מהממשלה האזורית של Castilla y Leon ותוכנית FEDER (פרויקטים CLU 2017-09, UIC315 ו- VA266P20).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מתאם + A25 + A2: D19 + A2: D20 + A2 + A2: D19אוקספורד ננופורEXP-AMII001רצף
AllPrep PowerViral ערכת DNA / RNA ערכתמיצוי RNAQiagen28000-50
AMPure XPBeckman CoulterA63880טיהור PCR, ניקוי NGS, ניקוי PCR
ARTIC SARS-CoV-2 Amplicon PanelIDT10011442SARS-CoV-2 הגברת גנום SARS-CoV-2
Blunt/TA Ligase Master MixNEBM0367Sהכנת ספרייה
CENTRICON PLUS­ 70 10KDA.פישר סיינטיפיק10296062מסנני ריכוז
קוריוליס קומפקטי דוגם אווירברטין טכנולוגיות083-DU001דוגם אוויר
דוראן  בקבוקי מעבדהMerckZ305200-10EAבקבוקי דגימה
תא זרימה (R9.4.1)אוקספורד ננופורFLO-MIN106Dריצוף
חומרים מתכלים לברוטוריים כלליים (צינורות, צלחות qPCR וכו')
ערכת ריצוף קשירהאוקספורד ננופורSQK-LSK109ריצוף
LunaScript  ערכת RT SuperMixNEBE3010  סינתזת cDNA
ערכת בקרת מיצוי מנגו-וירוסBiomé rieuxKMGבקרת ריכוז
Nalgene כללי אחסון לטווח ארוך צינורות קריוגנייםThermofisher5011-0012אחסון לדוגמא
הרחבת ברקוד מקורי 1-12 (ללא PCRאוקספורד NanoporeEXP-NBD104ברקוד
NEBNext Ultra II סוף תיקון/dA-Tailing מודולNEBE7595תיקון DNA
NEBNext VarSkip קצר SARS-CoV-2 תערובות פריימרNEBE7658SARS-CoV-2 הגברת גנום
NEBNext  מאגר תגובת קשירה מהירהNEBB6058Sרצף 
מי מלח חוצץ פוספטMerckP4474מאגר איסוף
מי מלח חוצץ פוספט (PBS, 1X),ThermofisherJ61196 מסונן סטרילי. APסילוק דגימות אוויר
Q5  התחלה חמה נאמנות גבוהה 2X מאסטר מיקסNEBM0494Sהתחלה חמה DNA פולימראז
Qubit RNA HS ערכת בדיקהThermofisherQ32852כימות RNA
SARS-CoV-2 RUO qPCR פריימר & ערכת בדיקהIDT10006713תערובת פריימר-בדיקה ובקרה חיובית qPCR
TaqPath 1-Step RT-qPCR Master MixThermofisherA15299RT-qPCR
ערכת

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Naming the Coronavirus Disease (COVID-19) and the Virus that Causes it. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/emergencies/diseases/novel-coronavirus-2019/technical-guidance/naming-the-coronavirus-disease-(cover-2019)-and-the-virus-that-causes-it (2020).
  2. Lab Workplace Safety. Centers for Disease Control and Prevention. , Available from: https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/lab/lab-safety-practices.html (2020).
  3. Gonçalves, J., et al. Centralized and decentralized wastewater-based epidemiology to infer COVID-19 transmission - A brief review. One Health. 15, 100405(2022).
  4. Dawood, F. S., et al. Estimated global mortality associated with the first 12 months of 2009 pandemic influenza A H1N1 virus circulation: a modelling study. The Lancet Infectious Diseases. 12 (9), 687-695 (2012).
  5. Gonçalves, J., Koritnik, T., Paragi, M. Assessment of weather and atmospheric pollution as a co-factor in the spread of SARS-CoV-2. Acta Bio-Medica: Atenei Parmensis. 92 (3), e2021094(2021).
  6. Gonçalves, J., et al. Detection of SARS-CoV-2 RNA in hospital wastewater from a low COVID-19 disease prevalence area. The Science of The Total Environment. 755, 143226(2021).
  7. Mizumoto, K., Kagaya, K., Zarebski, A., Chowell, G. Estimating the asymptomatic proportion of coronavirus disease 2019 (COVID-19) cases on board the Diamond Princess cruise ship, Yokohama, Japan, 2020. Eurosurveillance. 25 (10), 2000180(2020).
  8. Polo, D., et al. Making waves: Wastewater-based epidemiology for COVID-19 - approaches and challenges for surveillance and prediction. Water Research. 186, 116404(2020).
  9. Shmueli, G., Burkom, H. Statistical challenges facing early outbreak detection in biosurveillance. Technometrics. 52 (1), 39-51 (2010).
  10. Simonsen, L., et al. Global mortality estimates for the 2009 influenza pandemic from the GLaMOR project: A modeling study. PLoS Medicine. 10 (11), e1001558(2013).
  11. Oran, D. P., Topol, E. J. Prevalence of asymptomatic SARS-CoV-2 infection: a narrative reivew. Annals of Internal Medicine. 173, 362-367 (2020).
  12. Daughton, C., Jones-Lepp, T. Pharmaceuticals and Personal Care Products in the Environment: Scientific and Regulatory Issues. ACS Symposium Series. , American Chemical Society. Washington, DC. (2001).
  13. Zuccato, E., et al. Cocaine in surface waters: a new evidence-based tool to monitor community drug abuse. Environmental Health. 4, 14(2005).
  14. Aguiar-Oliveira, M. deL., et al. Wastewater-based epidemiology (WBE) and viral detection in polluted surface water: A valuable tool for COVID-19 surveillance-a brief review. International Journal of Environmental Research and Public Health. 17, 9251(2020).
  15. García-Encina, P. A. Wastewater-based epidemiology (WBE). Water and Environment Journal. 35 (4), 1162-1163 (2021).
  16. Mao, K., Zhang, H., Pan, Y., Yang, Z. Biosensors for wastewater-based epidemiology for monitoring public health. Water Research. 191, 116787(2021).
  17. Shereen, M. A., Khan, S., Kazmi, A., Bashir, N., Siddique, R. COVID-19 infection: Origin, transmission, and characteristics of human coronaviruses. Journal of Advanced Research. 24, 91-98 (2020).
  18. Chia, P. Y., et al. Detection of air and surface contamination by SARS-CoV-2 in hospital rooms of infected patients. Nature Communications. 11 (1), 2800(2020).
  19. Lei, H., et al. SARS-CoV-2 environmental contamination associated with persistently infected COVID-19 patients. Influenza and Other Respiratory Viruses. 14 (6), 688-699 (2020).
  20. Razzini, K., et al. SARS-CoV-2 RNA detection in the air and on surfaces in the COVID-19 ward of a hospital in Milan, Italy. The Science of The Total Environment. 742, 140540(2020).
  21. da Silva, P. G., Gonçalves, J., Nascimento, M. S. J., Sousa, S. I. V., Mesquita, J. R. Detection of SARS-CoV-2 in the indoor and outdoor areas of urban public transport systems of three major cities of Portugal in 2021. International Journal of Environmental Research and Public Health. 19 (10), 5955(2022).
  22. Barbieri, P., et al. Molecular detection of SARS-CoV-2 from indoor air samples in environmental monitoring needs adequate temporal coverage and infectivity assessment. Environmental Research. 198, 111200(2021).
  23. Lednicky, J., et al. Earliest detection to date of SARS-CoV-2 in Florida: Identification together with influenza virus on the main entry door of a university building, February 2020. PLoS One. 16 (1), 0245352(2021).
  24. Santarpia, J. L., et al. Aerosol and surface contamination of SARS-CoV-2 observed in quarantine and isolation care. Scientific Reports. 10 (1), 12732(2020).
  25. Chirizzi, D., et al. SARS-CoV-2 concentrations and virus-laden aerosol size distributions in outdoor air in north and south of Italy. Environment International. 146, 106255(2021).
  26. Hadei, M., et al. Presence of SARS-CoV-2 in the air of public places and transportation. Atmospheric Pollution Research. 12 (3), 302-306 (2021).
  27. Moreno, T., et al. Tracing surface and airborne SARS-CoV-2 RNA inside public buses and subway trains. Environment International. 147, 106326(2021).
  28. Mouchtouri, V. A., et al. Environmental contamination of SARS-CoV-2 on surfaces, air-conditioner and ventilation systems. International Journal of Hygiene and Environmental Health. 230, 113599(2020).
  29. Setti, L., et al. Airborne transmission route of COVID-19: why 2 meters/6 feet of inter-personal distance could not be enough. International Journal of Environmental Research and Public Health. 17, 2932(2020).
  30. SARS-CoV-2 Transmission. Centers for Disease Control and Prevention (CDC). , Available from: https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/science/science-briefs/sars-cov-2-transmission.html (2021).
  31. Coronavirus Disease (COVID-19): How is it Transmitted. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/news-room/q-a-detail/coronavirus-disease-covid-19-how-is-it-transmitted (2021).
  32. Dinoi, A., et al. A review on measurements of SARS-CoV-2 genetic material in air in outdoor and indoor environments: Implication for airborne transmission. The Science of the Total Environment. 809, 151137(2022).
  33. Bosch, A., et al. Analytical methods for virus detection in water and food. Food Analytical Methods. 4, 4-12 (2011).
  34. Gonçalves, J., et al. Surveillance of human enteric viruses in coastal waters using concentration with methacrylate monolithic supports prior to detection by RT-qPCR. Marine Pollution Bulletin. 128, 307-317 (2018).
  35. La Rosa, G., Muscillo, M. Molecular detection of viruses in water and sewage. Viruses in Food and Water. , Woodhead Publishing. 97-125 (2013).
  36. Medema, G., Heijnen, L., Elsinga, G., Italiaander, R., Brouwer, A. Presence of SARS-Coronavirus-2 RNA in sewage and correlation with reported COVID-19 prevalence in the early stage of the epidemic in the Netherlands. Environmental Science & Technology Letters. 7 (7), 511-516 (2020).
  37. CDC - 2019-nCoV Real-Time RT-PCR Diagnostic Panel Fact Sheet for Healthcare Providers. Centers for Disease Control and Prevention. , Available from: https://stacks.cdc.gov/view/cdc/85028 (2020).
  38. Conte, M. Airborne concentrations of SARS-CoV-2 in indoor community environments in Italy. Environmental Science and Pollution Research International. 29 (10), 13905-13916 (2022).
  39. Quick, J. nCoV-2019 sequencing protocol v3 (LoCost). protocols.io. , Available from: https://www.protocols.io/view/ncov-2019-sequencing-protocol-v3-locost-bh42j8ye (2020).
  40. Tyson, J. R. Improvements to the ARTIC multiplex PCR method for SARS-CoV-2 genome sequencing using nanopore. , (2020).
  41. ARTIC SARS-CoV-2 Workflow. , Available from: https://github.com/epi2me-labs/wf-artic (2022).
  42. Li, H., et al. The sequence alignment/map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
  43. Freyja. , Available from: https://github.com/andersen-lab/Freyja (2022).
  44. Li, H. A statistical framework for SNP calling, mutation discovery, association mapping and population genetical parameter estimation from sequencing data. Bioinformatics. 27 (21), 2987-2993 (2011).
  45. Grubaugh, N. D., et al. An amplicon-based sequencing framework for accurately measuring intrahost virus diversity using PrimalSeq and iVar. Genome Biology. 20 (1), 8(2019).
  46. Hadfield, J., et al. Nextstrain: real-time tracking of pathogen evolution. Bioinformatics. 34 (23), 4121-4123 (2018).
  47. Aksamentov, I., Roemer, C., Hodcroft, E. B., Neher, R. A. Nextclade: clade assignment, mutation calling and quality control for viral genomes. Journal of Open Source Software. 6 (67), 3773(2021).
  48. Markt, R., et al. Detection and stability of SARS-CoV-2 fragments in wastewater: impact of storage temperature. Pathogens. 10 (9), 1215(2021).
  49. Kocamemi, B. A., et al. First Data-Set on SARS-CoV-2 Detection for Istanbul Wastewaters in Turkey. MedRxiv. , (2020).
  50. Randazzo, W., et al. SARS-CoV-2 RNA in wastewater anticipated COVID-19 occurrence in a low prevalence area. Water Research. 181, 115942(2020).
  51. Hoorfar, J., et al. Practical considerations in design of internal amplification controls for diagnostic PCR assays. Journal of Clinical Microbiology. 42 (5), 1863-1868 (2004).
  52. Parshionikar, S. U., Cashdollar, J., Shay Fout, G. Development of homologous viral internal controls for use in RT-PCR assays of waterborne enteric viruses. Journal of Virological Methods. 121, 39-48 (2004).
  53. Nalla, A. K. Comparative performance of SARS-CoV-2 detection assays using seven different primer-probe sets and one assay kit. Journal of Clinical Microbiology. 58 (6), 00557(2020).
  54. Hirotsu, Y., Mochizuki, H., Omata, M. Double-quencher probes improve detection sensitivity toward Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) in a reverse-transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) assay. Journal of Virological Methods. 284, 113926(2020).
  55. Ahmed, W. First confirmed detection of SARS-CoV-2 in untreated wastewater in Australia: A proof of concept for the wastewater surveillance of COVID-19 in the community. The Science of The Total Environment. 728, 138764(2020).
  56. Bar-Or, I., et al. Detection of SARS-CoV-2 variants by genomic analysis of wastewater samples in Israel. The Science of the Total Environment. 789, 148002(2021).
  57. La Rosa, G., Bonadonna, L., Lucentini, L., Kenmoe, S., Suffredini, E. Coronavirus in water environments: Occurrence, persistence and concentration methods - A scoping review. Water Research. 179, 115899(2020).
  58. Wu, F., et al. SARS-CoV-2 titers in wastewater are higher than expected from clinically confirmed cases. mSystems. 5, 00614(2020).
  59. Wurtzer, S., et al. Evaluation of lockdown effect on SARS-CoV-2 dynamics through viral genome quantification in waste water, Greater Paris, France, 5 March to 23 April 2020. European Communicable Disease Bulletin. 25 (50), 2000776(2020).
  60. VATar COVID-19 | Caso de Exito - Ministerio para la Transición Ecologica y el Reto Demografico. , Available from: https://esri.es/es-es/descubre-los-gis/casos-de-exito/administracion-/vatar-covod19-miteco-cs (2022).
  61. Nemudryi, A., et al. Temporal detection and phylogenetic assessment of SARS-CoV-2 in municipal wastewater. Cell Reports. Medicine. 1 (6), 100098(2020).
  62. Rios, G., et al. Monitoring SARS-CoV-2 variants alterations in Nice neighborhoods by wastewater nanopore sequencing. The Lancet Regional Health. Europe. 10, 100202(2021).
  63. Gomes da Silva, P. Environmental dissemination of SARS-CoV-2 in a University Hospital during the COVID-19 5th wave Delta variant peak in Castile-León, Spain. International Journal of Environmental Research and Public Health. 20, 1574(2023).
  64. Gonçalves, J., et al. Exposure assessment of SARS-CoV-2 and Nov GII/GII in aerosols generated by a municipal wastewater treatment plant. , (2022).
  65. Lednicky, J. A., et al. Isolation of SARS-CoV-2 from the air in a car driven by a COVID patient with mild illness. International Journal of Infectious Diseases. 108, 212-216 (2021).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

RNART qPCR

מאמרים קשורים