Method Article

קביעת יחסי תאימות עצמית (In) ותאימות בין (In) בהדרים באמצעות האבקה ידנית, מיקרוסקופיה וניתוח גנוטיפ S

DOI:

10.3791/65056

⸱

June 30th, 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1National Key Laboratory for Germplasm Innovation & Utilization of Horticultural Crops, Huazhong Agricultural University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מספק שיטה מהירה לקביעת תאימות אבקה ואי התאמה בזני הדרים.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הדר משתמש באי-תאימות עצמית מבוססת S-RNase כדי לדחות אבקה עצמית, ולכן זקוק לעצי האבקה סמוכים לצורך האבקה ודישון מוצלחים. עם זאת, איתור זנים מתאימים שישמשו כמאביקים הוא תהליך שלוקח זמן. כדי לפתור בעיה זו, פיתחנו שיטה מהירה לזיהוי זני הדרים תואמי האבקה המשתמשת באלקטרופורזה של ג'ל אגרוז ובכתמים כחולים אנילין. תאימות האבקה נקבעת על סמך זיהוי גנוטיפים מסוג S על ידי חילוץ DNA כולל וביצוע בדיקות גנוטיפ מבוססות PCR עם פריימרים ספציפיים. בנוסף, סגנונות נאספים 3-4 ימים לאחר האבקה ידנית, וצביעת כחול אנילין מבוצעת. לבסוף, מצב הצמיחה של צינורות האבקה נצפה במיקרוסקופ פלואורסצנטי. תאימות אבקה וחוסר תאימות ניתן לקבוע על ידי התבוננות אם צמיחת צינור אבקה הוא נורמלי או מדוכא, בהתאמה. בשל פשטותה ועלות-תועלתה, שיטה זו היא כלי יעיל לקביעת תאימות האבקה ואי התאימות של זני הדרים שונים כדי ליצור קבוצות אי-התאמה ויחסי אי-התאמה בין זנים שונים. שיטה זו מספקת מידע חיוני לבחירה מוצלחת של עצים מאביקים מתאימים, ובכך מאפשרת הקמת בוסתנים חדשים ובחירת הורים מתאימים לתוכניות רבייה.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אי-תאימות עצמית (SI) היא מנגנון מבוקר גנטית הקיים בכ-40% ממיני האנגיוספרם. בתהליך זה, הפיסטיל דוחה אבקה מצמח בעל אותו גנוטיפ SI, ובכך מונע הפריה עצמית 1,2. Ma jia pummelo הוא זן מקומי במחוז ג'ינגסו שבסין, עם איכויות מצוינות של פירות גדולים ורודים, תכולת מיץ עשירה, טעם מתוק וחמוץ, וקליפה עבה3. למרות ש-SI מקדם יציאה החוצה, הוא משפיע לרעה על היבול והאיכות של פירות4 ומחייב עצים מאביקים מתאימים עם גנוטיפים SI מובהקים לשיעורי קיבוע פירות אמינים ותשואות גבוהות. כיום, ישנם שני סוגים עיקריים של SI, אי-תאימות עצמית ספורופיטית (SSI), המיוצגת על-ידי Brassicaceae, וא....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנה לצביעת כחול אנילין

  1. הכינו את הריאגנטים והכלים הבאים לניסוי: מברשת מאביקים, פינצטה, עיפרון, נייר סולפט, שקית האבקה, שקיות נעילת רוכסן, אטבי נייר, פורמלדהיד, חומצה אצטית קרחונית, אתנול מוחלט, צינורות צנטריפוגה, מלקחיים, טפטפות דבק, שקופיות זכוכית, כיסויים, אזמלים ופוליאתילן גליקול.
  2. יש להכין אמצעי נביטה במבחנה המכיל 0.02% MgSO4, 0.01% KNO 3, 0.03% Ca(NO 3)2, 0.01% H 3 BO 3, 20% PEG-4000 ו-15% סוכרוז. התאם את ה- pH ל- 6.0-6.2 עם KOH. השתמשו במערבל מגנטי מכיוון שקשה להמיס PEG-4,000.
  3. הכינו את התמיסה המקבעת של קרנוי, שהיא אתנול מוחלט וחומצה אצטית ק....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לניסויים שנעשו כאן נבחרו פרחים בוגרים, האנתרים נאספו, יובשו בתנור והאבקה נבטה ב-28 מעלות צלזיוס במשך 12 שעות. כדאיות האבקה ושיעורי הנביטה כומתו כפי שניתן לראות באיור 1.

ההדרים עברו האבקה ידנית, והתאימות וחוסר התאימות של האבקה הוערכו באמצעות צביעה כחולה אנילין ומיקרוסקופ פלואורסצנטי. האבקה התואמת יכולה לנבוט על פני הצלקת ולייצר צינור אבקה רגיל שיכול לגדול ובסופו של דבר להוביל להפריה בשחלה. לעומת זאת, צינורות אבקה לא תואמים גדלו דרך כשני שלישים מהסגנון ואז הפסיקו לג.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בגידולי פירות, הן parthenocarpy ו SI הן תכונות חשובות כי הם סוללים את הדרך פירות ללא זרעים - תכונה כי הוא מוערך מאוד על ידי הצרכנים. חוסר תאימות עצמית מקדם את דחיית האבקה העצמית, ובכך מונע רבייה20. בין הדרים, פומלו הוא זן שאינו תואם את עצמו7. כמעט 40% מכל מיני האנגיוספרם מציגים ת"י21. תכונה זו מונעת קיבוע פירות, מורידה את היבול ומביאה הפסדים כלכליים עצומים למגדלים. כדי לפתור בעיה זו, חקלאים כוללים עצים מאביקים ברחבי המטעים שלהם. עם זאת, בחירת עצים מא.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין להם מה לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרויקט זה נתמך כספית על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (32122075, 32072523).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
אתנול מוחלטסינופארם כימי ריאגנט ושות', בע"מ10009218
אנילין כחולסינופארם כימי ריאגנט ושות', בע"מ
חומצה בורית, H3BO3Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd10004818
בקבוק חוםLabgic טכנולוגיה ושות', בע"מ
סידן חנקתי tetrahydrate, Ca (NO3) 2Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd80029062
צינור צנטריפוגליLabgic טכנולוגיה ושות', בע"מ
צינורות צנטריפוגהLabgic Technology Co., Ltd
CTABGEN-VIEW SCIENTIFIC INC57-09-0 (CAS)
Droppingג'יאנגסו Songchang ציוד רפואי ושות', בע"מ
חומצה אתילנדיאמינטטראצטית, EDTAסינופארם מגיב כימי ושות', בע"מ10009617
מלקחייםLUXIANZI ביוטכנולוגיה ושות', בע"מ
פורמלדהידסינופארם כימי ריאגנט ושות', בע"מ10010018
מטחנה מהירה אוטומטית לחלוטין מדגם מהירשנחאי Jingxin פיתוח תעשייתי ושות', בע"מTissuelyser-96
חומצהאצטית קרחוניתסינופארם כימי ריאגנט ושות', בע"מ10000218
צינור טחינהשנחאי Jingxin פיתוח תעשייתי ושות', בע"מ
איזואמיל אלכוהולסינופארם כימי ריאגנט ושות', בע"מ10003218
איזופרופיל אלכוהולסינופארם כימי ריאגנט ושות', בע"מ80109218
תוויתM& G Chenguang נייר מכתבים ושות', בע"מ
Leica DMi8שנחאי Leica ושות', בע"מ21903797
מגנזיום סולפט heptahydrate, MgSO4Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd10013018
מיקרוסקופ כיסוי זכוכיתZhejiang Shitai תעשייתי ושות', בע"מ
NaClSinopharm כימי ריאגנט ושות', בע"מ10019318
מהדקי ניירM&; G Chenguang נייר מכתבים ושות', בע"מ
עיפרוןM& G Chenguang נייר מכתבים ושות', בע"מ
מברשת מאביקיםשנחאי Yimei פלסטיק ושות', בע"מ
פוליאתילן גליקול, PEG 6000בייג'ינג Dingguo Changsheng ביוטכנולוגיה ושות', בע"מDH229-1
פוליאתילן גליקול, PEG-4000גואנגג'ואו saiguo ביוטכנולוגיה ושות', בע"מ1521GR500
אשלגן הידרוקסיד, KOHסינופארם ריאגנט כימי ושות', בע"מ10017008
אשלגן חנקתי, KNO3Sinopharm מגיב כימי ושות', בע"מ10017218
אזמלג'יאנגסו Songchang ציוד רפואי ושות', בע"מ
שקופיתZhejiang Shitai תעשייתי ושות', בע"מ
נתרן הידרוקסיד, NAOHסינופארם כימי ריאגנט ושות', בע"מ10019718
סוכרוזסינופארם כימי ריאגנט ושות', בע"מ
10021418 סולפט ניירTaizhou Jinnong רשת מפעל
תרמוסטט אמבט מיםשנחאי Jinghong ציוד ניסיוני ושות', בע"מL-909193
TrichloromethaneSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10006818
Tripotassium phosphate tribasic trihydrate, K3PO4ShanghaiLingfeng מגיב כימי ושות', בע"מ20032318
Tris-HClGEN-VIEW SCIENTIFIC INC1185-53-1
שקיות נעילת רוכסןM& G Chenguang נייר מכתבים ושות', בע"מ
&בטא;-מרקפטואתנולGEN-VIEW SCIENTIFIC INC60-24-2(CAS)

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Matsumoto, D., Tao, R. Recognition of S-RNases by an S locus F-box like protein and an S haplotype-specific F-box like protein in the Prunus-specific self-incompatibility system. Plant Molecular Biology. 100 (4-5), 367-378 (2019).
  2. Goldberg, E. E., et al.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Citrus Self IncompatibilityS Genotype AnalysisManual PollinationPollen CompatibilityAniline Blue StainingAgarose Gel ElectrophoresisFluorescence MicroscopyPollen Tube GrowthPCR GenotypingPollinizer Selection

Related Articles