ריכוז הנגיף מדגימות מים ושפכים סביבתיים הוא משימה מאתגרת, המתבצעת בעיקר לזיהוי וכימות נגיפים. בעוד מספר שיטות ריכוז וירוסים פותחו ונבדקו, אנו מדגימים כאן את היעילות של ultrafiltration ו flocculation חלב דל שומן עבור וירוסים RNA עם סוגי דגימה שונים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
ריכוז חלקיקי הנגיף מדגימות מים ושפכים סביבתיים באמצעות חלב דל שומן ואולטרה-סינון
במאמר זה
סיכום
תקציר
אפידמיולוגיה מבוססת מים ושפכים התפתחה כשיטות חלופיות לניטור וחיזוי מהלך ההתפרצויות בקהילות. ההתאוששות של שברים מיקרוביאליים, כולל וירוסים, חיידקים ומיקרו-איקריוטים מדגימות שפכים ומים סביבתיים היא אחד הצעדים המאתגרים בגישות אלה. במחקר זה, התמקדנו ביעילות ההתאוששות של שיטות אולטרה-סינון רציפות ופלוקולציית חלב דל שומן (SMF) באמצעות RNA משוריין כנגיף בדיקה, המשמש גם כבקרה על ידי כמה מחקרים אחרים. סינון מקדים עם מסנני דיסק ממברנות 0.45 מיקרומטר ו- 0.2 מיקרומטר יושמו כדי לחסל חלקיקים מוצקים לפני אולטרה-סינון כדי למנוע סתימה של מכשירי אולטרה-סינון. דגימות הבדיקה, שעובדו בשיטת אולטרה-סינון רציף, צוננו בשתי מהירויות שונות. מהירות מוגברת הביאה לשיעורי התאוששות וחיוביות נמוכים יותר של RNA משוריין. מצד שני, SMF הביא להתאוששות עקבית יחסית ושיעורי חיוביות של RNA משוריין. בדיקות נוספות שנערכו עם דגימות מים סביבתיות הדגימו את התועלת של SMF לריכוז שברים מיקרוביאליים אחרים. חלוקת הנגיפים לחלקיקים מוצקים עשויה להשפיע על שיעורי ההתאוששות הכוללים, בהתחשב בשלב הסינון המוקדם המיושם לפני אולטרה-סינון של דגימות שפכים. SMF עם קדם-סינון הפגין ביצועים טובים יותר כאשר יושם על דגימות מים סביבתיים עקב ריכוזים מוצקים נמוכים יותר בדגימות ולכן שיעורי חלוקה נמוכים יותר למוצקים. במחקר הנוכחי עלה הרעיון להשתמש בשיטת אולטרה-סינון רציפה מתוך הצורך להקטין את הנפח הסופי של תרכיזי הנגיפים בתקופת הקורונה, כאשר אספקת מכשירי האולטרה-סינון הנפוצים הייתה מוגבלת, והיה צורך בפיתוח שיטות חלופיות לריכוז הנגיף.
מבוא
קביעת הריכוז האפקטיבי של מיקרואורגניזמים בדגימות פני השטח והשפכים לצורך ניתוח קהילות מיקרוביאליות ומחקרים אפידמיולוגיים, היא אחד הצעדים החשובים לניטור וחיזוי מהלך ההתפרצויות בקהילות 1,2. מגפת הקורונה, גילתה את החשיבות של שיפור שיטות הריכוז. נגיף הקורונה פרץ בסוף 2019 ונכון למרץ 2023 עדיין מהווה איום על בריאות האדם, חיי החברה והכלכלה. אסטרטגיות מעקב ובקרה יעילות להקלת ההשפעות של התפרצויות COVID-19 בקהילות הפכו לנושא מחקר חשוב, שכן גלים ווריאנטים חדשים של COVID-19 צצים בנוסף להעברה והתפשטות המהירה של הנגיף, כמו גם מקרים אסימפטומטיים לא מדווחים ולא מאובחנים 3,4,5
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. השוואה בין אולטרה-סינון סדרתי לבין פלוקולציית חלב דל שומן לריכוז וירוסים בדגימות שפכים
- הכנת דוגמאות
- יש לאסוף 2 ליטר של דגימות שפכים מרוכבים (משפיעים) ביחס זרימה של 24 שעות. דגימות נאספו משלושת מתקני טיהור השפכים הגדולים בוויניפג, קנדה, במהלך הקיץ והסתיו של 2020 (טבלה 1).
- העבירו את הדגימות למעבדה בבקבוקים חסיני אור בארגז קרח ועבדו אותן תוך 24 שעות. איסוף נתונים פיסיקליים-כימיים וביולוגיים של שפכים.
- בדיקות ריכוז וירוסים
הערה: שיטת אולטרה-סינון רציפה ושיטת פלוקולציה אורגנית, כלומר פלוקולציית חלב דל שומן (SMF), יושמו כדי להעריך את יעילות ההתאוששות הכוללת של כל שיטה באמצעות RNA משוריי....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
הערכת שיטות ריכוז RNA נגיפי
כל שש הדגימות שעובדו עם UF-3k x g היו חיוביות והביאו להתאוששות של 13.38% ± 8.14% (איור 1). רק דגימה אחת הייתה חיובית כאשר הדגימות עובדו עם UF-7.5k x g. כל הדגימות שעובדו עם SMF היו חיוביות והביאו להתאוששות של 15.27% ± 2.65% (איור 1). שיעורי ההתאוששות הממוצעים של UF-3K x g ו- SMF היו גבוהים באופן משמעותי ועקבי (p < 0.0001) מאשר UF-7.5K x g. מצד שני, לא היה הבדל משמעותי.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
אחד השלבים הקריטיים במחקר זה הוא חיסול חלקיקים מוצקים על ידי יישום שלב סינון מקדים עם מסנני קרום 0.2 מיקרומטר ו- 0.45 מיקרומטר. בהתחשב בחלוקה של וירוסים לחלקיקים מוצקים, במיוחד וירוסים עטופים, סינון מוקדם יכול לגרום לאובדן משמעותי בהתאוששות הנגיפים30. בעוד שלב טרום סינון עבור שיטות אולטרה-סינון הוא כמעט תמיד הכרחי עבור דגימות סביבתיות ומי שפכים כדי למנוע סתימה של התקני אולטרה-סינון, סינון מקדים עבור SMF עשוי להידרש בהתאם לסוג הניתוח במורד הזרם. עבור מחקרי PCR ממוקדים, ייתכן שלא יהיה צורך בסינון מו.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים ידועים או קשרים אישיים שיכלו להשפיע לכאורה על העבודה המדווחת במאמר זה.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי NSERC Alliance Covid-19 Grant (פרס מס '431401363, 2020-2021, ד"ר יואן ואויגווארי-דיאז). MUD רוצה להודות לתוכנית מענקי המחקר של האוניברסיטה (פרס מס '325201). הן JF והן JZA נתמכים על ידי תוכנית ההכשרה לתואר שני בניתוח מחלות חזותי ואוטומטי (VADA). KY ו-JF קיבלו שניהם מלגות מתוכנית Mitacs Accelerate. MUD וחברי המעבדה שלו (KY, JF, JZA) נתמכים על ידי NSERC-DG (RGPIN-2022-04508) ומענק החוקר החדש של מחקר מניטובה (No 5385). תודה מיוחדת לעיר ויניפג, מניטובה. מחקר זה נערך באוניברסיטת מניטובה. ברצוננו להכיר בכך שהקמפוסים של אוניברסיטת מניטובה ממוקמים על האדמות המקוריות של עמי אנישינבג, קרי, אוג'י-קרי, דקוטה ודיין ועל מולדת אומת מטיס.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 0.2 M מאגר נתרן פוספט עם pH 7.5 | אלפא Aesar | J62041AP | פישר סיינטיפיק, פייר לון, ניו ג'רזי, ארה"ב |
| 0.2 μ מסנני דיסק ממברנה 47 מ"מ Supor-200 | VWR | 66234 | Pall Corporation, Ann Arbor, MI |
| 0.45 μ m 47 מ"מ Supor-200 מסנני דיסק ממברנה | VWR | 60043 | Pall Corporation, Ann Arbor, MI |
| 4X TaqMan Fast Virus 1-Step Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4444432 Life Technologies, קרלסבד, קליפורניה, ארה"ב | |
| RNA משוריין Quant IPC-1 בקרת עיבוד | Asuragen | 49650 | Asuragen, אוסטין, טקסס, ארה"ב |
| מותג A, מכשיר צנטריפוגלי Jumbosep, 30-kDa | Pall | OD030C65 | Pall Corporation, Ann Arbor, MI |
| Brand B, מכשיר צנטריפוגלי מתקדם Microsep, 30 kDa | Pall | MCP010C46 | Pall Corporation, אן ארבור, |
| צינורות צנטריפוגה MI (50 מ"ל) | Nalgene | 3119-0050PK | Thermo Fisher Scientific |
| DNAse I | Invitrogen | 18047019 | Thermo Fisher Scientific |
| Dyna Mag-2 | Invitrogen | 12027 | Thermo Fisher Scientific |
| GWV קפסולות דגימת מי תהום בקיבולת גבוהה - 0.45 ומיקרו; m | Pall | 12179 | Pall Corporation, אן ארבור, MI |
| חומצה הידרוכלורית, תמיסה סטנדרטית 1N | Thermo Fisher Scientific | AC124210025 | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, ארה"ב |
| MagMAX Microbiome ערכת בידוד חומצות גרעין אולטרה | ביו-מערכות יישומיות | A42358 | Thermo Fisher Scientific |
| Nuclease free water | Promega | P1197 | Promega Corporation, Fitchburg, WI, ארה" |
| ב משאבה פריסטלטית | Masterflex, מכשיר Cole-Parmer | 7553-20 | Thermo Fisher מד |
| pH מדעי | מכשיר דנבר | RK-59503-25 | קול-פארמר. מוצר זה הופסק פנול |
| : כלורופורם: אלכוהול איזואמיל 25: 24: 1 | Invitrogen | 15593031 | פישר סיינטיפיק, פייר לון, ניו ג'רזי, ארה"ב |
| פריימרים וערכות בדיקה | IDT | Integrated DNA Technologies, Inc., Coralville, IA, ארה"ב | |
| Qiagen All-prep DNA/RNA ערכת מיקרוביום כוח | Qiagen Qiagen | Qiagen Sciences, Inc., Germantown, MD, ארה"ב | |
| QuantStudio 5 PCR בזמן אמת מערכת | Thermo Fisher Scientific | A34322 | Life Technologies, קרלסבד, קליפורניה, ארה"ב |
| ערכת בדיקה של Qubit 1X dsDNA רגישות גבוהה (HS) | Invitrogen | Q33231 | Thermo Fisher Scientific |
| Qubit 4 פלואורומטר, עם WiFi | Invitrogen | Q33238 | Thermo Fisher Scientific |
| Qubit RNA ערכת בדיקה רגישות גבוהה (HS) | Invitrogen | Q32855 | Thermo Fisher Scientific |
| RNAse A | Invitrogen | EN0531 | Thermo Fisher Scientific |
| RNeasy Powerערכת מיקרוביום | Qiagen | 26000-50 | Qiagen Sciences, Inc., Germantown, MD, ארה"ב |
| אבקת חלב רזה | Difco (BD Life Sciences)DF0032173 | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, ארה"ב | |
| מאגר נתרן פוספט | Alfa Aesar | Alfa Aesar, אוטווה, ON, קנדה | |
| מי ים סינתטיים | VWR | RC8363-1 | RICCA חברת כימיקלים |
| סינטטי חד-גדילי gBlock | IDT | Integrated DNA Technologies, Inc., Coralville, IA, ארה"ב | |
| VacuCap 90 מכשירי סינון ואקום - 0.1 ומיקרו; מ', 90 מ"מ, Pall | 4621 | Pall Corporation, אן ארבור, MI | |
| VacuCap 90 התקני סינון ואקום - 0.2 ומיקרו; m, 90 מ"מ, | Pall | 4622 | Pall Corporation, אן ארבור, MI |
| β-מרקפטואתנול | Gibco | 21985023 | Fisher Scientific, פייר לון, ניו ג'רזי, ארה"ב |
מקורות
- Kumblathan, T., Liu, Y., Uppal, G. K., Hrudey, S. E., Lix, X. F. Wastewater-based epidemiology for community monitoring of SARS-CoV-2: progress and challenges. ACS Environmental Au. 1, 18-31 (2021).
- Lu, D., Huang, Z., Luo, J., Zhang, X., Sha, S.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
