בעבודה זו, פרוטוקול דה-צלולריזציה עבר אופטימיזציה להשגת מטריצות דה-צלולריות של שרירי השלד של עכבר העובר. מיובלסטים C2C12 יכולים ליישב מטריצות אלה, להתרבות ולהבדיל. מודל זה במבחנה יכול לשמש לחקר התנהגות התא בהקשר של מחלות שרירי שלד כגון ניוון שרירים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
הכנת מטריצות תלת ממדיות דה-צלולריות משריר השלד של עכבר העובר לתרבית תאים
במאמר זה
סיכום
תקציר
המטריצה החוץ תאית (ECM) ממלאת תפקיד מכריע במתן תמיכה מבנית לתאים ובהעברת אותות החשובים לתהליכים תאיים שונים. מודלים דו-ממדיים (2D) של תרביות תאים מפשטים יתר על המידה את האינטראקציות המורכבות בין תאים לבין ECM, שכן היעדר תמיכה תלת-ממדית מלאה (3D) יכול לשנות את התנהגות התא, מה שהופך אותם לבלתי מספיקים להבנה של תהליכי in vivo . ליקויים בהרכב ECM ובאינטראקציות בין תאים ל-ECM הם תורמים חשובים למגוון מחלות שונות.
דוגמה אחת היא ניוון שרירים מולד LAMA2 (LAMA2-CMD), שבו היעדר או הפחתה של למינין פונקציונלי 211 ו 221 יכול להוביל היפוטוניות חמורה, לגילוי או מיד לאחר הלידה. עבודה קודמת באמצעות מודל עכבר של המחלה מציעה כי הופעתה מתרחשת במהלך מיוגנזה עוברית. המחקר הנוכחי נועד לפתח מודל תלת ממדי במבחנה שיאפשר לחקור את יחסי הגומלין בין תאי שריר לבין ECM שריר העובר, תוך חיקוי המיקרו-סביבה הטבעית. פרוטוקול זה משתמש בשרירי גב עמוקים שנותחו מעוברי עכבר E18.5, מטופלים בחיץ היפוטוני, חומר ניקוי אניוני ו- DNase. כתוצאה מכך, המטריצות הדה-צלולריות (dECMs) שמרו על כל חלבוני ECM שנבדקו (למינין α2, סך כל הלמינינים, פיברונקטין , קולגן I וקולגן IV) בהשוואה לרקמה הטבעית.
כאשר מיובלסטים C2C12 נזרעו על גבי dECMs אלה, הם חדרו והתיישבו ב-dECMs, מה שתמך בהתרבות ובהתמיינות שלהם. יתר על כן, תאי C2C12 ייצרו חלבוני ECM, ותרמו לעיצוב מחדש של הנישה שלהם בתוך dECMs. הקמת פלטפורמת מבחנה זו מספקת גישה חדשה ומבטיחה לפענוח התהליכים המעורבים בהופעת LAMA2-CMD, ויש לה פוטנציאל להיות מותאמת למחלות שרירי שלד אחרות שבהן ליקויים בתקשורת בין ECM לתאי שריר השלד תורמים להתקדמות המחלה.
מבוא
המטריצה החוץ תאית (ECM) היא מרכיב עיקרי של רקמות, המייצג את המרכיב הלא-תאי שלהן. מבנה תלת-ממדי (תלת-ממדי) זה לא רק מספק תמיכה פיזית לתאים, אלא גם ממלא תפקיד מכריע בתהליכים הביוכימיים המעורבים בהתפתחות אורגניזמים1. היווצרות ECM ספציפי לרקמה מתרחשת במהלך ההתפתחות, כתוצאה מהאינטראקציות המורכבות בין התאים לנישות שלהם, המושפעות מגירויים תוך-תאיים וחוץ-תאיים שונים. ECM הוא מבנה דינמי ביותר העובר סידורים כימיים ומכניים באופן זמני-מרחבי ומשפיע ישירות על גורל התא2. אחד המאפיינים הבולטים של ECM הוא המגוון התפקודי שלו, שכן כל ECM רקמה מציג שילוב ייחודי של מולקולות המספקות טופולוגיות ותכונות שונות המותאמות לתאים שהוא מכיל
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל המתודולוגיות המתוארות אושרו על ידי הוועדה לרווחת בעלי חיים (ORBEA) של הפקולטה למדעים, אוניברסיטת ליסבון ו- Direção Geral de Veterinária (DGAV; ref. 0421/000/000/2022), והן בהתאם לדירקטיבה האירופית 2010/63/EU.
1. הכנת מאגרי דה-צלולריזציה וריאגנטים
הערה: יש לעקר את כל הפתרונות המשמשים במהלך פרוטוקול דה-צלולריזציה על ידי autoclaving ולאחסן למשך עד 3 חודשים, אלא אם צוין אחרת.
- הכן 10x מלח חוצץ פוספט (10x PBS) על ידי הוספת נתרן כלורי (NaCl) ב 137 mM, אשלגן כלורי (KCl) ב 2.68 mM, אשלגן דימימן פוספט (KH 2 PO 4) ב 8.1 mM, ודיסודיום-מימן-פוספט dihydrate (Na 2 HPO4) ב 1.47 mM למים de....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
מטרת פרוטוקול הדה-צלולריזציה היא לייצר dECMs הדומים מאוד להרכב הרקמה הטבעית. כדי לקבוע את יעילות תהליך הדה-צלולריזציה, נעשה שימוש בשיטות שונות, כולל בדיקת מורפולוגיה של רקמות, מדידת רמות DNA, צביעה עבור F-actin, וניתוח של רכיבי ECM מרכזיים באמצעות אימונוהיסטוכימיה וטכניקות הכתמה מערביות. באופן ספציפי, חמישה רכיבי ECM עיקריים של רקמות שרירי השלד נותחו.
במהלך הפרוטוקול, הדגימות משתנות במראה (איור 1B 1-4). לאחר בידוד.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
ECM היא רשת מורכבת של מקרומולקולות הקיימת בכל הרקמות וממלאת תפקיד מכריע בוויסות התנהגות התא ותפקודו2. ה-ECM משמש כפיגום פיזי שאליו תאים יכולים להיצמד ומספק רמזים המווסתים באופן פעיל תהליכים תאיים כגון התפשטות, תנועתיות, התמיינות ואפופטוזיס. לפיכך, היווצרות נכונה ותחזוקה של ECM חיונית הן לפיתוח והן להומאוסטזיס1.
בעוד מודלים דו-ממדיים של תרביות תאים נמצאים בשימוש נרחב, הם מוחלפים יותר ויותר על ידי פלטפורמות תלת-ממדיות מתקדמות יותר. הסיבה לכך היא שת.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.
תודות
עבודה זו מומנה על ידי האגודה הצרפתית contre les Myopathies (AFM-Téléthon; חוזה מס' 23049), פרויקט MATRIHEALTH, ויחידת cE3c מימון UIDB/00329/2020. ברצוננו להודות לתורם שלנו הנריקה מיירלס שבחר לתמוך בפרויקט MATRIHEALTH. עבודה זו נהנתה מהתשתיות של מתקן המיקרוסקופיה של הפקולטה למדעים, צומת של הפלטפורמה הפורטוגזית של הדמיה ביולוגית (סימוכין PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122), ואנו מודים לואיס מרקס על עזרתו ברכישת ועיבוד תמונה. לבסוף, אנו מודים למרתה פלמה על התמיכה הטכנית ולצוות המחקר שלנו על תרומתם הנדיבה.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| צלחת תרבית תאים 12 באר, שטוחה, TC, | מעבדה | P21021 | |
| 4′,6-דיאמידינו-2-פנילינדול דיהידרוכלוריד | Merck | D8417 | |
| 4– 20% Mini-PROTEAN TGX ג'ל טרומי | Bio-Rad | 4561093 | |
| 48 באר צלחת תרבית תאים, שטוחה, TC, סטרילית | Abdos Labware | P21023 | |
| 96 באר צלחת תרבית תאים, שטוחה, TC, סטרילית | Abdos Labware | P21024 | |
| אלבומין סרום בקר, Fraction V | NZYtech | MB04601 | |
| BX60 מיקרוסקופ פלואורסצנטי | אולימפוס | ||
| Cryostat CM1860 UV | Leica | ||
| Dithiothreitol | ThermoFisher | R0862 | |
| DMEM גלוקוז גבוה עם גלוטמין יציב עם נתרן פירובט | Biowest | L0103-500 | |
| DNase I | PanReac AppliChem | A3778 | |
| DNeasy דם & ערכת רקמות | Qiagen | 69506 | |
| חומצה אתילנדיאמינטטראצטית (EDTA) | Merck | 108418 | |
| סרום בקר עוברי | Biowest | S1560-500 | |
| פיפטה להעברת קצה עדין | ThermoFisher | 15387823 | |
| סרום עיזים | Biowest | S2000-100 | |
| Hera Guard Flow Cabinet | Heraeus | ||
| Heracell 150 CO2 Incubator | Thermo Scientific | ||
| HiMark Pre-stained Protein Standard | Invitrogen | ||
| Horse Serum, ממוצא ניו זילנדי | Gibco | 16050122 | |
| HRP-α- ארנב IgG | abcam | ab205718 | |
| HRP-α- Rat IgG | abcam | ab205720 | |
| HRP-α- עכבר IgG | abcam | ab205719 | |
| ImageJ v. 1.53t | |||
| מתיל ירוק | סיגמא-אולדריץ' | 67060 | |
| MM400 לייזר רקמות | Retsch | ||
| NanoDrop ND-1000 ספקטרופוטומטר | ThermoFisher | ||
| Paraformaldehyde, 16% w/v aq. soln., ללא מתנול | אלפא Aesar | 043368-9M | |
| פניצילין-סטרפטומיצין (100x) | GRiSP | GTC05.0100 | |
| פלואידין אלקסה 488 | תרמו פישר מדע. | A12379 | |
| צלחת פטרי פוליסטירן 60x15 מ"מ עם פתחי אוורור (סטרילי) | Greiner Bio-One | 628161 | |
| Qubit dsDNA HS kit | Thermo Scientific | Q32851 | |
| Qubit ™ 3 פלואורומטר | Invitrogen | 15387293 | |
| S6E זום סטריאו מיקרוסקופ | Leica | ||
| נתרן דודציל סולפט | Merck | 11667289001 | |
| SuperFrost® פלוס שקופיות הידבקות | Thermo Scientific | 631-9483 | |
| SuperSignal West Pico PLUS מצע כימילומינסנט | Thermo Scientific | 15626144 | |
| מיקרוסקופ קונפוקלי TCS SPE | Leica | ||
| Tris-(hidroximetil) aminometano (בסיס Tris) ≥ 99% | VWR Chemicals | 28811.295 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%) ב-DPBS (1X) | GRiSP | GTC02.0100 | |
| TWEEN 20 (50% תמיסה) | ThermoFisher | 3005 | |
| WesternBright PVDF-CL גליל ממברנה (0.22µ m) | Advansta | L-08024-001 | |
| α-קולגן I | abcam | ab21286 | |
| α-קולגן IV | Millipore | AB756P | |
| α-קולגן IV | סנטה קרוז ביוטכנולוגיה | sc-398655 | |
| α-פיברונקטין | סיגמא | F-3648 | |
| &אלפא;-למינין ואלפא; 2 | סיגמא | L-0663 | |
| &אלפא;-MHC | D.S.H.B. | MF20 | |
| α-Mouse Alexa 488 | בדיקות מולקולריות | A11017 | |
| α-עכבר Alexa 568 | בדיקות מולקולריות | A11019 | |
| α-pan-Laminin | Sigma | L- 9393 | |
| α-phospho-histone 3 | Merk Millipore | 06-570 | |
| α-Rabbit Alexa 568 | בדיקות מולקולריות | A21069 | |
| α-ארנב Alexa 488 | בדיקות מולקולריות | A11070 | |
| α-Rat Alexa 488 | בדיקות מולקולריות | A11006 |
מקורות
- Mecham, R. P. Overview of extracellular matrix. Current Protocols in Cell Biology. 10, 1-16 (2012).
- Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).
- Lamandé, S. R., Bateman, J. F.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
