יש צורך במודל מתאים של בעלי חיים כדי להבין את המנגנונים הפתולוגיים העומדים בבסיס היצרות מסתם אבי העורקים (AVS) ולהעריך את יעילותן של התערבויות טיפוליות. הפרוטוקול הנוכחי מתאר הליך חדש לפיתוח מודל ארנב AVS באמצעות פגיעה ישירה בבלון in vivo.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
מודל היצרות של מסתם אבי העורקים של ארנב הנגרם על ידי פגיעה ישירה בבלון
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
מודלים של בעלי חיים מתגלים ככלי חשוב להבנת המנגנונים הפתולוגיים העומדים בבסיס היצרות מסתם אבי העורקים (AVS) בגלל היעדר גישה למקורות אמינים של מסתמי אבי העורקים האנושי החולים. בין המודלים השונים של בעלי חיים, דגמי ארנבים AVS הם אחד הנפוצים ביותר במחקרים בבעלי חיים גדולים. עם זאת, מודלים מסורתיים של ארנבי AVS דורשים תקופה ארוכת טווח של תוספי תזונה ומניפולציה גנטית כדי לגרום להיצרות משמעותית במסתם אבי העורקים, מה שמגביל את השימוש בהם במחקרים ניסיוניים. כדי להתמודד עם מגבלות אלה, מוצע מודל חדש של ארנב AVS, שבו היצרות נגרמת על ידי פגיעה ישירה בבלון למסתם אבי העורקים. הפרוטוקול הנוכחי מתאר טכניקה מוצלחת להשראת AVS בארנבים לבנים בניו זילנד (NZW), עם הליכים שלב אחר שלב להכנה, להליך הכירורגי ולטיפול שלאחר הניתוח. מודל פשוט וניתן לשחזור זה מציע גישה מבטיחה לחקר ההתחלה וההתקדמות של AVS ומספק כלי רב ערך לחקר המנגנונים הפתולוגיים הבסיסיים של המחלה.
מבוא
יותר ויותר ידוע כי השימוש במודלים מתאימים של בעלי חיים יכול לתרום להבנה טובה יותר של המנגנונים הפתולוגיים העומדים בבסיס היצרות מסתם אבי העורקים (AVS) בשל היעדר גישה למקורות אמינים של מסתמי אבי העורקים האנושיים החולים הקשורים להתקדמות היצרות אבי העורקים (AS). בין המודלים השונים של בעלי חיים לחקר AVS, ארנבים הם אחד המודלים הנפוצים ביותר של AVS בעלי חיים גדולים, ומודל ארנב AVS מושרה באמצעות תוספת כולסטרול / ויטמין D2 או מניפולציה גנטית 1,2,3,4.
למרות שמודלים של AVS מספקים תובנה משמעותית לגבי הפיתוח וההתקדמות של AVS, זה עדיין מאתגר לגרום ל- AVS באופן עקבי וניתן לשחזור, כפי שניתן לראות בניסויים הראשוניים שלנו.
בנוסף למודלים של בעלי חיים הנגרמים על ידי תזונה ורגישים גנטית, מודל חדש של AVS הוקם באמצעות פגיעה מכנית ישירה בעכברים 5,6. מודל הפגיעה המכנית גורם בהצלחה להיצרות אבי העורקים ומייצג מודל AVS פשוט וניתן לשחזור בעכברי בר. למיטב ידיעתנו, לא נערכו מחקרים קודמים שבדקו את ההשפעות של פגיעה מכנית על המסתם האאורטלי במודלים של ארנבים. לפיכך, מחקר זה מספק הליך חדש לגרימת AVS בארנבים לבנים מניו זילנד באמצעות פגיעה ישירה בבלון למסתם אבי העורקים, אשר יכול לחקות במדויק את המצב של היצרות אבי העורקים המסתם. פרוטוקול זה כולל תיאורים שלב אחר שלב של ההכנה, ההליך הכירורגי והטיפול שלאחר הניתוח, אשר שימושיים לגרימת מודלים של ארנב AVS הניתנים לשחזור.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל הליכי המחקר בבעלי חיים אושרו ובוצעו בהתאם לחוק רווחת חיות המעבדה, המדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה, וההנחיות והמדיניות לניסויים בבעלי חיים שסופקו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) במכללה לרפואה של האוניברסיטה הקתולית של קוריאה (מספר אישור: CUMC-2021-0176-05). במחקר הנוכחי נעשה שימוש בארנבים לבנים מניו זילנד (NZW) בני 3 חודשים במשקל 3.5-4.0 ק"ג, שהוחזקו בתנאים סטנדרטיים בכלובים בודדים. הארנבים קיבלו תזונה רגילה או תזונה מועשרת בכולסטרול ב-0.5% בתוספת 50,000 U של ויטמין D2 (ראו טבלת חומרים). שיטות התכנון והניתוח הניסיוניות להשראת מודל הארנב AVS מתוארות באיור 1.
1. הכנה למבצע
- יש לוודא שכל המכשירים הרפואיים והכירורגיים (ראה טבלת חומרים) מעוקרים בתחילת הניתוח.
- הכינו את סט צנתרי בלון ההתרחבות לפי השלבים הבאים.
- חבר את התקן הדפלציה המלא בתערובת של מלח ואמצעי ניגוד הזמינים מסחרית (1:1) לחלק נעילת הפיתוי של צנתר הבלון (ראה טבלת חומרים).
- מלאו את הבלון בתמיסת ניפוח, והוציאו אוויר מצנתר הבלון.
הערה: במחקר הנוכחי, תמיסת הניפוח כללה 30% יודיקסנול עם 0.9% מלוחים (ראה טבלת חומרים). - ודא ניפוח בלון תקין על ידי ניקוי לומן הבלון עם פתרון הניפוח.
2. הליך כירורגי לפגיעה במסתם אבי העורקים
- מתן זריקה תוך שרירית של tiletamine & zolazepam (15 מ"ג / ק"ג) ו xylazine (5 מ"ג / ק"ג) (ראה טבלה של חומרים) כדי להרדים את החיה.
הערה: לפני מתן ההרדמה, הארנבים טופלו מראש בזריקת גליקופירולט תת-עורית (0.05 מ"ג/ק"ג) כחומר אנטיכולינרגי טרום הרדמה. רמת ההרדמה הנאותה נקבעה על פי שילוב של קריטריונים, כולל חוסר תגובה לצביטה בבוהן וקצב נשימה יציב. - יש להכניס צנתר תוך ורידי (IV) במשקל 24 גרם לווריד האוריקולרי השולי, ולחבר ערכת עירוי עם מי מלח הפרינים (100 U/kg הפרין).
- חברו את הארנב למוניטור וטרינרי רב-פרמטרים (ראו טבלת חומרים) כדי לנטר באופן רציף את הסימנים החיוניים, כגון אות ריווי החמצן (SpO2), טמפרטורה ולחץ דם.
הערה: לניטור SpO 2, חבר את חיישן SpO2 ללשון הארנב. לניטור הטמפרטורה, הכנס את הבדיקה לפי הטבעת של הארנב. לניטור לחץ הדם, הניחו את השרוול על הגפה הקדמית. - הניחו את הארנב במצב שכיבה על שולחן ניתוחים המצויד בפלואורוסקופיה של זרוע C (ראו טבלת חומרים), והוציאו את השיער מאזור צוואר הגחון באמצעות קוצצי שיער של חיות (איור 2A).
- לעקר את אזור החתך עם יוד, ולכסות את הארנב עם מגבות כירורגיות.
- מקמו את לב הארנב במרכז תמונת זרוע C.
הערה: כל החוקרים חייבים ללבוש ציוד מגן עם דוזימטרים תרמו-לומינסנטיים מחוברים (TLDs) כדי להפחית את החשיפה לקרינה בעת ביצוע ניתוח מונחה זרוע C.- הפעל את זרוע C ובחר את המצב הפלאורוסקופי להדמיית לב.
- התאימו את מיקום הארנב כדי לוודא שהלב נמצא במרכז שדה ההדמיה.
- בצעו חתך אורכי של כ-3 ס"מ בעור הצוואר, והשתמשו במספריים כירורגיים כדי לחתוך את הפאשיה ואת רקמת השומן.
- חשוף את עורק התרדמה המשותף השמאלי (LCCA) על-ידי הפרדה זהירה בין השרירים עד לחשיפת כ-3-3.5 ס"מ מה-LCCA (איור 2B).
- קשרו את ה-LCCA עם תפר משי 3-0 (ראו טבלת חומרים) בחלק העליון והקצה של ה-LCCA החשוף כדי לעצור את זרימת הדם.
- הכנס צנתר IV 22 G לתוך LCCA, והכנס חוט מנחה (0.016 אינץ ', ראה טבלת חומרים) לחדר השמאלי (LV) דרך צנתר IV, כדי להבטיח כי קצה הצנתר ממוקם כראוי בשדה הדימות של זרוע C.
הערה: בעת החדרת צנתר העירוי, שחררו בזהירות את תפר הרצועה בדרך למטה אל המסתם האאורטלי כדי לאפשר את התקדמות הצנתר. - משכו את צנתר העירוי, עזבו את חוט ההנחיה, והניחו נדן 4-F (ראו טבלת חומרים) מעל חוט ההנחיה לתוך ה-LCCA כדי להכניס את צנתר הבלון (איור 2C).
הערה: לאחר החלפת צנתר העירוי בנדן, יש להסיר כל אוויר כלוא ממכשיר הנדן. - הכניסו בזהירות את צנתר הבלון בקוטר 8 מ"מ מעל חוט ההנחיה לתוך המסתם האאורטלי תחת הנחיה פלואורוסקופית של זרוע C (איור 2D).
- מניחים את קצה צנתר הבלון כ-1-2 ס"מ דיסטלי לשסתום אבי העורקים, ומנפחים את הבלון על ידי ניקוי תמיסת הניפוח עם מנפח לחץ ב-6 אטמוספירה.
- מקדמים את הבלון לקודקוד ה-LV ומושכים אותו חזרה לשקע ה-LV. חזרו על התהליך הזה חמש פעמים, ואז פוצצו את הבלון (איור 2E, F).
- חזור על שלבים 2.8-2.9 שלוש פעמים כדי להבטיח פגיעה מספקת במסתם.
- מוציאים את צנתר הבלון ואת חוט ההנחיה. הסר לאט את הנדן מה- LCCA, ומיד קשר את ה- LCCA עם התפר בדרך למטה לשסתום אבי העורקים.
- נקו את אזור החתך במי מלח כדי להסיר את קרישי הדם, ובדקו את האתר המנוקב לדימום עורקי.
- סוגרים את השריר והעור בתפר 3-0 שאינו נספג, ומעקרים את כל צידי הפצע ביוד.
3. טיפול לאחר הניתוח
- הסירו את מדבקות הניטור והקליפים, והחזיקו את הארנב באינקובטור טיפול נמרץ.
הערה: לאחר הניתוח, הארנבים היו במעקב צמוד במשך יום אחד באינקובטור טיפול נמרץ ולאחר מכן הועברו לכלוב ביתי. - לטפל בכאב לאחר הניתוח עם 5 מ"ג / ק"ג טרמדול ו 3 מ"ג / ק"ג קטופרופן ולתת אנטיביוטיקה (4 מ"ג / ק"ג גנטמיצין) פעמיים ביום במשך 3 ימים באמצעות הזרקה תת עורית (ראה טבלת חומרים).
הערה: טיפול בכאב לאחר הניתוח צריך לדבוק בהנחיות וטרינריות והנחיות IACUC (למשל, אופיואיד, NSAID, הרדמה מקומית או שילוב). - האכילו תזונה מועשרת ב-0.5% כולסטרול ב-50,000 U של ויטמין D2 (HC + VitD2) במשך 8 שבועות.
4. אקוקרדיוגרפיה
- לאחר 8 שבועות של פגיעה בבלון, יש להרדים את הארנב באותו הליך המתואר בשלב 2.1.
- הצג באופן חזותי את מסתמי אבי העורקים באמצעות תצוגות טרנס-חזיות דו-ממדיות, והקלט תמונות במצב M בתצוגות של ציר קצר וציר ארוך.
- הניחו את הארנב במצב שכיבה על שולחן תהודה.
- יש לגלח את אזור החזה באמצעות קוצץ וקרם להסרת שיער.
- יש למרוח ג'ל מתמר אולטרסאונד (ראו טבלת חומרים) על החזה.
- כוונן את המתמר כדי לקבל את תצוגת הציר הארוך של בית החזה ואת תצוגת הציר הקצר של שסתום אבי העורקים.
- השתמש בהדמיה במצב M כדי להקליט תמונות של שסתום אבי העורקים הן בתצוגה של ציר ארוך והן בתצוגה של ציר קצר, ושמור את התמונות לניתוח מאוחר יותר.
5. ניתוח היסטולוגי
- לאחר אקוקרדיוגרפיה, להרדים את הארנב על ידי מתן זריקה תוך ורידי של אשלגן כלורי (KCl, 3 גרם / 20 מ"ל, 1 מ"ל).
- פתחו את חלל בית החזה, קצרו את הלב עם אבי העורקים העולה7, והניחו אותו על קרח במי מלח חוצצי פוספט (PBS).
- יש לטבול מיד את הלב בתמיסת 4% פרפורמלדהיד (PFA) ולהטמיע אותה בגוש פרפין (ראו טבלת חומרים).
- חתכו את בלוק הלב המשובץ בפרפין למקטעים בעובי 4 מיקרומטר באמצעות מיקרוטום, והכתימו את הקטעים בטריכרום של מאסון (MT), אליזרין אדום ופון קוסה (ראו טבלת חומרים) כדי להעריך את שקיעת הקולגן ואת הסתיידות המסתם, בהתאמה 8,9.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
מודל AVS ארנב המושרה על ידי פגיעה במסתם אבי העורקים
כדי לגרום למודל AVS ארנב, ארנבי NZW זכרים במשקל 3.5-4.0 ק"ג שימשו למחקר זה. על פי הפרוצדורות הכירורגיות המתוארות בשלב 2 (איור 2), מודל AVS נקבע על ידי פגיעה במסתם אבי העורקים, שהביאה לניוון מכני של מסתם אבי העורקים ולהסתיידות. קבוצת הביקורת כללה ארנבים שניזונו מתזונה מועשרת ב-0.5% כולסטרול (כולסטרול גבוה, HC) ו-50,000 U של ויטמין D2 (VitD2), הידוע כמודל AVS המושרה על ידי דיאטה.
הערכת ש...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
מודלים של AVS בבעלי חיים משמשים בדרך כלל לחקר ההיבטים הפתולוגיים של AVS, כולל אתחול והתקדמות של AVS. פרוטוקול זה מציג מודל AVS חדש של ארנב המושרה על ידי פגיעה ישירה בבלון לשסתום אבי העורקים. במחקר זה, מודל הפגיעה במסתם אבי העורקים הראה עיבוי והסתיידות עלונים משמעותיים. בהשוואה למודל AVS המתון המושרה על ידי תוספי תזונה, המסתם האאורטלי במודל הפציעה הישירה בבלון נפגע באופן סלקטיבי, מה שהוביל לעיבוי ותנועה מוגבלת, כמו גם עלונים מעובים ומסוידים. תוצאות אלה תואמות את המאפיינים הכלליים של AVS10,11
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר עליהם בעבודה זו.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי מענק קרן המחקר הלאומית של קוריאה (NRF) במימון ממשלת קוריאה (MSIT) (מס '2020R1A4A3079570), משרד החינוך (מס '2021R1I1A1A01051425), והתוכנית לפיתוח טכנולוגיה אסטרטגית תעשייתית (מס '20014873) במימון משרד המסחר, התעשייה והאנרגיה, הרפובליקה של קוריאה.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 3-0 תפר משי | AILEE | SK312 | |
| 4% פרפורמלדהיד (PFA) | אינטרון | IBS-BP031-2 | |
| תמיסה אדומה אליזרין | Millpore | TMS-008-C | |
| ASAHI SION BLUE | ASAHI | מדריך חוט | |
| כיסוי שולחן אחורי | יוהאן קימברלי | 80101-30 | |
| בלון במכשיר דפלציה | Demax רפואי | DID30s | |
| ביונט מוניטור וטרינרי | BIONET | BM3 VET | |
| C-Arm | SIEMENS Healthcare GmbH | Cios אלפא | |
| מוסמך ארנב דיאטה | פורינה | 5322 | 4.7% שמן קוקוס מוקשה, 0.5% כולסטרול & 1% Molasse |
| Curadle חממה חכמה | Autoelex | CS-CV206 | יחידה לטיפול נמרץ (ICU) |
| Ergocalciferol | Sigma-aldrich | E5750 | ויטמין D2 |
| Fechtner מלקחיים לחמית טיטניום | מכשיר WORLD PRECISSION | WP1820 | |
| מלקחיים | HEBU | HB203 | |
| גנטמיצין | שין פונג | ||
| גליקופירולאט | SamChunDang | ||
| Greenflex NS | DAI HAN PHARM | תמיסת מלח רגילה 500 מ"ל | |
| תמיסת המטוקסילין | סיגמא-אולדריץ' | HT1079-1 SET | |
| Heparin | JW פרמצבטי | 25,000 | |
| U סט עירוי לשימוש חד פעמי | SWOON MEDICAL | ||
| יוד | ירוק תרופות | ||
| יודיקסנול | GE Healthcare | Visipaque | תמיסת ניפוח (חומר ניגוד) |
| צנתר IV 22 גרם | BD | ||
| 382423 צנתר IV 24 גרם | BD | 382412 | |
| קטופרופן | SamChunDang | ||
| Luer-Lok מזרק 10 מ"ל | בקטון דיקינסון רפואי | ||
| מזרק Luer-Lok 3 מ"ל | מיקרוסקופ רפואי בקטון דיקינסון | ||
| OLYMPUS | SZ61 | ||
| מיקרוטום | ThermoFisher Scientific | HM 325 | |
| Sigma-aldrich | HT15-1kt | ||
| Solco | 009-1304 | ||
| מחזיק מחט עם מנעול ותפר | JEUNGDO BIO & צמח | H-1222-18 | |
| פרפין | LK LABKOREA | H06-660-107 | |
| PBS | Gibco | 10010-023 | |
| אשלגן כלורי 40 | Daihan Pharm | KCl | |
| Prelude נדן הידרופילי אידיאלי | MERIT MEDICAL | PID4F11018SS | נדן 4F |
| PTA צנתר הרחבת בלון PTA | בוסטון סיינטיפיק | H749-3903280208-0 | קטטר בלון 8.0 מ"מ |
| Rompun | Elanco | Xylaxine | |
| סטרילי גזה | DAE HAN רפואי | 10 ס"מ x 20 ס"מ | |
| כפפות כירורגיות | Ansell | Ansell | |
| שמלה כירורגית | Yuhan kimberly | 90002-02 | |
| מספריים כירורגיות | Nopa, גרמניה | AC020/16 | |
| סרט כירורגי | 3M micopore | 1530-1 | |
| מזרק 1 מ"ל | מזרק רפואי | ||
| 10 מ"ל | שין צ'אנג רפואי | ||
| קלטת טישו | Scilav korea | Cas3003 | |
| מתמר ג'ל | SUNGHEUNG | SH102 | |
| Tridol | Yuhan Corp. | מערכת אולטרסאונד Tramadol HCl | |
| Philps | Affiniti 50 | ||
| Von Kossa ערכת כתמים | Abcam | ab105689 | |
| Zoletil 50 | Virbac korea | Tiletamine & zolazepam |
מקורות
- Aliev, G., Burnstock, G. Watanabe rabbits with heritable hypercholesterolaemia: A model of atherosclerosis. Histology and Histopathology. 13 (3), 797-817 (1998).
- Cimini, M., Boughner, D. R., Ronald, J. A., Aldington, L., Rogers, K. A. Development of aortic valve sclerosis in a rabbit model of atherosclerosis: An immunohistochemical and histological study. Journal of Heart Valve Disease. 14 (3), 365-375 (2005).
- Drolet, M. C., Couet, J., Arsenault, M. Development of aortic valve sclerosis or stenosis in rabbits: role of cholesterol and calcium. Journal of Heart Valve Disease. 17 (4), 381-387 (2008).
- Sider, K. L., Blaser, M. C., Simmons, C. A. Animal models of calcific aortic valve disease. International Journal of Inflammation. 2011, 364310(2011).
- Honda, S., et al. A novel mouse model of aortic valve stenosis induced by direct wire injury. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (2), 270-278 (2014).
- Niepmann, S. T., et al. Graded murine wire-induced aortic valve stenosis model mimics human functional and morphological disease phenotype. Clinical Research in Cardiology. 108 (8), 847-856 (2019).
- Robbins, N., Thompson, A., Mann, A., Blomkalns, A. L. Isolation and excision of murine aorta; A versatile technique in the study of cardiovascular disease. Journal of Visualized Experiments. (93), e52172(2014).
- Wirrig, E. E., Gomez, M. V., Hinton, R. B., Yutzey, K. E. COX2 inhibition reduces aortic valve calcification in vivo. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 35 (4), 938-947 (2015).
- Jung, S. H., et al. Spatiotemporal dynamics of macrophage heterogeneity and a potential function of Trem2(hi) macrophages in infarcted hearts. Nature Communications. 13 (1), 4580(2022).
- Freeman, R. V., Otto, C. M. Spectrum of calcific aortic valve disease: Pathogenesis, disease progression, and treatment strategies. Circulation. 111 (24), 3316-3326 (2005).
- Lindman, B. R., et al. Calcific aortic stenosis. Nature Reviews Disease Primers. 2, 16006(2016).
- Cuniberti, L. A., et al. Development of mild aortic valve stenosis in a rabbit model of hypertension. Journal of the American College of Cardiology. 47 (11), 2303-2309 (2006).
- Marechaux, S., et al. Identification of tissue factor in experimental aortic valve sclerosis. Cardiovascular Pathology. 18 (2), 67-76 (2009).
- Hara, T., et al. Progression of calcific aortic valve sclerosis in WHHLMI rabbits. Atherosclerosis. 273, 8-14 (2018).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
