פרוטוקול זה מציג מיפוי אופטי דו-צבעי של לבבות עכברים המתקבלים מחיות בר וחיות בר המושפעות מטכיקרדיה חדרית פולימורפית קטכולמינרגית, כולל מדידות אלקטרופיזיולוגיות של מתח טרנסממברנה וטרנזיאנטים תוך-תאיים Ca2+ ברזולוציה טמפורלית ומרחבית גבוהה.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
מיפוי אופטי של לבבות בצבע כפול מעכברי RyR2R2474S של טכיקרדיה חדרית פולימורפית קטכולמינרגית
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
הפרעת הלב הפרו-אריתמית קטכולמינרגי טכיקרדיה חדרית פולימורפית (CPVT) מתבטאת באפיזודות טכיקרדיה חדרית פולימורפית בעקבות פעילות גופנית, מתח או אתגר קטכולאמין, אשר יכול להידרדר לפרפור חדרים שעלול להיות קטלני. לב עכבר הוא מין נפוץ למידול מחלות הפרעות קצב לב תורשתיות, כולל CPVT. מיפוי אופטי סימולטני של פוטנציאל טרנסממברנה (Vm) ומעברי סידן (CaT) מלבבות עכברים מחוררים לנגנדורף הוא בעל פוטנציאל להבהיר מנגנונים העומדים בבסיס הפרעת קצב. בהשוואה לחקירה ברמה התאית, טכניקת המיפוי האופטי יכולה לבדוק כמה פרמטרים אלקטרופיזיולוגיים, כגון קביעת ההפעלה, מהירות ההולכה, משך פוטנציאל הפעולה ומשך CaT. מאמר זה מציג את מערך המכשור וההליך הניסיוני למיפוי אופטי בתפוקה גבוהה של CaT ו-V m בלבבות מסוג פרא מורין ו-RyR2-R2474S/+ הטרוזיגוטיים, בשילוב עם קצב חשמלי מתוכנת לפני ובמהלך אתגר האיזופרוטרנול. גישה זו הדגימה שיטה ישימה ואמינה ללימוד מכניסטי של מחלת CPVT בהכנת לב עכבר ex vivo.
מבוא
הפרעת לב תורשתית טכיקרדיה חדרית פולימורפית קטכולמינרגית (CPVT) מתבטאת באפיזודות טכיקרדיה חדרית פולימורפית (PVT) בעקבות פעילות גופנית, מתח או אתגר קטכולאמין, אשר יכולות להידרדר לפרפור חדרים שעלול להיות קטלני 1,2,3,4 . עדויות עדכניות בעקבות הדו"ח הראשון שלה כתסמונת קלינית בשנת 1995 היו מוטציות מעורבות בשבעה גנים, כולם מעורבים בשחרור רשתית סרקופלזמית (SR) Ca 2+ במצב זה: הדיווח הנפוץ ביותר על RYR2 המקודד קולטן ריאנודין 2 (RyR2) של Ca2+ ערוצי שחרור5,6, FKBP12.67, CAS....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
עכברי בר זכרים בני 10 עד 14 שבועות או עכברי RyR2-R2474S/+ (רקע C57BL/6) במשקל 20-25 גרם משמשים לניסויים. כל הנהלים אושרו על ידי הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים של האוניברסיטה הרפואית סאות'ווסט, סצ'ואן, סין (אישור NO:20160930) בהתאם להנחיות הלאומיות לפיהן פועל המוסד.
1. הכנה
- פתרונות מלאי
- תמיסת מלאי Blebbistatin: הוסף 1 מ"ל של 100% dimethyl sulfoxide (DMSO) בבקבוק המקורי המכיל 2.924 מ"ג של (-) אבקת blebbistatin כדי להגיע לריכוז של 10 mM.
- מחוון מתח RH237 פתרון מלאי: הוסף 1 מ"ל של 100% DMSO בבקבוק המקורי עם 1 מ"ג של אבקת RH237 כדי להשיג ריכוז של 2.01 mM.
- אינדיקטור סידן Rhod-2 AM ת....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
מיפוי אופטי הוא גישה פופולרית בחקר הפרעות קצב לב מורכבות בעשור האחרון. מערך המיפוי האופטי מורכב ממצלמת EMCCD, המעניקה קצב דגימה של עד 1,000 הרץ ורזולוציה מרחבית של 74 x 74 מיקרומטר לכל פיקסל. הוא מאפשר יחס אות-רעש גבוה למדי במהלך דגימת אות (איור 1). ברגע שהלב המחורר בלנגנדורף מגיע למצב יציב וטעינת הצבע מסתיימת, הלב ממוקם בחדר ההומואותרמי תחת הארה של שתי נוריות LED של 530 ננומטר, המשמשות לעירור מחוון המתח RH237 ומחוון Ca2+ Rhod-2 AM. אור הפליטה מחולק לשני אורכי גל של 600 ננומטר (עב.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
בהתבסס על הניסיון שלנו, המפתחות למיפוי אופטי מוצלח של לב עכבר בצבע כפול כוללים פתרון מוכן היטב ולב, טעינת צבע, השגת יחס אות לרעש הטוב ביותר והפחתת חפץ התנועה.
הכנת פתרון
פתרון קרבס חיוני לניסוי לב מוצלח. תמיסות מלאי MgCl 2 ו- CaCl2 (1 mol/L) מוכנות מראש בהתחשב בספיגת המים שלהן ומתווספות לתמיסת קרבס לאחר שכל שאר הרכיבים מומסים במים טהורים מכיוון ש- Mg 2+ ו- Ca 2+ יכולים לזרז בקלות עם CO3 2+. תמיסת קרבס מבעבעת .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
לאף אחד מהכותבים אין ניגודי עניינים להצהיר.
תודות
מחקר זה נתמך על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (81700308 ל- XO ו- 31871181 ל- ML, ו- 82270334 ל- XT), תוכנית התמיכה במדע וטכנולוגיה של מחוז סצ'ואן (CN) (2021YJ0206 ל- XO, 23ZYZYTS0433 ו- 2022YFS0607 ל- XT, ו- 2022NSFSC1602 ל- TC) ומעבדת מפתח המדינה לכימיה והנדסה מולקולרית של משאבים רפואיים (אוניברסיטת גואנגשי הרגילה) (CMEMR2017-B08 ל- XO), MRC (G10031871181 עד ML02647, G1002082, מ"ל), BHF (PG/14/80/31106, PG/16/67/32340, PG/12/21/29473, PG/11/59/29004 ML), BHF CRE באוקספורד (ML).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 0.2 μ מסנן מזרק m | מפעל ציוד רפואי של שנחאי מכשירים רפואיים ושות', בע"מ, שנחאי, סין | N / A | לפתרון סינון |
| 15 מ"ל צינור צנטריפוגה | גואנגג'ואו ג'ט ביו-סינון ושות', בע"מ סין | CFT011150 | |
| 1 מ"ל פסטר פיפטה | בייג'ינג Labgic Technology Co., Ltd. סין | 00900026 | |
| 1 מ"ל מזרק | B. Braun Medical Inc. | YZB/GER-5474-2014 | |
| 200 μ צינור L PCR | סנגון ביוטק ושות', בע"מ שנחאי. סין | F611541-0010 | Aliquote פתרונות המלאי כדי למנוע הקפאה והפשרה חוזרת של |
| 50 מ"ל צינור צנטריפוגה | גואנגג'ואו ג'ט ביו-סינון ושות', בע"מ סין | CFT011500 | חנות הפתרון של Tyrode ב-4 מעלות; C לבידוד לב מעקב |
| 585/40 ננומטר מסנן | Chroma Technology | N/A | מסנן לאות סידן |
| 630 ננומטר מסנן מעבר ארוך | Chroma Technology | G15604AJ | מסנן לאות מתח |
| Avertin (2,2,2-tribromoethanol) | Sigma-Aldrich Poole, דורסט, בריטניה | T48402-100G | כדי למזער סבל ורפלקס כאב |
| Blebbistatin | Tocris Bioscience, מיניאפוליס, מינסוטה, ארצות הברית | SLBV5564 | מנתק עירור-התכווצות ל לחסל חפץ תנועה במהלך המיפוי |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich, סנט לואיס, מיזורי, ארצות הברית | SLBK1794V | לפתרון של Tyrode |
| אמבטיה תרמוסטטית בהתאמה אישית | MappingLab, בריטניה | TBC-2.1 | לשמירה על טמפרטורת תמיסת |
| הזלוףדימתיל סולפוקסיד (DMSO) | סיגמא-אולדריץ' | (RNBT7442) | ממס לצבעים |
| מלקחיים Dumont | מפעל ציוד רפואי של שנחאי מכשירים רפואיים ושות', בע"מ, שנחאי, סין | YAF030 | |
| תוכנת ElectroMap | אוניברסיטת ברמינגהם | N/A | כימות פרמטרים חשמליים |
| מצלמת EMCCD | Evolve 512 דלתא, פוטומטריקה, טוסון, אריזונה, ארצות הברית | A18G150001 | לרכוש תמונות עבור אותות אופטיים |
| ET525/36 מסנן מצופה מקרטע | Chroma Technology | 319106 | מסנן עירור |
| גלוקוז | סיגמא-אולדריץ', סנט לואיס, מיזורי, ארצות הברית | SLBT4811V | לפתרון של Tyrode |
| הפרין נתרן | צ'נגדו Haitong Pharmaceutical Co., Ltd., צ'נגדו, סין | (H51021209) | למניעת קרישי דם בעורק הכלילי |
| מלקחיים איריס | מפעל ציוד רפואי של שנחאי מכשירים רפואיים ושות', בע"מ, שנחאי, סין | YAA010 | |
| איזופרוטרנול | MedChemExpress, קרלסבד, קליפורניה, ארצות הברית | HY-B0468/CS-2582 | |
| KCl | Sigma-Aldrich, סנט לואיס, מיזורי, ארצות הברית | SLBS5003 | לפתרון של Tyrode |
| MacroLED | Cairn Research, Faversham, בריטניה | 7355/7356 | אור העירור של בדיקות פלואורסצנטיות |
| מקור אור MacroLED | Cairn Research, Faversham, בריטניה | 7352 | שלוט בנורות הלד |
| מספריים Mayo | מפעל ציוד רפואי של Shanghai Medical Instruments Co., Ltd., שנחאי, סין | YBC010 | |
| MetaMorph Molecular Devices | /A | דגימת אותות אופטיים | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich, סנט לואיס, מיזורי, ארצות הברית | BCBS6841V | לפתרון של Tyrode |
| MICRO3-1401 | Cambridge Electronic Design limited, בריטניה | M5337 | חבר את הסטימולטור החשמלי ותוכנת Spike2 |
| MyoPacer EP ממריץ שדה | Ion Optix Co, Milton, MA, ארצות הברית | S006152 | ממריץ חשמלי |
| NaCl | Sigma-Aldrich, סנט לואיס, מיזורי, ארצות הברית | SLBS2340V | לתמיסה של טירוד |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich, סנט לואיס, מיזורי, ארצות הברית | BCBW9042 | עבור הפתרון של Tyrode |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich, סנט לואיס, מיזורי, ארצות הברית | SLBX3605 | עבור הפתרון של Tyrode |
| NeuroLog System | Digitimer | NL905-229 | עבור מגבר א.ק.ג |
| OmapScope5 | MappingLab, בריטניה | N/A | סידן אלטרננים ו ניתוח הפרעות קצב |
| מספריים | Huaian Teshen Medical Instruments Co., Ltd., ג'יאנג סו, סין | T4-3904 | |
| OptoSplit | Cairn Research, Faversham, בריטניה | 6970 | פיצול נורית הפליטה לזיהוי Ca2+ ו-Vm בו זמנית |
| משאבה פריסטלית | Longer Precision Pump Co., Ltd., Baoding, סין, | BT100-2J | כדי לשאוב את התמיסה |
| צלחת פטרי | BIOFIL | TCD010060 | |
| Pluronic F127 | Invitrogen, קרלסבד, קליפורניה, ארצות הברית | 1899021 | כדי לשפר את הטעינה עם Rhod2AM |
| RH237 | Thermo Fisher Scientifific, Waltham, MA, ארצות הברית | 1971387 | צבע רגיש למתח |
| Rhod-2 AM | Invitrogen, Carlsbad, CA, ארצות הברית | 1890519 | מחוון סידן |
| צינור סיליקה ג'ל | ארוך יותר דיוק משאבת ושות', בע"מ, Baoding, סין, | 96402-16 | התחבר עם המשאבה הפריסטלטית |
| תפר משי | Yuankang Medical Instrument Co., Ltd., יאנגג'ואו, סין | 20172650032 | כדי לתקן את אבי העורקים |
| Spike2 | קיימברידג' עיצוב אלקטרוני בע"מ, בריטניה | N/A | כדי להקליט ולנתח נתוני א.ק.ג |
| גירוי אלקטרודה | מיפוי מעבדה, בריטניה | SE1600-35-2020 | |
| T510lpxr | Chroma Technology | 312461 | למקור אור |
| T565lpxr | Chroma Technology | 321343 | למקור אור |
מקורות
- Priori, S. G., Chen, S. R. Inherited dysfunction of sarcoplasmic reticulum Ca2+ handling and arrhythmogenesis. Circulation Research. 108 (7), 871-883 (2011).
- Goddard, C. A., et al. P....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
תגיות
