כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט להשתלת אורגנואידים בכליות בחלל הצלומי של עוברי תרנגולות. שיטה זו גורמת לכלי דם ולהבשלה משופרת של האורגנואידים תוך 8 ימים וניתן להשתמש בה כדי ללמוד תהליכים אלה בצורה יעילה.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
וסקולריזציה יעילה של אורגנואידים בכליות באמצעות השתלה אינטרסלומית בעוברי תרנגולות
במאמר זה
סיכום
תקציר
אורגנואידים בכליות שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם מכילים מבנים דמויי נפרון הדומים במידה מסוימת לאלה שבכליה הבוגרת. למרבה הצער, היישום הקליני שלהם נפגע על ידי היעדר כלי דם תפקודי וכתוצאה מכך הבשלה מוגבלת במבחנה. השתלת אורגנואידים בכליות בחלל הצלומי של עוברי תרנגולות גורמת לכלי דם מחוררים, כולל היווצרות נימים גלומרולריים, ומשפרת את התבגרותם. טכניקה זו יעילה מאוד, ומאפשרת השתלה וניתוח של מספר רב של אורגנואידים. מאמר זה מתאר פרוטוקול מפורט להשתלה אטרקלומית של אורגנואידים בכליות בעוברי תרנגולות, ואחריו הזרקת לקטין מסומן פלואורסצנטית כדי להכתים את כלי הדם המחוררים, ואיסוף אורגנואידים מושתלים לניתוח הדמיה. שיטה זו יכולה לשמש כדי לגרום ולחקור כלי דם אורגנואידים והתבגרות כדי למצוא רמזים לשיפור תהליכים אלה במבחנה ולשפר מודלים של מחלות.
מבוא
אורגנואידים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (hiPSC) הוכחו כבעלי פוטנציאל למחקרים התפתחותיים 1,2,3,4, בדיקת רעילות 5,6 ומידול מחלות5,7,8,9,10,11,12,13. עם זאת, תחולתם למטרות השתלה קלינית אלה ובסופו ש....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
בהתאם לחוק ההולנדי, לא נדרש אישור של הוועדה לרווחת בעלי חיים למחקר זה.
1. הכנת אורגנואידים שמקורם בכליות hiPSC להשתלה
- להבדיל hiPSCs לאורגנואידים בכליות באמצעות הפרוטוקול שפותח על ידי Takasato et al.4,18,31. תרבית את האורגנואידים לפי פרוטוקול זה על תוספות תרבית תאי פוליאסטר עם נקבוביות 0.4 מיקרומטר (תוספות תרבית תאים) עד ליום 7 + 12 להתמיינות. כל תוספת תרבית תאים תכיל שלושה אורגנואידים.
- הסר את האורגנואידים מעלון תרבית התא.
- לעשות חור באמצע הקרום של תרבית התא להכניס עם זוג מלקחיים ניתוח. בעזרת מספריים מנתחים....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
השיטה וציר הזמן להבחנה של hiPSCs לאורגנואידים בכליות, דגירה של ביצי תרנגולות מופרות, השתלת אורגנואידים בכליות, הזרקת LCA ואיסוף האורגנואידים מסוכמים באיור 1A. חשוב לתאם את עיתוי התמיינות האורגנואידים והדגירה של ביצי תרנגולת, ולהתחיל את ההתמיינות 15 יום לפני הדגירה. הפעולות ביום 0, 3, 4 ו-12 של הדגירה מודגמות על ידי תמונות מתחת לציר הזמן. אורגנואידים מושתלים ביום 7 + 12 של התמיינות ליום 4 (HH 23-24) עוברי תרנגולות. LCA מוזרק למערכת הוורידית של העובר 8 ימים לאחר ההשתלה כדי להכתים את כלי הדם המ.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
בכתב יד זה מודגם פרוטוקול להשתלה אינטרטלומית של אורגנואידים שמקורם ב-hiPSC בעוברי תרנגולות. עם ההשתלה, אורגנואידים הם כלי דם על ידי כלי דם מחוררים המורכבים משילוב של ECs שמקורם באורגנואידים אנושיים ומקורם בעוף. אלה מפוזרים ברחבי האורגנואיד ופולשים למבנים הגלומרולריים, ומאפשרים אינטראקציה בין ECs ופודוציטים. בעבר הוכח כי זה מוביל להבשלה משופרת של מבנים גלומרולריים וצינוריים אורגנואידים28. ההשתלה יעילה מאוד, אורכת ~5 דקות לעובר, והתחזוקה היחידה שהעוברים דורשים היא מילוי קבוע של אגן המים באינקובטור. .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.
תודות
אנו מודים לג'ורג' גאלריס (LUMC, ליידן, הולנד) על עזרתו בהזרקת עובר תרנגולת. אנו מודים על תמיכתם של ססקיה ואן דר וול-מאס (המחלקה לאנטומיה ואמבריולוגיה, LUMC, ליידן, הולנד), קוני ואן מינסטרן (המחלקה לאנטומיה ואמבריולוגיה, LUMC, ליידן, הולנד), מאנון זורמונד (LUMC, ליידן, הולנד) ואנמארי דה גראף (LUMC, ליידן, הולנד). M. Koning נתמך על ידי 'Nephrosearch Stichting tot steun van het wetenschappelijk onderzoek van de afdeling Nierziekten van het LUMC'. עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי קרן אוניברסיטת ליידן "Prof. Jaap de Graeff-Lingling Wiyadhanrma Fund" GWF2019-02. עבודה זו נתמכת על ידי השותפים של רפואה רגנרטיבית חוצה גבולות (RegMedXB) ובריאות הולנד, מגזר עליון, מדעי החיים ובריאות.....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 0.2 ומיקרו; מסנן m: מסנן מזרק Whatman Puradisc 30 0.2 & מיקרו; מ | Whatman | 10462200 | |
| כלי תחתית זכוכית 35 מ"מ | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | |
| מכלולי צינורות שואב עבור פיפטות מיקרו-נימיות מכוילות | Sigma-Aldrich | A5177-5EA | מכיל צינורות סיליקון, חתיכת פה ומחבר |
| מיקרוסקופ קונפוקלי: לייזר אור לבן Leica מיקרוסקופ קונפוקלי | Leica | TCS SP8 | |
| ניתוח מלקחיים, סוג פשוט. טיטניום, מעוקל, עם קצוות חדים עדינים | Hammacher Karl | HAMMHTC091-10 | |
| מלקחיים לניתוח, סוג פשוט. טיטניום, ישר, עם קצוות חדים עדינים | Hammacher Karl | HAMMHTC090-11 | |
| מיקרוסקופ ניתוח | Wild Heerbrugg | 355110 | |
| מספריים לניתוח, מעוקלים, מיוחדים ל-OP, חדים/חדים במיוחד | Hammacher Karl | HAMMHSB391-10 | |
| סרום חמור | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| חמור-אלפא;-עכבר Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-212-02 | דילול 1:500 |
| חמור-אלפא;-כבשים Alexa Fluor 647 | ThermoFisher Scientific | A-21448 | דילול 1:500 |
| סכיני גילוח מפלדת אל-חלד פיפיות | Electron Microsopy Sciences | 72000 | |
| DPBS, סידן, מגנזיום (DPBS-/-) | ThermoFisher Scientific | 14040133 | |
| DPBS, ללא סידן, ללא מגנזיום (DPBS+/+) | ThermoFisher Scientific | 14190094 | |
| קרטוני ביצים או מחזיקי ביצים בהתאמה אישית | NA | NA | |
| ביצי רגל לבנות מופרות (Gallus gallus domesticus) | Drost Loosdrecht B.V. | ||
| Incubator | Elbanton BV | ET-3 משולב | |
| לוטוס טטרגונולבוס לקטין (LTL) | מעבדות וקטור | B-1325 | דילול 1:300 |
| מספריים מיקרו, ישרים, חדים/חדים, אורך חיתוך 10 מ"מ | Hammacher Karl | HAMMHSB500-09 | |
| מיקרו-נימים: נימי זכוכית דקים 1.5 מ"מ, נימה | World Precision Instruments | TW150F-3 | |
| חולץ מיקרופיפטה | Sutter Instrument Company | דגם P-97 | אנו משתמשים בהגדרות הבאות: חום 533, משיכה 60, מהירות 150, זמן 200 |
| מחזיק מיקרואזמל: מחזיק להב וסיכות Castroviejo, 12 ס"מ, ידית עגולה, לסתות חרוטיות 10 מ"מ. | מדיום הרכבה Euronexia | L-120 | |
| תושבת זהב אנטי-דהייה פרולונג | ThermoFisher Scientific | P36930 | |
| דיסקטור 18 ס"מ | רדה | 41146-18 | |
| פרפילם | הית'רו סיינטיפיק | HS234526B | |
| פניצילין-סטרפטומיצין 5,000 יח'/מ"ל | ThermoFisher Scientific | 15070063 | |
| כף מחוררת | צלחת פטרי Euronexia | S-20-P | |
| 60 x 15 מ"מ | CELLSTAR | 628160 | |
| פיפטות העברת פלסטיק | ThermoFisher Scientific | PP89SB | |
| עכבר מטוהר נוגדן CD31 אנטי אנושי | BD Biosciences | 555444 | דילול 1:100 |
| רודמין עם התווית Lens Culinaris Agglutinin (LCA) | Vector Laboratories | RL-1042 | מוצר זה הופסק לאחרונה. Vectorlabs עדיין מייצרת Dylight 649 עם תווית LCA (DL-1048-1) ופלואורסצאין עם תווית LCA (FL-1041-5) |
| נוגדן NPHS1 אנטי אנושי לכבשים | R& מערכות D | AF4269 | 1:100 |
| מחטים היפודרמיות סטריליות, 19 גרם | BD מיקרולנס | 301500 | |
| סטרפטווידין Alexa Fluor 405 | ThermoFisher Scientific | S32351 | דילול 1:200 |
| מזרק 5 מ"ל | BD אמרלד | 307731 | |
| סרט שקוף | Tesa | 4124 | זמין ברוב חנויות החומרה |
| Triton X | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| חוט טונגסטן, קוטר 0.25 מ"מ | תרמו-פישר סיינטיפיק | 010404.H2 |
מקורות
- Taguchi, A., et al. Redefining the in vivo origin of metanephric nephron progenitors enables generation of complex kidney structures from pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 14 (1), 53-67 (2014).
- Morizane, R., et al.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
