מאמר שיטה

וסקולריזציה יעילה של אורגנואידים בכליות באמצעות השתלה אינטרסלומית בעוברי תרנגולות

DOI:

10.3791/65090

⸱

17 בפברואר 2023

 ,  ,  ,  , 
1Department of Internal Medicine - Nephrology, Leiden University Medical Center, 2Einthoven Laboratory of Vascular and Regenerative Medicine, Leiden University Medical Center, 3IBPS, CNRS UMR7622, Developmental Biology Laboratory, Sorbonne Université, 4The Novo Nordisk Foundation Center for Stem Cell Medicine (reNEW), Leiden University Medical Center

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט להשתלת אורגנואידים בכליות בחלל הצלומי של עוברי תרנגולות. שיטה זו גורמת לכלי דם ולהבשלה משופרת של האורגנואידים תוך 8 ימים וניתן להשתמש בה כדי ללמוד תהליכים אלה בצורה יעילה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אורגנואידים בכליות שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם מכילים מבנים דמויי נפרון הדומים במידה מסוימת לאלה שבכליה הבוגרת. למרבה הצער, היישום הקליני שלהם נפגע על ידי היעדר כלי דם תפקודי וכתוצאה מכך הבשלה מוגבלת במבחנה. השתלת אורגנואידים בכליות בחלל הצלומי של עוברי תרנגולות גורמת לכלי דם מחוררים, כולל היווצרות נימים גלומרולריים, ומשפרת את התבגרותם. טכניקה זו יעילה מאוד, ומאפשרת השתלה וניתוח של מספר רב של אורגנואידים. מאמר זה מתאר פרוטוקול מפורט להשתלה אטרקלומית של אורגנואידים בכליות בעוברי תרנגולות, ואחריו הזרקת לקטין מסומן פלואורסצנטית כדי להכתים את כלי הדם המחוררים, ואיסוף אורגנואידים מושתלים לניתוח הדמיה. שיטה זו יכולה לשמש כדי לגרום ולחקור כלי דם אורגנואידים והתבגרות כדי למצוא רמזים לשיפור תהליכים אלה במבחנה ולשפר מודלים של מחלות.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אורגנואידים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (hiPSC) הוכחו כבעלי פוטנציאל למחקרים התפתחותיים 1,2,3,4, בדיקת רעילות 5,6 ומידול מחלות5,7,8,9,10,11,12,13. עם זאת, תחולתם למטרות השתלה קלינית אלה ובסופו של דבר מוגבלת על ידי היעדר רשת כלי דם. במהלך התפתחות הכליות העובריות, פודוציטים, תאים מזנגיאליים ותאי אנדותל וסקולריים (ECs) מתקשרים כדי ליצור את המבנה המורכב של הגלומרולוס. ללא אינטראקציה זו, מחסום הסינון הגלומרולרי, המורכב מפודוציטים, קרום המרתף הגלומרולרי (GBM) ו- ECs, אינו יכול להתפתח כראוי14,15,16. למרות שאורגנואידים במבחנה בכליות מכילים כמה ECs, אלה אינם מצליחים ליצור רשת כלי דם תקינה ופוחתים עם הזמן17. לכן אין זה מפתיע שהאורגנואידים נותרים לא בשלים. השתלה בעכברים גורמת לכלי דם ולהבשלה של אורגנואידי הכליה 18,19,20,21. למרבה הצער, זהו תהליך עתיר עבודה שאינו מתאים לניתוח של מספר רב של אורגנואידים.

עוברי תרנגולות שימשו לחקר כלי דם והתפתחות במשך יותר ממאה שנה22. הם נגישים בקלות, דורשים תחזוקה נמוכה, חסרים מערכת חיסונית מתפקדת במלואה, ויכולים להתפתח באופן תקין לאחר פתיחת קליפת הביצה 23,24,25,26. השתלת אורגנואידים על הממברנה הכוריואלנטית שלהם (CAM) הוכחה כמובילה לכלי דם27. עם זאת, משך ההשתלה על CAM, כמו גם את רמת ההבשלה של השתל, מוגבלים על ידי היווצרות CAM, אשר לוקח עד יום 7 העוברי כדי להשלים. לכן, פותחה לאחרונה שיטה לכלי דם יעילים ולהבשיל אורגנואידים בכליה באמצעות השתלה אטרסלומית בעוברי תרנגולות28. החלל הצלומי של עוברי תרנגולות ידוע מאז שנות השלושים כסביבה נוחה להתמיינות רקמות עובריות29,30. ניתן לגשת אליו בשלב מוקדם של ההתפתחות העוברית ומאפשר הרחבה בלתי מוגבלת יחסית של השתל לכל הכיוונים.

מאמר זה מתאר פרוטוקול להשתלת אורגנואידים שמקורם בכליות hiPSC בחלל הצלומי של עוברי תרנגולות ביום 4. שיטה זו גורמת לכלי דם ולהבשלה משופרת של האורגנואידים תוך 8 ימים. הזרקת עדשה בעלת תווית פלואורסצנטית culinaris agglutinin (LCA) לפני הקרבת העוברים מאפשרת הדמיה של כלי דם מחוררים בתוך האורגנואידים באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בהתאם לחוק ההולנדי, לא נדרש אישור של הוועדה לרווחת בעלי חיים למחקר זה.

1. הכנת אורגנואידים שמקורם בכליות hiPSC להשתלה

  1. להבדיל hiPSCs לאורגנואידים בכליות באמצעות הפרוטוקול שפותח על ידי Takasato et al.4,18,31. תרבית את האורגנואידים לפי פרוטוקול זה על תוספות תרבית תאי פוליאסטר עם נקבוביות 0.4 מיקרומטר (תוספות תרבית תאים) עד ליום 7 + 12 להתמיינות. כל תוספת תרבית תאים תכיל שלושה אורגנואידים.
  2. הסר את האורגנואידים מעלון תרבית התא.
    1. לעשות חור באמצע הקרום של תרבית התא להכניס עם זוג מלקחיים ניתוח. בעזרת מספריים מנתחים, לבצע שלושה חתכים בקרום מן החור באמצע לקצה של תרבית התא להחדיר, לחתוך בין אורגנואידים. התוצאה תהיה שלוש חתיכות של קרום, שלכל אחת מהן מחובר אורגנואיד אחד, שעדיין מחוברות לתרבית התא המוחדרת בקצה החיצוני שלהן.
    2. אחזו באחת מפיסות הקרום הקרובות לקצהו החיצוני בעזרת זוג מלקחיים וקרעו אותה מתרבית התא. מניחים את חתיכת הממברנה עם האורגנואיד המחובר בצלחת פטרי. הוסף כמה טיפות של מלח חוצץ פוספט של Dulbecco (DPBS) ללא סידן ומגנזיום (DPBS-/-) לאורגנואיד כדי למנוע התייבשות. חזור על הפעולה עבור שני האורגנואידים האחרים.
  3. חתכו את האורגנואידים על ידי החזקת הממברנה שלהם במקומה עם מלקחיים וחתכו אותם לשניים עם סכין גילוח מפלדת אל-חלד בעלת קצה כפול (אורגנואיד שלם גדול מכדי שהסלום יוכל להכיל בשלב זה של ההתפתחות). דוחפים בעדינות את שני חצאי האורגנואידים מהממברנה עם דיסקטור דורה. יש להשליך את הממברנה ולהשאיר את האורגנואידים ב-DPBS-/- עד להשתלה.
    הערה: הכינו עד שלושה אורגנואידים בכל פעם להשתלה כדי למנוע לחץ על האורגנואידים לפני ההשתלה. באופן אידיאלי, אדם אחד מכין את האורגנואידים בעוד אחר מבצע את ההשתלה.

2. הכנת עוברי תרנגולות להשתלה

  1. לדגור על ביצי לגורן לבנות מופרות. התחל את הדגירה של הביציות ביום התמיינות אורגנואידים בכליות יום 7 + 8 כדי להבטיח את העיתוי הנכון של ההשתלה.
    1. הניחו את ביצי הרגל הלבנות המופרות (Gallus domesticus) בצורה אופקית על מחזיק (איור 1A; יום 0), סימון אמצע הצד הפונה כלפי מעלה בעיפרון.
      הערה: מחזיקי פלסטיק בהתאמה אישית או קרטוני ביצים יכולים לשמש כמחזיקים כדי לדגור על הביצים.
    2. הניחו את המחזיק עם הביצים באינקובטור לח בטמפרטורה של 38 ± 1 מעלות צלזיוס (איור 1A; יום 0).
    3. דוגרים על הביצים במשך 3 ימים, תוך שמירה על אגן המים באינקובטור מלא.
  2. צרו חלון בקליפת הביצה ביום השלישי של הדגירה.
    1. ביום השלישי של הדגירה, מניחים חתיכה קטנה (~ 1 ס"מ x 0.5 ס"מ) של סרט שקוף על הקצה המחודד של הביצה (קצה קטן). צור חור קטן בקליפת הביצה באמצע הסרט השקוף על ידי הקשה עליו עם הקצה החד של זוג מספריים מנתחים.
    2. הכניסו מחט 19 גרם על מזרק 5 מ"ל לתוך החור בזווית של 45 מעלות, כדי למנוע נזק לשק החלמון, ושאפו 2-3 מ"ל אלבומן מהביצה כדי להוריד את העובר בתוך הביצית. אטמו את החור בחתיכה שנייה (~ 1 ס"מ x 0.5 ס"מ) של סרט שקוף.
    3. מניחים חתיכה גדולה (~ 5 ס"מ x 5 ס"מ) של סרט שקוף על הצד המסומן בעיפרון ופונה כלפי מעלה של הביצה. צרו חור בקליפת הביצה במרכז הסרט השקוף על-ידי הקשה עליו עם הקצה החד של זוג מספריים מנתחים (איור 1A; יום 3).
    4. מתחילים מהחור הזה, חותכים חלון עגול קטן בקליפת הביצה באמצעות מספריים מנתחים מעוקלים. הסתכלו דרך החלון הזה כדי לאתר את העובר, ואז הגדילו את החלון כדי למטב את הגישה לעובר (איור 1A; יום 3).
    5. הסר חתיכות גדולות של קליפת ביצה שאולי נפלו על גבי העובר באמצעות מלקחיים. הסר חתיכות קטנות יותר על ידי הנחת כמה טיפות של DPBS עם סידן ומגנזיום (DPBS+/+) על העובר עם פיפטה העברת פלסטיק, ולאחר מכן שאיפה DPBS+/+ עם קליפת הביצה לתוך פיפטה.
    6. הוסף שלוש טיפות של DPBS+/+ בתוספת 0.5% פניצילין/סטרפטומיצין לביצה באמצעות פיפטה להעברת פלסטיק.
    7. אטמו בזהירות את החלון עם חתיכה גדולה (~ 5 ס"מ x 5 ס"מ) של סרט שקוף לפני החזרת הביצית לאינקובטור עד ליום 4 של הדגירה, כאשר העובר נמצא בשלב המבורגר-המילטון 23-24 (HH 23-24)32.
      הערה: איטום החלון חשוב מאוד כדי למנוע התייבשות ומוות של העובר.
    8. בדוק את העוברים מדי יום עבור קיימא על ידי הסתכלות עליהם דרך הסרט (לא להסיר את הסרט כדי למנוע התייבשות). במהלך הימים הראשונים של הדגירה, צבע חלמון הביצה משתנה מצהוב בהיר לצהוב מט עם מות העובר. השליכו עוברים שנפטרו.
    9. שמור על אגן המים באינקובטור מלא.

3. השתלה Intracelomic ביום 4 של הדגירה

  1. קבלת גישה לחלל הצלומי
    1. גזור את הקלטת מהחלון עם מספריים ניתוח מעוקל.
    2. מניחים את הביצה תחת מיקרוסקופ נתיחה על מחזיק גומי או קרטון ביצים.
    3. עובר התרנגולת נמצא כעת ב-HH 23-24 ושוכב על צדו השמאלי, כשצדו הימני פונה אל הצופה (איור 1A; יום 4). אתר את הכנף הימנית ואת ניצן הרגל של העובר, כמו celom יהיה נגיש בין שני ניצני הגפיים האלה. באזור שבין הכנף הימנית לניצן הרגל, יוצרים פתח רציף בקרום הוויטליין, בכוריון ובמי השפיר, על ידי החזקתם בשני זוגות מלקחיים מנתחים ומשיכה עדינה שלהם לכיוונים מנוגדים.
      הערה: קרום ויטלין הוא הקרום הראשון שנתקלים בו לאחר פתיחת הביצית, ובמקרים מסוימים, כבר ניזוק לאחר ביצוע החלון ביום השלישי. אם מסובבים את העובר, שוכבים על צדו הימני כשצדו השמאלי פונה אל הצופה (איור 1A; יום 4), יש צורך להפוך אותו כדי לאפשר השתלה. כדי לעשות זאת, לעשות פתח גדול בקרום vitelline ו chorion, ולאחר מכן בזהירות להפוך את העובר סביב באמצעות מלקחיים.
    4. בדקו אם יש גישה ללא הפרעה לחלל הצלומי: אחזו בעדינות בקצה דופן הגוף שבין הכנף לניצן הגפה בעזרת זוג מלקחיים מנתחים ומשכו אותו מעט לכיוון הצופה. החלל הצלומי חייב להיות גלוי בבירור. הכניסו בזהירות מכשיר קהה אך דק (למשל, חוט טונגסטן קהה במחזיק מיקרואזמל) לתוך חלל הצלומי.
      הערה: אם החדרת המכשיר הקהה לחלל הצלומי אינה אפשרית, פירוש הדבר שאחד או יותר מהקרומים לא נפתחו כראוי.
  2. השתלת
    1. מניחים חצי אורגנואיד בתוך הביצה על גבי האלנטואי באמצעות דיסקטור דורה.
    2. בעזרת מלקחיים מנתחים, אחזו בזהירות בקצה דופן הגוף ומשכו אותו מעט לכיוון הצופה כדי להפוך את הפתח לסלום לגלוי.
      הערה: יש להימנע מפגיעה בכלי הדם בדופן הגוף.
    3. העבירו בעדינות את האורגנואיד לכיוון ודרך הפתח בדופן הגוף לתוך הסלום בעזרת חוט טונגסטן קהה במחזיק מיקרו-אזמל. דחפו את האורגנואיד מעט בצורה גולגולתית כדי לתקוע אותו בתוך הצלום. כעת הוא נראה ממש מאחורי ניצן הכנף (איור 1A; יום 4).
    4. הוסיפו שלוש טיפות של DPBS+/+ לביצה באמצעות פיפטת העברה מפלסטיק.
    5. אטמו בזהירות את החלון עם חתיכה גדולה (~ 5 ס"מ x 5 ס"מ) של סרט שקוף לפני החזרת הביצה לאינקובטור עד ליום 12 של הדגירה (8 ימים לאחר ההשתלה).
    6. המשך לבדוק את העוברים מדי יום לקיום על ידי התבוננות בהם דרך הקלטת (אל תסיר את הסרט כדי למנוע התייבשות). השליכו עוברים שנפטרו.
      הערה: ככל שהעוברים והקרומים הכוריאואלנטיים שלהם גדלים, הם הופכים גלויים יותר דרך הקלטת. חוסר תנועה של העובר וכלי דם שקרסו או דלילים הם סימן למוות של העובר.
    7. בדוק את אגן המים באינקובטור מדי יום ושמור אותו מלא.

4. הזרקה של לקטין מסומן פלואורסצנטית

  1. הכנה להזרקה
    1. הפוך מחטי מיקרו-הזרקה מזכוכית על ידי משיכת מיקרו-נימי זכוכית במושך מיקרופיפטה עם ההגדרות הבאות: חום 533, משיכה 60, מהירות 150, זמן 200. תוך כדי התבוננות דרך המיקרוסקופ המנתח, שברו בזהירות את קצות מחטי המיקרו-הזרקה באמצעות מלקחיים מנתחים ליצירת פתח.
      הערה: ההגדרות הנדרשות עבור מושך מיקרופיפטה עשויות להשתנות בהתאם להתקן.
    2. להרכיב את מערכת ההזרקה. קחו שתי חתיכות של צינורות סיליקון בקוטר 38 ס"מ וחברו אותן זו לזו על ידי הצבת מסנן של 0.2 מיקרומטר ביניהן. הכנס פיה לקצה הצינור המחובר לשקע המסנן (צינור סיליקון 1), ומחבר לקצה הצינור המחובר לכניסת המסנן (צינור סיליקון 2). לבסוף, הכניסו את מחט המיקרו-הזרקה למחבר (איור 1B).
    3. לדלל את העדשה culinaris agglutinin (LCA) עם תווית פלואורסצנטית עם DPBS-/ - לריכוז של 2.5 מ"ג mL-1 בצינור 0.5 מ"ל ולהסתובב למטה במשך ~ 30 שניות במיקרוצנטריפוגה כדי להזיז את האגרגטים לתחתית הצינור.
    4. פיפטה 20 μL של LCA על חתיכת parafilm.
    5. שאפו את 20 μL של LCA מן parafilm לתוך מחט microcapillary של מערכת ההזרקה התאספו.
  2. זריקה
    1. גזור את הקלטת מהחלון עם מספריים ניתוח מעוקל. מניחים את הביצה תחת מיקרוסקופ ניתוח במחזיק גומי.
    2. העריכו את כלי הדם ואתרו את הוורידים, שניתן להבדיל בינם לבין העורקים על-ידי צבעם האדום הבהיר מעט יותר (איור 1A; יום 12). כדי לשפר את הגישה לכלי הדם, הגדל בזהירות את החלון על ידי חיתוך עם מספריים ניתוח מעוקל. בחר וריד להזרקה על סמך נגישות וגודל.
    3. הכנס את קצה המחט המיקרוקפילרית לווריד שנבחר בזווית של 0°-20º. ודא שהמחט נמצאת בווריד על ידי הזזת הקצה בעדינות מצד לצד. נשפו בעדינות ובהתמדה לתוך מערכת ההזרקה כדי להזריק את ה-LCA (איור 1A; יום 12).
      הערה: אם המחט בווריד נמצאת במיקום הנכון, היא צריכה להישאר בגבולות הווריד.
    4. מחזירים את הביצה לאינקובטור למשך 10 דקות כדי לאפשר ל-LCA לזרום.
      הערה: אין צורך לאטום את הביצה עם סרט במהלך תקופה זו.

5. איסוף אורגנואידים מושתלים ביום ה-12 לדגירה

  1. הקרבת עובר התרנגולת
    1. מניחים את הביצה במחזיק גומי על הספסל. גזור את הקלטת מהחלון עם מספריים ניתוח מעוקל. לאחר מכן, חותכים דרך הקרומים המקיפים את העובר עם מספריים מנתחים מעוקלים.
      הערה: מיקרוסקופ מנתח אינו נדרש לשלב זה.
    2. גרפו את העובר מהביצית עם כף מחוררת ומיד ערפו את ראשו של העובר באמצעות מספריים. מניחים את גוף העובר בצלוחית פטרי מתחת למיקרוסקופ הדיסקציה.
  2. איתור ואיסוף אורגנואידים
    1. הניחו את העובר על גבו בצלוחית הפטרי ופרשו את איבריו.
    2. פתח בזהירות את דופן הבטן של העובר לאורך ציר האורך באמצעות מלקחיים.
    3. אתר את האורגנואיד בתוך העובר. האורגנואיד נקשר לרוב לאונה הימנית של הכבד, בקצה הקאודלי או ממש מתחת לכלוב הצלעות (איור 1A; יום 12). לכן מומלץ להתחיל בחיפוש במקומות אלה.
    4. ברגע שהאורגנואיד מאותר, הוציאו אותו מהעובר על ידי חיתוך סביבו עם מספריים מיקרו. הניחו את האורגנואיד ואת רקמת העוף המחוברת אליו באופן בלתי נמנע בצלוחית פטרי מתחת למיקרוסקופ המנתח. הסר כמה שיותר רקמת עוף עם סכין גילוח מפלדת אל-חלד בעלת קצה כפול.
    5. עבד את האורגנואיד בהתאם לניתוח הרצוי.

6. צביעה אימונופלואורסצנטית בהר שלם

  1. מניחים אורגנואיד מושתל בצלחת של 24 בארות ומקבעים ב-500 מיקרוליטר של 4% פרפורמלדהיד (PFA) ב-4°C למשך 24 שעות. לשטוף 3x עם DPBS-/-.
  2. חדרו וחסמו את האורגנואיד ב-300 מיקרוליטר של תמיסה חוסמת (0.3% טריטון-X ב-DPBS-/- המכיל 10% נסיוב חמורים) למשך שעתיים בטמפרטורת החדר.
  3. הכינו את תערובת הנוגדנים הראשונית: עבור אורגנואיד אחד, לדלל נוגדנים ראשוניים NPHS1 (כבש-α-אדם, דילול של 1:100), CD31 (עכבר-α-אדם, דילול של 1:100), ו-LTL (ביוטין-מצומד, דילול של 1:300) ב-300 מיקרוליטר של תמיסה חוסמת. מוסיפים את תערובת הנוגדנים לאורגנואיד ודגרים במשך 72 שעות ב-4°C.
  4. יש לשטוף 3x עם 0.3% TritonX ב-DPBS-/-.
  5. הכינו את תערובת הנוגדנים המשנית: עבור אורגנואיד אחד, לדלל נוגדנים משניים חמור-α-כבש Alexa Fluor 647 (דילול של 1:500), חמור-α-עכבר Alexa Fluor 488 (דילול של 1:500), ו streptavidin Alexa Fluor 405 (דילול של 1:200) ב 300 μL של פתרון חוסם. מוסיפים את תערובת הנוגדנים המשנית לאורגנואיד ודגרים במשך 2-4 שעות בטמפרטורת החדר. יש לכסות ברדיד אלומיניום כדי למנוע חשיפה של הנוגדנים המשניים לאור.
  6. לשטוף 3x עם DPBS-/-.
  7. הטמע את האורגנואיד ב~30 μL של אמצעי הרכבה בצלחת תחתית זכוכית 35 מ"מ ואפשר להתייבש לילה בטמפרטורת החדר, מכוסה ברדיד אלומיניום. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C.
  8. תמונה באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השיטה וציר הזמן להבחנה של hiPSCs לאורגנואידים בכליות, דגירה של ביצי תרנגולות מופרות, השתלת אורגנואידים בכליות, הזרקת LCA ואיסוף האורגנואידים מסוכמים באיור 1A. חשוב לתאם את עיתוי התמיינות האורגנואידים והדגירה של ביצי תרנגולת, ולהתחיל את ההתמיינות 15 יום לפני הדגירה. הפעולות ביום 0, 3, 4 ו-12 של הדגירה מודגמות על ידי תמונות מתחת לציר הזמן. אורגנואידים מושתלים ביום 7 + 12 של התמיינות ליום 4 (HH 23-24) עוברי תרנגולות. LCA מוזרק למערכת הוורידית של העובר 8 ימים לאחר ההשתלה כדי להכתים את כלי הדם המ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בכתב יד זה מודגם פרוטוקול להשתלה אינטרטלומית של אורגנואידים שמקורם ב-hiPSC בעוברי תרנגולות. עם ההשתלה, אורגנואידים הם כלי דם על ידי כלי דם מחוררים המורכבים משילוב של ECs שמקורם באורגנואידים אנושיים ומקורם בעוף. אלה מפוזרים ברחבי האורגנואיד ופולשים למבנים הגלומרולריים, ומאפשרים אינטראקציה בין ECs ופודוציטים. בעבר הוכח כי זה מוביל להבשלה משופרת של מבנים גלומרולריים וצינוריים אורגנואידים28. ההשתלה יעילה מאוד, אורכת ~5 דקות לעובר, והתחזוקה היחידה שהעוברים דורשים היא מילוי קבוע של אגן המים באינקובטור. ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים לג'ורג' גאלריס (LUMC, ליידן, הולנד) על עזרתו בהזרקת עובר תרנגולת. אנו מודים על תמיכתם של ססקיה ואן דר וול-מאס (המחלקה לאנטומיה ואמבריולוגיה, LUMC, ליידן, הולנד), קוני ואן מינסטרן (המחלקה לאנטומיה ואמבריולוגיה, LUMC, ליידן, הולנד), מאנון זורמונד (LUMC, ליידן, הולנד) ואנמארי דה גראף (LUMC, ליידן, הולנד). M. Koning נתמך על ידי 'Nephrosearch Stichting tot steun van het wetenschappelijk onderzoek van de afdeling Nierziekten van het LUMC'. עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי קרן אוניברסיטת ליידן "Prof. Jaap de Graeff-Lingling Wiyadhanrma Fund" GWF2019-02. עבודה זו נתמכת על ידי השותפים של רפואה רגנרטיבית חוצה גבולות (RegMedXB) ובריאות הולנד, מגזר עליון, מדעי החיים ובריאות. C.W. van den Berg ו- T.J. Rabelink נתמכים על ידי מרכז קרן נובו נורדיסק לרפואת תאי גזע (reNEW), מרכז קרן נובו נורדיסק לרפואת תאי גזע נתמך על ידי מענקי קרן נובו נורדיסק (NNF21CC0073729).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.2 ומיקרו; מסנן m: מסנן מזרק Whatman Puradisc 30 0.2 & מיקרו; מWhatman10462200
כלי תחתית זכוכית 35 מ"מ MatTek CorporationP35G-1.5-14-C
מכלולי צינורות שואב עבור פיפטות מיקרו-נימיות מכוילותSigma-AldrichA5177-5EAמכיל צינורות סיליקון, חתיכת פה ומחבר
מיקרוסקופ קונפוקלי: לייזר אור לבן Leica מיקרוסקופ קונפוקלי LeicaTCS SP8
ניתוח מלקחיים, סוג פשוט. טיטניום, מעוקל, עם קצוות חדים עדיניםHammacher KarlHAMMHTC091-10
מלקחיים לניתוח, סוג פשוט. טיטניום, ישר, עם קצוות חדים עדיניםHammacher KarlHAMMHTC090-11
מיקרוסקופ ניתוח Wild Heerbrugg355110
מספריים לניתוח, מעוקלים, מיוחדים ל-OP, חדים/חדים במיוחדHammacher KarlHAMMHSB391-10
סרום חמורSigma-AldrichD9663
חמור-אלפא;-עכבר Alexa Fluor 488ThermoFisher ScientificA-212-02דילול 1:500
חמור-אלפא;-כבשים Alexa Fluor 647ThermoFisher ScientificA-21448דילול 1:500
סכיני גילוח מפלדת אל-חלד פיפיותElectron Microsopy Sciences72000
DPBS, סידן, מגנזיום (DPBS-/-)ThermoFisher Scientific14040133
DPBS, ללא סידן, ללא מגנזיום (DPBS+/+)ThermoFisher Scientific14190094
קרטוני ביצים או מחזיקי ביצים בהתאמה אישית NANA
ביצי רגל לבנות מופרות (Gallus gallus domesticus) Drost Loosdrecht B.V.
IncubatorElbanton BVET-3 משולב
לוטוס טטרגונולבוס לקטין (LTL)מעבדות וקטורB-1325דילול 1:300
מספריים מיקרו, ישרים, חדים/חדים, אורך חיתוך 10 מ"מHammacher KarlHAMMHSB500-09
מיקרו-נימים: נימי זכוכית דקים 1.5 מ"מ, נימהWorld Precision InstrumentsTW150F-3
חולץ מיקרופיפטהSutter Instrument Companyדגם P-97אנו משתמשים בהגדרות הבאות: חום 533, משיכה 60, מהירות 150, זמן 200
מחזיק מיקרואזמל: מחזיק להב וסיכות Castroviejo, 12 ס"מ, ידית עגולה, לסתות חרוטיות 10 מ"מ.מדיום הרכבה EuronexiaL-120
תושבת זהב אנטי-דהייה פרולונג ThermoFisher ScientificP36930
דיסקטור 18 ס"מ רדה41146-18
פרפילם הית'רו סיינטיפיקHS234526B
פניצילין-סטרפטומיצין 5,000 יח'/מ"לThermoFisher Scientific15070063
כף מחוררת צלחת פטרי EuronexiaS-20-P
60 x 15 מ"מ CELLSTAR628160
פיפטות העברת פלסטיק ThermoFisher ScientificPP89SB
עכבר מטוהר נוגדן CD31 אנטי אנושיBD Biosciences555444דילול 1:100
רודמין עם התווית Lens Culinaris Agglutinin (LCA)Vector LaboratoriesRL-1042מוצר זה הופסק לאחרונה. Vectorlabs עדיין מייצרת Dylight 649 עם תווית LCA (DL-1048-1) ופלואורסצאין עם תווית LCA (FL-1041-5)
נוגדן NPHS1 אנטי אנושי לכבשיםR& מערכות DAF42691:100
מחטים היפודרמיות סטריליות, 19 גרםBD מיקרולנס301500
סטרפטווידין Alexa Fluor 405ThermoFisher ScientificS32351דילול 1:200
מזרק 5 מ"לBD אמרלד307731
סרט שקוף Tesa4124זמין ברוב חנויות החומרה
Triton XSigma-AldrichT9284
חוט טונגסטן, קוטר 0.25 מ"מ תרמו-פישר סיינטיפיק010404.H2
NA ביוטינילציה : דילול

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Taguchi, A., et al. Redefining the in vivo origin of metanephric nephron progenitors enables generation of complex kidney structures from pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 14 (1), 53-67 (2014).
  2. Morizane, R., et al. Nephron organoids derived from human pluripotent stem cells model kidney development and injury. Nature Biotechnology. 33 (11), 1193-1200 (2015).
  3. Kim, Y. K., et al. Gene-edited human kidney organoids reveal mechanisms of disease in podocyte development. Stem Cells. 35 (12), 2366-2378 (2017).
  4. Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).
  5. Hale, L. J., et al. 3D organoid-derived human glomeruli for personalised podocyte disease modelling and drug screening. Nature Communications. 9 (1), 5167(2018).
  6. Vanslambrouck, J. M., et al. Enhanced metanephric specification to functional proximal tubule enables toxicity screening and infectious disease modelling in kidney organoids. Nature Communications. 13 (1), 5943(2022).
  7. Tanigawa, S., et al. Organoids from nephrotic disease-derived iPSCs identify impaired NEPHRIN localization and slit diaphragm formation in kidney podocytes. Stem Cell Reports. 11 (3), 727-740 (2018).
  8. Forbes, T. A., et al. Patient-iPSC-derived kidney organoids show functional validation of a ciliopathic renal phenotype and reveal underlying pathogenetic mechanisms. American Journal of Human Genetics. 102 (5), 816-831 (2018).
  9. Freedman, B. S., et al. Modelling kidney disease with CRISPR-mutant kidney organoids derived from human pluripotent epiblast spheroids. Nature Communications. 6, 8715(2015).
  10. Cruz, N. M., et al. Organoid cystogenesis reveals a critical role of microenvironment in human polycystic kidney disease. Nature Materials. 16 (11), 1112-1119 (2017).
  11. Gupta, N., et al. Modeling injury and repair in kidney organoids reveals that homologous recombination governs tubular intrinsic repair. Science Translational Medicine. 14 (634), eabj4772(2022).
  12. Hiratsuka, K., et al. Organoid-on-a-chip model of human ARPKD reveals mechanosensing pathomechanisms for drug discovery. Scencei Advances. 8 (38), eabq0866(2022).
  13. Dorison, A., et al. Kidney organoids generated using an allelic series of NPHS2 point variants reveal distinct intracellular podocin mistrafficking. Journal of the American Society of Nephrology. , (2022).
  14. Eremina, V., et al. Glomerular-specific alterations of VEGF-A expression lead to distinct congenital and acquired renal diseases. The Journal of Clinical Investigation. 111 (5), 707-716 (2003).
  15. Kitamoto, Y., Tokunaga, H., Tomita, K. Vascular endothelial growth factor is an essential molecule for mouse kidney development: glomerulogenesis and nephrogenesis. The Journal of Clinical Investigation. 99 (10), 2351-2357 (1997).
  16. Sison, K., et al. Glomerular structure and function require paracrine, not autocrine, VEGF-VEGFR-2 signaling. Journal of the American Society of Nephrology. 21 (10), 1691-1701 (2010).
  17. Ryan, A. R., et al. Vascular deficiencies in renal organoids and ex vivo kidney organogenesis. Developmental Biology. 477, 98-116 (2021).
  18. vanden Berg, C. W., et al. Renal subcapsular transplantation of PSC-derived kidney organoids induces neo-vasculogenesis and significant glomerular and tubular maturation in vivo. Stem Cell Reports. 10 (3), 751-765 (2018).
  19. Sharmin, S., et al. Human induced pluripotent stem cell-derived podocytes mature into vascularized glomeruli upon experimental transplantation. Journal of the American Society of Nephrology. 27 (6), 1778-1791 (2016).
  20. Bantounas, I., et al. Generation of functioning nephrons by implanting human pluripotent stem cell-derived kidney progenitors. Stem Cell Reports. 10 (3), 766-779 (2018).
  21. vanden Berg, C. W., Koudijs, A., Ritsma, L., Rabelink, T. J. In vivo assessment of size-selective glomerular sieving in transplanted human induced pluripotent stem cell-derived kidney organoids. Journal of the American Society of Nephrology. 31 (5), 921-929 (2020).
  22. Asai, R., Bressan, M., Mikawa, T. Avians as a model system of vascular development. Methods in Molecular Biology. 2206, 103-127 (2021).
  23. Jankovic, B. D., et al. Immunological capacity of the chicken embryo. I. Relationship between the maturation of lymphoid tissues and the occurrence of cell-mediated immunity in the developing chicken embryo. Immunology. 29 (3), 497-508 (1975).
  24. Alkie, T. N., et al. Development of innate immunity in chicken embryos and newly hatched chicks: a disease control perspective. Avian Pathology. 48 (4), 288-310 (2019).
  25. Rawles, M. E. Transplantation of normal embryonic tissues. Annalls of the New York Academy of Sciences. 55 (2), 302-312 (1952).
  26. Rawles, M. E. The development of melanophores from embryonic mouse tissues grown in the coelom of chick embryos. Proceedings of the National Academy of Sciences. 26 (12), 673-680 (1940).
  27. Garreta, E., et al. Fine tuning the extracellular environment accelerates the derivation of kidney organoids from human pluripotent stem cells. Nature Materials. 18 (4), 397-405 (2019).
  28. Koning, M., et al. Vasculogenesis in kidney organoids upon transplantation. NPJ Regenerative Medicine. 7 (1), 40(2022).
  29. Hamburger, V. Morphogenetic and axial self-differentiation of transplanted limb primordia of 2-day chick embryos. Journal of Experimental Zoology. 77 (3), 379-399 (1938).
  30. Dossel, W. E. New method of intracelomic grafting. Science. 120 (3111), 262-263 (1954).
  31. Takasato, M., Er, P. X., Chiu, H. S., Little, M. H. Generation of kidney organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 11 (9), 1681-1692 (2016).
  32. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Developmental Dynamics. 195 (4), 231-272 (1992).
  33. Aleksandrowicz, E., Herr, I. Ethical euthanasia and short-term anesthesia of the chick embryo. ALTEX. 32 (2), 143-147 (2015).
  34. ACUC. Guideline: The Use and Euthanasia Procedures of Chicken/Avian Embryos. , Available from: https://www.cpp.edu/research/research-compliance/iacuc/docs/iacuc-guidelines-on-euthanasia-of-chicken-and-embryos.pdf (2012).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים