A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Summary

טריגליצרידים ליפוליזה באדיפוציטים היא תהליך מטבולי חשוב המביא לשחרור חומצות שומן חופשיות וגליצרול. כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט למדידת ליפוליזה בסיסית ומגורה באדיפוציטים וברקמת שומן ex vivo מעכברים.

Abstract

אדיפוציטים מאחסנים אנרגיה בצורה של טריגליצרידים בטיפות שומנים. אנרגיה זו יכולה להיות מגויסת באמצעות ליפוליזה, שבה שרשראות הצד של חומצות השומן נבקעות ברצף מעמוד השדרה של הגליצרול, וכתוצאה מכך משחררים חומצות שומן חופשיות וגליצרול. בשל הביטוי הנמוך של גליצרול קינאז באדיפוציטים לבנים, שיעורי הספיגה מחדש של גליצרול זניחים, בעוד ספיגה מחדש של חומצות שומן מוכתבת על ידי יכולת הקישור של חומצות שומן של רכיבי מדיה כגון אלבומין. ניתן לכמת הן גליצרול והן שחרור חומצות שומן למדיה על ידי בדיקות קולורימטריות כדי לקבוע את הקצב הליפוליטי. על ידי מדידת גורמים אלה בנקודות זמן מרובות, ניתן לקבוע את הקצב הליניארי של ליפוליזה בביטחון גבוה. כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט למדידת ליפוליזה במבחנה אדיפוציטים מובחנים ורקמת שומן ex vivo מעכברים. פרוטוקול זה עשוי להיות מותאם גם עבור שורות תאים preadipocyte אחרים או רקמת שומן מאורגניזמים אחרים; שיקולים ופרמטרים אופטימיזציה נדונים. פרוטוקול זה נועד להיות שימושי בקביעה והשוואה של שיעור ליפוליזה אדיפוציט בין מודלים וטיפולים בעכברים.

Introduction

חומרים מזינים עודפים מאוחסנים ברקמת שומן לבן בצורה של טריגליצרידים בליבת השומנים הניטרלית של טיפות השומנים. מאגרי הטריגליצרידים מגויסים באמצעות ליפוליזה, תהליך שבו שרשראות הצד של חומצות השומן נבקעות ברצף על ידי ליפאז טריגליצרידים ברקמת השומן (ATGL), ליפאז רגיש להורמונים (HSL) ומונוגליצרידים ליפאז (MGL), וכתוצאה מכך משחררים חומצות שומן חופשיות (FFAs) ואת עמוד השדרה של גליצרול ^1,2. ליפוליזה מופעלת על ידי איתות קטכולאמין ברקמת השומן. מסופי עצבים סימפתטיים משחררים קטכולאמינים באופן מקומי, הנקשרים לקולטנים β-אדרנרגיים על קרום הפלזמה האדיפוציטית. עם קשירת ליגנד, קולטנים מצומדים אלה של חלבון G (GPCRs) מפעילים ציקלאז אדניליל באמצעות G_αs. הפעלה עוקבת של חלבון קינאז A (PKA) על ידי cAMP גורמת להגברת הרגולציה הן של ATGL והן של HSL. הזרחן של perilipin-1 על ידי PKA גורם לדיסוציאציה של ABHD5 (הידוע גם בשם CGI-58), אשר קושר ומפעיל ATGL³. PKA ישירות phosphorylates HSL, קידום טרנסלוקציה שלה מן cytosol אל טיפת השומנים, שבו אינטראקציה עם phosphorylated perilipin-1 עוד יותר מקדם את פעילות ליפאז שלה 4,5,6,7. נראה כי הליפאז השלישי המעורב בליפוליזה, MGL, אינו מוסדר על ידי איתות קטכולאמין⁸. חשוב לציין, סינתזת טריגליצרידים באדיפוציטים מתווכת על ידי מסלול סינתזת השומנים גליצרול, שאינו כרוך בהיווצרות מונוגליצרידים כמתווך; במקום זאת, גליצרול-3-פוספט אציל טרנספראזות מזרז את היווצרותה של חומצה ליזופוספטידית, אשר משולבת עם אציל-CoA שומני אחר ליצירת חומצה פוספטידית, ולאחר מכן איזומריזציה לדיגליצרידים לפני הסינתזה הסופית של טריגליצרידים (איור 1)9,10,11.

איור 1: מסלולי סינתזת ליפוליזה וגליצרול. למעלה: מסלול ליפוליטי; אנזימים המוצגים באדום: טריגליצרידים ליפאז מרקמת השומן (ATGL), ליפאז רגיש להורמונים (HSL) ומונוגליצריד ליפאז (MGL). למטה: מסלול סינתזת שומנים גליצרול; אנזימים המוצגים בירוק: דיגליצריד אצילטרנספראז (DGAT), חומצה פוספטידית פוספטאז (PAP), חומצה ליזופוספטידית אצילטרנספראז (LPAT, הידוע גם בשם LPAATs) וגליצרול-3-פוספט אצילטרנספראז (GPAT). שומנים: טריגליצרידים (TG), דיגליצרידים (DG), מונוגליצרידים (MG), חומצת שומן חופשית (FFA), אציל-CoA שומני (FA-CoA), חומצה ליזופוספטידית (LPA) וחומצה פוספטידית (PA). מטבוליטים אחרים: פוספט אנאורגני (Pi) וגליצרול 3-פוספט (G3P). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

אדנוזין חוץ-תאי הוא וסת חשוב נוסף של ליפוליזה, הפועל באמצעות GPCRs מצומדים G_s ו-G_i כדי להשפיע על פעילות ציקלז אדניל. קולטן האדנוזין השולט באדיפוציטים, ADORA1, מעכב ציקלז אדניליל, ובכך ליפוליזה באמצעות הפעלת G_i¹². ADORA2A, המתבטא ברמות נמוכות יותר, ובעיקר באדיפוציטים חומים, מפעיל ליפוליזה באמצעות איתות G_s ¹³. ADORA1 משפיע הן על ליפוליזה בסיסית והן על התגובה לאגוניסטים אדרנרגיים. ההשפעה של אדנוזין על ליפוליזה יכולה להיות נשלטת על ידי הוספת אדנוזין deaminase כדי לנטרל אדנוזין, כמו גם אגוניסט ספציפי ADORA1 phenylisopropyladenosine^14,15. הפעלה הורמונלית של GPCRs מצומדים ל-G_q יכולה להשפיע גם על ליפוליזה באמצעות הפעלה של פוספוליפאז C וחלבון קינאז C^16,17,18,19. אותות דלקתיים משפיעים גם על שיעורים ליפוליטיים. הפעלת TLR4 על ידי LPS (ואנדוטוקסינים אחרים) מגבירה את הקצב הליפוליטי על ידי הפעלת ERK, אשר פוספורילטים perilipin-1 ו- HSL²⁰. TNF-α גם מפעיל ליפוליזה באמצעות הפעלת ERK ו- NF-κB, כמו גם הפחתת שעתוק של פוספודיאסטראז PDE-3B ו- CIDEC^21,22,23. IL-6 נקשר גם לליפוליזה מוגברת של אדיפוציטים, במיוחד ברקמת שומן מזנטרית, ששחרור FFA שלה משפיע על סטאטוזיס בכבד וגלוקונאוגנזה^24,25,26.

ליפוליזה מדוכאת במהלך מצב ההזנה על ידי אינסולין. AKT פוספורילטים ומפעיל PDE-3B כדי לדכא איתות cAMP ולמנוע הפעלת PKA²⁷. אינסולין גם משעתק למטה ATGL²⁸. השמנת יתר מקדמת עמידות לקטכולאמין באמצעות מגוון מנגנונים, כולל הפחתת ויסות של קולטני β-אדרנרגי באדיפוציטים 29,30,31,32,33^. אדיפוציטים מבטאים את כל שלושת הקולטנים β-אדרנרגיים (β-1, β-2 ו-β-3). בעוד קולטנים אדרנרגיים β-1 ו-β-2 מתבטאים בכל מקום, הקולטן האדרנרגי β-3 מתבטא בעיקר באדיפוציטים בעכברים^34,35. ביטוי Adrb3 מושרה על ידי C/EBPα במהלך אדיפוגנזה³⁶. הקולטן האדרנרגי β-3 מתבטא מאוד באדיפוציטים בוגרים. ההפעלה של קולטנים אדרנרגיים β-1 ו-β-2 מגבילה את עצמה עקב עיכוב משוב על ידי β-arrestin³⁷. עיכוב משוב של הקולטן האדרנרגי β-3 מתווך על ידי מסלולי איתות אחרים, המפחיתים את ביטוי Adrb3 ^33,38,39.

תרכובות רבות ניתן להשתמש כדי להפעיל ליפוליזה אדיפוציט. קטכולאמינים הם מפעילים פיזיולוגיים עיקריים של ליפוליזה. נוראפינפרין (או נוראדרנלין) ואפינפרין (או אדרנלין) מפעילים את כל שלושת קולטני β-אדרנרגי⁴⁰. נוראפינפרין ואפינפרין משפיעים גם על ליפוליזה באמצעות הפעלת איתות קולטן α-אדרנרגי⁴¹. אגוניסטים נפוצים לקולטן β-אדרנרגי כוללים איזופרוטרנול, שהוא אגוניסט קולטן β-אדרנרגי לא סלקטיבי, ואגוניסטים לקולטן β-3 אדרנרגי CL-316,243 ומירבגרון⁴². בהתחשב בכך שהאדיפוציטים מבטאים בעיקר את הקולטן האדרנרגי β-3, אנו משתמשים ב-CL-316,243 כדוגמה כאן. הספציפיות שלו לקולטן האדרנרגי β-3 הופכת אותו גם למפעיל ספציפי יחסית של איתות קטכולאמין אדיפוציט, שניתן להשתמש בו בבטחה גם in vivo. שימו לב שהריכוז הנפוץ של 10 מיקרומטר CL-316,243 בתרבית תאים גבוה בסדרי גודל מהמינון ~0.1 מיקרומטר הנדרש להשגת תגובה מקסימלית³³. פורסקולין עוקף את הקולטן האדרנרגי, מפעיל ישירות ציקלז אדניליל ואיתות ליפוליטי במורד הזרם. ישנם הרבה יותר activators, כמו גם מדכאים של ליפוליזה. בעת בחירת תרכובת לגירוי ליפוליזה, יש לשקול בזהירות את ספציפיות הקולטן ואת מסלולי האיתות במורד הזרם במסגרת תכנון הניסוי.

שיעור הליפוליזה ברקמת השומן הלבנה הוא גורם מטבולי חשוב המשפיע על סבילות לקור וזמינות חומרים מזינים במהלך צום או פעילות גופנית^43,44,45,46. מטרת פרוטוקול זה היא למדוד את קצב הליפוליזה באדיפוציטים וברקמת השומן, מה שיקל על הבנת חילוף החומרים של האדיפוציט וכיצד הוא עשוי להשפיע על הפנוטיפ המטבולי של מודלים שונים של מורין. כדי לכמת את השיעור הליפוליטי, אנו מודדים את הופעתם של מוצרים ליפוליטיים בתקשורת (כלומר, FFAs וגליצרול). השיטה מסתמכת על שחרור מוצרים ליפוליטיים מהאדיפוציט לתקשורת. מכיוון שאדיפוציטים לבנים מבטאים רמות נמוכות של גליצרול קינאז, שיעורי ספיגה חוזרת של גליצרול נמוכים⁴⁷. לעומת זאת, יש לשקול גם את הייצור של FFAs וגליצרול על ידי מסלולים מטבוליים שאינם ליפוליזה. נראה כי אדיפוציטים מבטאים פוספטאז עם פעילות נגד גליצרול-3 פוספט, מה שמאפשר ייצור גליצרול מגליצרול-3-פוספט המופק מגלוקוז^48,49,50. גליקוליזה היא מקור לגליצרול-3-פוספט המשמש לאסטריפיקציה מחדש של FFA באדיפוציטים לבנים. כאשר רמות הגלוקוז מוגבלות, גליצרונוגנזה דורשת מקורות אחרים של 3 פחמן, כגון לקטט ופירובט⁵¹. התקשור של FFAs המשוחררים על ידי ליפוליזה בתוך התא וגורלם המטבולי אינו מובן היטב; FFAs המשוחררים על ידי ליפוליזה חייבים להיות מומרים לאציל-CoA שומני, לפני שהם עוברים אסטריפיקציה מחדש או עוברים חמצון β. נראה כי FFAs המשוחררים על ידי ליפוליזה ככל הנראה יוצאים מהתא לפני שהם נלקחים בחזרה ומומרים לשומן acyl-CoA 52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62 . FFAs יכולים להיות מבודדים מחוץ לתא על ידי אלבומין. חשוב לציין, FFAs ארוכי שרשרת ידועים כמעכבים ליפוליזה אם הם אינם מוחזקים על ידי אלבומין 63,64,65,66,67. לכן, אופטימיזציה של יכולת האגירה FFA של התקשורת במהלך בדיקת ליפוליזה היא קריטית. ההליך המתואר כאן דומה לשיטות שפורסמו בעבר למדידת השיעור הליפוליטי באדיפוציטים וברקמת שומן ex vivo מעכברים ובני אדם 15,68,69,70,71. פרוטוקול זה שונה באמצעות שימוש בדגימה סדרתית; על ידי ביצוע דגימה סדרתית, אנו יכולים לאמת פנימית שליפוליזה נמדדת בפאזה ליניארית ולהשתמש במדידות מרובות כדי לחשב את קצב הליפוליזה, ובכך להפחית את טעות המדידה כדי להגביר את הביטחון בערך המחושב הסופי. החיסרון של דגימה סדרתית הוא כי הבדיקה דורשת יותר זמן ריאגנטים; עם זאת, מסגרת הזמן הארוכה יותר מפחיתה את השפעת טעות המדידה על שגיאת התקן של אומדני הקצב. בנוסף, פרוטוקול זה מודד הן FFA והן שחרור גליצרול, ומשקלל את היחס בין שחרור FFA:גליצרול במטרה להשיג יחס של 3:1, כפי שניתן היה לצפות מליפוליזה מלאה ושחרור מוצרים ליפוליטיים למדיה⁷².

Protocol

השימוש בכל בעלי החיים אושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) בקולג’ הרפואי וייל קורנל באוניברסיטת קורנל.

1. הכנת חוצצים וצלחות איסוף

1. הכינו אלבומין בסרום בקר 5% (BSA) על ידי המסת 5 גרם BSA ב-100 מ”ל של מדיום הנשר המעובד של דולבקו (DMEM) ללא פנול אדום. ערבבו בעדינות את ה-BSA כדי להתמוסס (ניעור אינו מועיל). לאחר המסת ה-BSA במלואה, יש לעקר את המדיה באמצעות מסנן של 0.2 מיקרומטר. אחסן את מדיית ה- BSA ב- 4 ° C למשך עד חודש אחד.
2. הפוך את העבודה לריכוזי בקרה וגירוי. מדיית בקרה: 5% מדיית BSA עם בקרת רכב. אמצעי גירוי: 5% חומרי הדפסה BSA עם 0.5 מיקרומטר CL-316,243. צור מדיה חדשה לגירוי עבור כל ניסוי.
3. יש לחמם את המדיה לשימוש בטמפרטורה של 37°C. תייגו צלחת של 96 בארות לאיסוף מדיה.

2. הכנת מדגם

1. בצע תרבית תאים כמתואר להלן. בצע את כל עבודת התאים במכסה אדים סטרילי כדי למזער זיהום חיצוני.
   1. בודד והבדיל בין פרדיפוציטים ראשוניים, כמו ב-^73,74.
      1. צלחת preadipocytes ראשוני בצפיפות גבוהה, כגון 1 x 10⁵ תאים / באר בצלחת 24 באר ב 1 מ”ל / באר תרבית מדיה (15% סרום בקר עוברי (FBS) ו 1x פניצילין-סטרפטומיצין-גלוטמין ב DMEM/F12).
      2. לאחר שהתאים מגיעים למפגש של 100%, התמינו עם 5 מיקרומטר דקסמתזון, 0.5 מילימטר 3-איזובוטיל-1-מתיל-קסנתין, 1 מיקרוגרם / מ”ל אינסולין, ו 1 מיקרומטר תיאזולידינדיון (TZD) במדיה תרבית במשך 3 ימים. לאחר מכן, יש לעבור לתרבית עם 1 מיקרוגרם/מ”ל אינסולין למשך 3 ימים לפחות כדי לגדל טיפות שומנים. יש להשתמש ב-1 מ”ל/באר של מדיה בצלחת בעלת 24 הקידוחים.
      3. שנה את מצע התרבית (1 מ”ל / באר) עם אינסולין כל 2 או 3 ימים. התאים יכולים להישמר במדיה עם אינסולין עד שבועיים. השתמש רק בתרבויות שבהן שיעורי הבידול הם מעל 90% והם דומים בין קבוצות עבור בדיקה זו, שכן דיפרנציאציה מופחתת עלולה להתפרש בטעות כירידה בשיעור הליפוליטי.
      4. תרבית את התאים במדיה נטולת אינסולין במשך 24 שעות לפני מדידת ליפוליזה.
         הערה: אינסולין בתקשורת שומר על טיפות שומנים, אך גם מעכב ליפוליזה. דגירה ללא אינסולין למשך 24 שעות מאפשרת הפעלה ליפוליטית מלאה ללא אובדן נפח טיפת השומנים. במערכות מסוימות, ייתכן שיהיה צורך לקצר או להאריך את זמן התרבית ללא אינסולין.
   2. שטפו את התאים עם DPBS פעם אחת כדי להסיר שאריות סרום מתרבית.
      הערה: פרוטוקול זה אינו כולל רעב בסרום, אשר יכול להפעיל ליפוליזה. ניתן להשתמש בהרעבת נסיוב על פי שיקול דעתו של החוקר.
2. בצע תרבות ex vivo כמתואר להלן.
   1. הכינו צלחת בת 6 בארות, עם באר אחת לכל רקמה שתיאסף מכל עכבר. יש להניח 4 מ”ל DMEM בטמפרטורת החדר בכל באר לשימוש.
      הערה: BSA במדיית האיסוף אינו הכרחי.
   2. הכינו צלחת של 48 בארות לבדיקת הליפוליזה, עם באר אחת לכל שכפול. יש להניח 400 μL של DMEM בטמפרטורת החדר בכל באר לשימוש. השתמש בשתיים עד ארבע בקרות ושתיים עד ארבע בארות מגורות לכל רקמה לכל עכבר.
   3. להרדים את העכבר על ידי נקע צוואר הרחם תחת הרדמה, עם שיטה משנית כגון pneumothorax דו צדדי. כאן, השתמשנו בעכבר נקבה C57BL/6J בן 32 גרם, 7 חודשים, שהוזן בתזונה עתירת שומן של 45% במשך 4 חודשים.
      הערה: פרוטוקול זה יכול לשמש גם עבור גברים, כמו גם זנים, דיאטות וגילאים אחרים.
   4. רססו עם 70% אתנול והשתמשו במספריים כדי לבצע חתך רוחבי קטן (~ 1 ס”מ) במרכז עור הבטן, פרקו את העור על ידי צביטה משני הצדדים עם האגודל והאצבע וקפלו את עור הבטן התחתונה כדי לחשוף את המחסנים התת עוריים האחוריים. אתר והסר את בלוטת הלימפה המפשעתית והקהה נתח את רקמת השומן המפשעתית מיד אחורית לבלוטת הלימפה המפשעתית באמצעות מלקחיים.
   5. כדי לאסוף את רקמת השומן גונדלי, לבצע חתך לרוחב אנכי בצפק כדי לגשת לחלל הצפק. החזיקו את כרית שומן הגונדל בפינצטה וחתכו לאורך הרחם (או אפידידימיס לזכרים) כדי להסיר את רקמת השומן הגונדלית. מניחים את המחסנים שנאספו בצלחת בת 6 בארות.
   6. מוציאים את הרקמה היטב, מניחים על משטח סיליקון וחותכים לגושים של 5 עד 7 מ”ג עם מספריים.
   7. שקלו היטב 25 עד 30 מ”ג (חמישה או שישה גושים) עבור כל בדיקה והכניסו לצלחת בדיקה של 48 בארות. כתם את הרקמה על מגבת נקייה לפני השקילה כדי להסיר מדיה כלשהי. שקול את סירת המשקולות לאחר הסרת הרקמה ורשום את המשקל של כל השאריות שנותרו מאחור. נקו את סירת המשקולות בין הדגימות וטפחו מחדש במידת הצורך. השתמש בסירת משקל חדשה עבור כל רקמה.
   8. לאחר שכל דגימות הרקמה נשקלו, הניחו את צלחת הבדיקה 48 בארות באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס, 10% CO₂ למשך 15 דקות.

3. בדיקת ליפוליזה

1. ביצוע איסוף מדיה. לבצע העברה של המדיה ואיסוף הדגימות לאחר מכן במכסה אדים סטרילי כדי למזער זיהום פוטנציאלי ממקורות חיצוניים.
   1. ב t = 0, להסיר את המדיה ולהוסיף 400 μL לכל באר של מדיה בקרה או גירוי, ומניחים את הבדיקה לתוך 37 ° C, 10% CO₂ אינקובטור. עבור תרבית רקמות ex vivo , בזהירות להסיר מדיה באמצעות פיפטה; אין להשתמש ביניקה.
      הערה: לחלופין, הכינו צלחת שנייה עם אמצעי בקרה וגירוי, והעבירו את הרקמות.
   2. ב t = 1, 2, 3 ו 4 שעות, לאסוף 200 μL של מדיה, להחליף עם 200 μL של אמצעי הבקרה או גירוי המתאים, ולהחזיר את צלחת הבדיקה לאינקובטור. אחסנו את צלחת האיסוף בטמפרטורה של 4°C. כדי לקבוע את קיבולת האגירה של FFA של מדיית BSA, השתמש באוסף נוסף בשעה 24 שעות.
      הערה: ניתן לעצור את הניסויים כאן, ואת המדיה שנאספה ניתן לאחסן ב -20 ° C.

4. בדיקת FFA colorimetric

1. מחממים את הריאגנטים לטמפרטורת החדר וממיסים בקבוק אחד של מגיב צבע A עם בקבוק אחד של ממס A, ובקבוק אחד של מגיב צבע B עם בקבוק אחד של ממס B. מתאריך החוקה מחדש, ריאגנטים אלה משמשים בצורה הטובה ביותר בתוך שבוע אחד. יש להשליך חודש לאחר החוקה מחדש.
2. מפשירים ומערבבים את הדגימות.
3. צור עקומה סטנדרטית של FFA. הפתרון הסטנדרטי הוא 1 mM. השתמש בנפח הבא עם הריאגנטים עבור העקומה הסטנדרטית: 25 μL, 20 μL, 15 μL, 10 μL, 10 μL (דילול 1:2), 10 μL (דילול 1:4), 10 μL (דילול 1:8) ו- 10 μL מים לטווח מרבי. עבור רמות FFA נמוכות, תקן 10 μL של 1 mM, 0.8 mM, 0.6 mM, 0.4 mM, 0.2 mM, 0.1 mM ו- 0.05 mM עשוי להיות ישים יותר.
4. פיפטה סטנדרטית ודגימות לתוך צלחת בדיקה 96 באר. נפח הדגימה המומלץ הוא 10 μL. כלול שלוש בארות עם נפח זהה של מדיה BSA כמו הדגימות לתיקון רקע.
   הערה: אם ריכוזי הדגימה חורגים מטווח העקומה הסטנדרטית, חזור על הבדיקה והתאמת נפח הדגימה ל- 2-25 μL.
5. מוסיפים 150 μL של מגיב A לכל באר ומערבבים. הימנעו מיצירת בועות. פוצצו את כל הבועות בעזרת מחט מד עדינה. לדגור את צלחת הבדיקה ב 37 ° C במשך 5 דקות.
6. קרא את ספיגת הצלחת בסימוכין של 550 ננומטר ו- 660 ננומטר (קריאה A).
7. מוסיפים 75 μL של מגיב B לכל באר ומערבבים. הימנעו מיצירת בועות. פוצצו את כל הבועות בעזרת מחט מד עדינה. לדגור את צלחת הבדיקה ב 37 ° C במשך 5 דקות.
8. קרא שוב את ספיגת הצלחת בנקודת ייחוס של 550 ננומטר ו- 660 ננומטר (קריאה B).

5. בדיקת גליצרול קולורימטרי

1. הרכיבו מחדש את מגיב הגליצרול החופשי עם 36 מ”ל מים טהורים במיוחד והתאקלמו לטמפרטורת החדר. ריאגנטים אלה משמשים בצורה הטובה ביותר בתוך מספר שבועות. יש להשליך חודשיים לאחר החוקה מחדש.
2. מפשירים ומערבבים את הדגימות.
3. צור עקומה סטנדרטית של גליצרול על ידי ביצוע דילול סדרתי של שבע נקודות, פי 2 של תמיסת הגליצרול הסטנדרטית וריק במים.
   הערה: העקומה הסטנדרטית היא ליניארית יחסית עד 25 μL של 2.8 מילימטר גליצרול, אך לא ליניארית בריכוזים גבוהים יותר.
4. פיפטה 25 μL כל אחד של תקן דגימות לתוך צלחת הבדיקה 96-well. כלול שלוש בארות עם מדיית BSA לתיקון רקע.
5. מוסיפים 175 μL של מגיב גליצרול חופשי לכל באר ומערבבים. הימנעו מיצירת בועות. פוצצו את כל הבועות בעזרת מחט מד עדינה. לדגור את צלחת הבדיקה ב 37 ° C במשך 5 דקות.
6. קרא את ספיגת הצלחת ב 540 ננומטר.

6. חישוב שיעור ליפוליטי

1. התחל עם ערכי צפיפות אופטית (OD). עבור גליצרול, השתמש ישירות בערכי OD_{A 540} . חשב את OD של בדיקת FFA לפי הנוסחה הבאה:
   OD = (קריאה B: A 550 – A 660) – (קריאה A: A₅₅₀ – A₆₆₀)
2. השתמש בעקומה הסטנדרטית כדי לחשב את רמות ה- FFA והגליצרול בדגימות שנאספו. התווה את ערכי OD הסטנדרטיים על ציר y, ועל ציר x, השתמש בריכוזים סטנדרטיים ביחס לנפח הדגימה (כלומר, ריכוז הבארות עם 20 μL של תקן FFA של 1 mM על צלחת עם דגימות 10 μL שווה ל 2 mM). התאם לקו מגמה ליניארי:
   y = mx + b
3. בדוק חזותית את העקומה הסטנדרטית והסר נקודות מחוץ לטווח הליניארי של הבדיקה. חישוב ריכוזי מדגם באמצעות המשוואה:
   ריכוז מדגם: x = (OD – b) ÷ m
4. התאם ובחן מחדש דגימות שאינן בטווח הבדיקה הליניארית. כדי לקבל את ריכוז הדגימה הסופי, הפחת את ריכוז בארות הרקע המכילות רק מדיה BSA מריכוז הדגימות.
5. חישוב השומות של FFA וגליצרול המיוצרות על ידי כל מדגם בכל נקודת זמן, על פי הנוסחה:
   
   כאשר C n = ריכוז בזמן t = n; V_t = נפח כולל בבאר; V_s = נפח איסוף המדגם; ו- M n = שומות המיוצרות בזמן t = n (כאשר הריכוזים הם ב- mM והנפחים הם ב– mL הפלט הוא μMol).
   לדוגמה, בנקודות זמן שונות:
   M 1 = C₁ × V_t
   M 4 = C₄ × V_t + (C₁ + C₂+ C₃)V_s
   או
   M 4 = C₄ × V_t + C₃ × V s + C₂ × V s + C₁ ×V _s
6. נרמלו למשקל הרקמה על ידי חלוקה במשקל הרקמה עבור כל דגימה בגרמים לקבלת יחידות של μmol/g. עבור תאים בתרבית, הערכים מוצגים כ-μmol/well. ודא שמספר התא ויעילות ההתמיינות דומים מבאר לבאר.
   הערה: הבדלים ביעילות ההתרבות או ההתמיינות יסבכו את פירוש התוצאות ויחייבו שיטה אחרת של נורמליזציה (למשל, נורמליזציה לחלבון; ראו דיון).
7. חשב את השיפוע של μmol/g שנוצר (ציר y) לעומת זמן (ציר x) עבור כל דגימה בנפרד.
   1. בגיליון אלקטרוני, ניתן לעשות זאת באמצעות הפונקציה =SLOPE(known_ys,known_xs). בתא חדש, הקלד “=SLOPE” (ולאחר מכן השתמש בסמן כדי להדגיש את ערכי הגליצרול או FFA לדוגמה ב- μmol/g, ולאחר מכן כדי להדגיש את ערכי הזמן המתאימים).
   2. אמת את הליניאריות של הנתונים. ערכי R² הם דרך מהירה לקבוע ליניאריות של הדגימות. בגיליון אלקטרוני, ניתן לעשות זאת באמצעות הפונקציה =RSQ(known_ys,known_xs), באותו אופן המתואר בשלב 6.7.1, אך הקלט הראשוני הוא =RSQ. ודא שערכי R² הם >- 0.98; ערכים נמוכים יותר מצביעים על סטייה מלינאריות. הדבר יכול לנבוע משגיאת מדידה/דגימה או מאובדן ליניאריות.
      1. דרך נוספת לבדוק ליניאריות היא לבצע רגרסיה ליניארית עבור כל דגימה ולשרטט את השאריות. בתוכנת ניתוח סטטיסטי, צור טבלת XY עם ערך Y יחיד עבור כל נקודת זמן. בחר נתח > רגרסיה ליניארית פשוטה ובחר את התיבה עבור העלילה השיורית לפני שתלחץ על אישור. התרשים השיורי יופיע כגרף חדש.
8. השתמש בקצב ייצור FFA וגליצרול (כלומר, שיפוע [(μmol/g/h]) עבור כל דגימה כנקודת נתונים נפרדת לביצוע ניתוח סטטיסטי, וערכי תרשים אם משווים תנאים ליפוליטיים שונים. אם משווים שיעורים ליפוליטיים בין גנוטיפים, השתמשו בשתיים או שלוש דגימות לכל חיה כשכפולים טכניים, והשתמשו בממוצע עבור נקודת נתונים אחת לכל חיה, כך שגודל הדגימה יהיה שווה למספר בעלי החיים.

Representative Results

Discussion

כאן, אנו מספקים פרוטוקול בסיסי למדידת שיעור הליפוליזה באדיפוציטים וברקמת השומן ex vivo . כדי לכמת ליפוליזה, חשוב למדוד את הקצב הליפוליטי בשלב הלינארי. אנו משתמשים בטכניקת דגימה סדרתית, שבה חלק גדול מהמדיה נאסף ומוחלף במדיה טרייה במרווחי זמן קבועים. שיטה שמרנית למחצה זו מאפשרת תוספת של BSA טרי עם יכולת אגירה FFA ומעכבת עיכוב משוב, מה שמאריך את משך הליפוליזה הליניארית. תכנון ניסיוני זה מנסה לשחזר את כלי הדם של רקמת השומן in vivo, אשר מספק אלבומין טרי כדי לקשור FFAs⁷⁵ ששוחררו. פרוטוקול זה הותאם למדידת ליפוליזה ברקמת השומן הלבן murine ex vivo וברקמת השומן המפשעתית preadipocytes ראשוניים המובחנים במבחנה. סביר להניח שהפרוטוקול יכול להיות מותאם לעבודה טובה במחסני שומן חומים ובז’, כמו גם רקמת שומן מאורגניזמים אחרים וקווי תאים אימורטליים עם פוטנציאל אדיפוגני גבוה. הפרוטוקול מאפשר גמישות בגיל, מין ותזונה של העכברים לפני איסוף רקמת השומן לבדיקות ex vivo . מניפולציות מסוימות, כגון צום, עשויות להשפיע על הקצב הליפוליטי הבסיסי, בעוד התערבויות אחרות כגון השמנת יתר הנגרמת על ידי דיאטה משפיעות גם על שיעור הליפוליזה המגורה.

הפרוטוקול חייב להיות מותאם לכל מערכת ניסוי, תלוי אם שיעורי הליפוליטיקה גבוהים או נמוכים יותר. כדי לאמת ליניאריות, אנו ממליצים לחשב את ערכי R² ולהסתכל על תרשים השאריות. ערכי R² צריכים להיות קרובים מאוד ל- 1. כאשר מעריכים את החלקה השיורית, יש לחפש ערכים שיוריים שליליים בנקודות זמן מאוחרות יותר, שכן אלה מצביעים על כך שהשיעורים הליפוליטיים יורדים, והליניאריות הולכת לאיבוד. דוגמאות לחלקות שיוריות כאלה מוצגות באיור 5E,F. ביטול נקודות הזמן של 4 שעות במקרה זה מספק חישוב מדויק יותר של הקצב הליפוליטי הליניארי ומשפר את ערכי R². עם זאת, מכיוון שהשיעור מחושב ממספר נקודות זמן, הוא חזק יחסית, ולהכללה של נקודת זמן כזו יש השפעה קטנה בלבד על ערכי R² ועל שיעור הליפוליזה המחושב. אם משתמשים בנקודת זמן אחת כדי לחשב את השיעור הליפוליטי, הנתונים יכולים להיות מוטים בקלות רבה יותר.

האופן שבו הנתונים מנורמלים יכול גם להשפיע על התוצאות היחסיות בין דגימות. כאן, אנו ממליצים לנרמל את רקמת ex vivo למשקל הרקמה ואת preadipocytes הראשוני מובחן במבחנה לכל באר. עם זאת, טכניקות נורמליזציה אלה עשויות שלא להתאים לכל מערכות הניסוי. חשוב לציין, אם קצב ההתפשטות או יעילות הבידול שונים בין קבוצות, נורמליזציה לבאר אינה מתאימה. טכניקות נורמליזציה חלופיות כוללות חלבון, שומנים ו- DNA. לכל שיטת נורמליזציה יש יתרונות וחסרונות. משקל רקמות ונורמליזציה טובה היא פשוטה ופשוטה. הבדלים בגודל האדיפוציט יכולים לגרום לכך שרקמת שומן רזה מכילה הרבה יותר אדיפוציטים לגרם מרקמת שומן שמנה, בעוד שהבדלים ביעילות ההתמיינות יכולים לגרום להבדלים במספר האדיפוציטים לבאר. ניתן לחלץ שומנים באמצעות ממיסים אורגניים (למשל, כלורופורם ביחס 2:1:מתנול [v/v]) ותכולת טריגליצרידים נמדדת באמצעות מגיב קולורימטרי. בעוד נורמליזציה לתכולת שומנים אינה שיטה בשימוש מסורתי, טיפות השומנים הן, אחרי הכל, האברון שעובר ליפוליזה, ושיטת נורמליזציה זו היא ספציפית לאדיפוציטים, אשר יכולים להיות שימושיים כאשר שיעורי התמיינות שונים בין תאים. לאחר מיצוי שומנים, 0.1-0.3 N NaOH ניתן להשתמש כדי לחלץ חלבון, אשר לאחר מכן ניתן לבדוק על ידי Bradford או BCA protein assay⁶⁸. לחלופין, הדגימות יכולות להיות הומוגניות בחיץ ליזיס, ואת החלק השומני להסיר על ידי צנטריפוגה⁷⁰. שימו לב שזיהום שומנים יפריע לבדיקות החלבון. אם רוצים להשתמש בחלבון לנורמליזציה, יש לשטוף את התאים באופן נרחב (לפחות שלוש פעמים) כדי להסיר BSA ממדיית הבדיקה. לעיתים, אדיפוציטים מובחנים אינם נצמדים היטב לצלחת ואינם סובלים את שלוש השטיפות הדרושות להסרת עודפי BSA. נורמליזציה לדנ”א מאפשרת נורמליזציה למספר התא, וניתן לבצע אותה באמצעות ערכת מיצוי DNA מסחרית, ואחריה כימות של הדנ”א הכולל על ידי ספיגה או ניתוח PCR בזמן אמת של מספר העתק הגן. לחלופין, בתאים מצופים, ניתן להשתמש בצביעה DAPI ואחריה הדמיה כדי לספור גרעינים ולנרמל למספר התא. כאשר מנרמלים באמצעות מספר תא או חלבון, חשוב לשקול תאים שאינם אדיפוציט בדגימה. רקמת השומן מכילה גם תאי חיסון ואנדותל; ברקמת שומן שמנה, דלקת והיפרטרופיה יכולות לגרום לכך שרק 1 מתוך 10 גרעינים מגיע מאדיפוציטים בוגרים. עם זאת, אדיפוציטים עדיין תורמים לרוב המסה ותכולת השומנים של הרקמה. עבור קדם-אדיפוציטים מובחנים במבחנה , יעילות ההתמיינות משפיעה על האחוז היחסי של אדיפוציטים בוגרים; כשזה המצב, הנורמליזציה מסובכת. באופן אידיאלי, יעילות ההתמיינות צריכה להיות אופטימלית לפני ניצול התאים לבדיקת ליפוליזה. אם הדבר אינו אפשרי, מומלץ לנרמל את תכולת השומנים אם נפח טיפת השומנים דומה בין אדיפוציטים מובחנים. השוואה של שיעורים ליפוליטיים בין תרביות אדיפוציטים עם דיפרנציאציה לא שוויונית יכולה להוביל למסקנות שגויות לגבי ליפוליזה כאשר הגורם המניע הוא למעשה אדיפוגנזה; זו מגבלה של הפרוטוקול.

FFAs בעלי שרשרת ארוכה מעכבים ליפוליזה ^{63,64,65,66,67}. FFAs מצטברים כאשר הם אינם מבודדים מספיק בתקשורת. חלק גדול מפתרון הבעיות הקשור לאופטימיזציה של מדידת ליפוליזה קשור למזעור שימור FFA. חישוב היחס המולרי של שחרור FFA:גליצרול למדיה מסייע לזהות בעיות הקשורות לשימור FFA. אם היחס המולרי הוא 3:1 עבור FFA:גליצרול, אז כל תוצרי הליפוליזה משתחררים ונלכדים בתקשורת, בעוד שיחס מתחת ל-2:1 הוא סיבה לדאגה. שיקול חשוב בבדיקות ex vivo הוא גודל גוש רקמת השומן. לגושים גדולים יותר של רקמה יש יחס נמוך יותר בין שטח הפנים לנפח, ולכן סביר יותר שהם ישמרו על FFAs ויציגו שיעורים ליפוליטיים מופחתים כתוצאה מכך (איור 4A,B). בהתחשב בכך, קריטי לחתוך את רקמת השומן עבור כל דגימה לגושים בגודל ובצורה עקביים. כדי להקל על תפיסת FFA בתקשורת, חשוב גם לוודא שהמדיה מכילה מספיק BSA כדי לקשור את ה- FFA ששוחרר. ניתן להגדיל את יכולת האגירה FFA של המדיה על ידי הגדלת הריכוז של BSA או הגדלת נפח המדיה. זה יעיל באותה מידה כדי להגדיל את נפח האוסף או תדירות. אם נבחנים בשיעורים ליפוליטיים גבוהים, אך יחסי FFA:גליצרול נמוכים מ-2:1, אנו ממליצים להגדיל את תדירות האיסוף לכל 30 דקות ולעצור את הבדיקה ב-2.5 שעות.

הפרוטוקול המסופק כאן מותאם לרקמת שומן לבן של עכבר ex vivo ולפרדיפוציטים ראשוניים המובחנים במבחנה, שניהם ליפוליטיים מאוד. הבדיקה צריכה להיות אופטימלית כדי למדוד ליפוליזה במערכות אחרות, או אם הבדלים בשיעור הבסיס הנמוך יחסית של ליפוליזה מעניינים במיוחד. לדוגמה, לאדיפוציטים 3T3-L1 יש פעילות ליפוליטית נמוכה יותר³². כאשר הקצב הליפוליטי נמוך, יש להקטין את נפח הדגירה (כלומר, במקום 400 μL לבאר בצלחת של 24 בארות, יש להשתמש ב-200 μL בצלחת של 24 בארות, או 300 μL בצלחת של 12 בארות, ו-100-150 μL שנאספו בכל נקודת זמן. נפח האיסוף לא אמור לרדת מתחת ל-100 מיקרוליטר, מכיוון שנדרשים נפחי דגימה גדולים יותר כדי למדוד במדויק רמות FFA וגליצרול נמוכות. כדי להעריך גליצרול באמצעות 50 μL של מדיה לדגימה, מגיב גליצרול חופשי צריך להיות מומס 31 מ”ל של מים, ו 150 μL של מגיב בשימוש עם 50 μL של דגימה בכל באר. רמות FFA ניתן למדוד עם 25 μL של מדגם לכל באר, אולי יותר, כל עוד ליניאריות נשמרת. ניתן גם להרחיב נקודות זמן כדי להגביר את האות. כאשר מקצים שיעורים ליפוליטיים מתאים שאינם אדיפוציטים לבנים, יש לקחת בחשבון הבדלים בחילוף החומרים התאי. לדוגמה, אדיפוציטים חומים ובז’ מבטאים רמות גבוהות בהרבה של גליצרול קינאז, ולכן מסוגלים לשמור על שחרור גליצרול על ידי ליפוליזה^76,77. תאים פעילים מטבולית אלה עשויים גם להיות מסוגלים לתעל חומצות שומן משוחררות למסלולים קטבוליים או סינתטיים ללא שחרור לתקשורת. יש לקחת בחשבון את הגורל המטבולי של FFA וגליצרול בסוג התא הספציפי הנבדק בעת פירוש התוצאות של בדיקת ליפוליזה, במיוחד בסוג תא שאינו אדיפוציט לבן. בדיקות ליפוליזה בסוגי תאים אחרים צריכות להיות ממוטבות ומאומתות.

פרוטוקול זה נועד להעריך הבדלים בקצב הליפוליטי במודלים של עכברים. פרדיפוציטים ראשוניים ממוינים במבחנה הם כלי שימושי לחקר השפעות אוטונומיות של תאים של מניפולציות גנטיות או טיפולים תרופתיים באדיפוציטים. רקמת השומן, לעומת זאת, מכילה סוגי תאים אחרים, כולל תאי מערכת החיסון. חשוב לקחת בחשבון את ההשפעה של תאי מערכת החיסון של רקמת השומן בוויסות הליפוליזה בעת הערכת ליפוליזה של רקמה שלמה. מודלים של ליפוליזה של אדיפוציט בתרבית עשויים לעקוף את ההשפעה המסבכת הפוטנציאלית של תאי מערכת החיסון ולאפשר חקירה יסודית של סוגי התאים הספציפיים, בעוד שצמחי רקמת השומן מאפשרים השוואה חזקה יותר לסביבה in vivo . בנוסף, ניתן להשתמש בבדיקת ex vivo כדי לחקור שיעורים ליפוליטיים במחסני שומן שונים. במערכות אלה, ליפוליזה מגורה על ידי תרכובות כגון אגוניסטים לקולטן β-אדרנרגי, ולכן כל שינוי בטון הסימפתטי שעשוי להשפיע על מודל העכבר in vivo לא ייצפה. מדידת In vivo של ליפוליזה מסובכת על ידי הדינמיקה של שחרור FFA וגליצרול וספיגה ברקמות שונות בכל הגוף. רמות FFA וגליצרול בסרום בכל נקודת זמן נתונה הן מאזן ההפרשה והקליטה, ואין להניח כי שינויים ברמות FFA וגליצרול בסרום מיוחסים אך ורק לליפוליזה של רקמת השומן. ליפוליזה הנגרמת על ידי צום מושפעת על ידי טונוס סימפתטי, אך אינה מייצרת שינויים מהירים וחזקים ברמות FFA או גליצרול בסרום, מה שמקשה על פירוש שינויים ברמות FFA וגליצרול בסרום בצום. ניתן לגרות ליפוליזה In vivo באמצעות אגוניסט לקולטן אדרנרגי β-3, כגון CL-316,243, וניתן לזהות FFA וגליצרול מוגברים בסרום תוך 20 דקות מהגירוי. בדיקות ליפוליטיות In vivo צריכות לכלול הן מדידות בסיסיות של FFA בסרום וגליצרול, כמו גם בקרת רכב; בדרך זו, ניתן לקבוע את השינוי הספציפי לגירוי ברמות FFA וגליצרול בסרום.

Materials

24-Well tissue culture treated plate	Corning Inc	3527	Must be tissue culture treated for adipocyte differntiation
48-Well flat bottom plate with lid	Corning Inc	353078	Can be tissue culture treated
6-Well flat bottom plate with lid	Corning Inc	353046	Can be tissue culture treated
96-Well PCR Plate	USA sceintific	1402-9100	Any conical 0.2 mL PCR plate will be convenient 
Bovine Serum Albumin	Sigma Aldrich	A9418	FFA free BSA such as A8806, is also commonly used. The BSA should not have detectable FFA, also lot to lot variations in BSA can impact the observed rate of lipolysis
CL-316,243	Sigma Aldrich	C5976	CAS #: 138908-40-4 availaible from other suppliers
CO2 incubator	PHCBI	MCO-170AICUVH	CO2 should ideally be set to 10% for adipose tissue, however 5% CO2 will also work
DMEM, low glucose, no phenol red	Thermofischer	11054020	Any phenol red free media should work, DMEM/F12, RPMI, but should contain volatile buffering capacity, i.e. biocarbonate
FFA-free Bovine serum albumin	Equitech-Bio, Inc, 	BAH66
Free Glycerol Reagent	Sigma Aldrich	F6428
Glycerol Standard Solution	Sigma Aldrich	G7793 	This can also be made by diluting glycerol to the desired concentration
HR Series NEFA Standard Solution	Fujifilm	276-76491
HR Series NEFA-HR (2) Color Reagent A	Fujifilm	999-34691
HR Series NEFA-HR (2) Color Reagent B	Fujifilm	991-34891
HR Series NEFA-HR (2) Solvent A 	Fujifilm	995-34791
HR Series NEFA-HR (2) Solvent B 	Fujifilm	993-35191
Microbiological Incubator	Fischer Scientific	S28668	Any incubator at 37C can be used
Nunc MicroWell 96-Well Plates	Thermo Scientific	269620	Any optically clear, flat bottom 96-well plate works
Silicone Laboratory Benchtop Mat	VWR	76045-300	Glass plate can also be used. Absorbant surfaces are not recommended
Spectrophotometer/Microplate Reader	Molecular devices	SpectraMax i3x 	Any plate reader that can read at 540, 550 and 660 mm will work
V Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	810531
WypAll X70 Wipers	Kimberly-Clark	41200	Any high quality paper towel will work