מאמר שיטה

פלטפורמת עכבה חשמלית מבוססת תאים להערכת מעכבי נגיף זיקה בזמן אמת

DOI:

10.3791/65149

⸱

24 במרץ 2023

 ,  , 
1Department of Microbiology, Immunology and Transplantation, Rega Institute for Medical Research, Laboratory of Virology and Chemotherapy, KU Leuven

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מדגימים את השימוש בעכבה חשמלית מבוססת תאים (CEI) כשיטה קלה ופשוטה מאוד לחקר זיהום ושכפול נגיף זיקה בתאים אנושיים בזמן אמת. יתר על כן, בדיקת CEI שימושית להערכת תרכובות אנטי-ויראליות.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טכנולוגיית עכבה חשמלית מבוססת תאים (CEI) מודדת שינויים בעכבה הנגרמים על ידי חד-שכבה של תא דבק גדל או שעבר מניפולציה על בארות לוחות תרבית המשובצות באלקטרודות. הטכנולוגיה יכולה לשמש לניטור ההשלכות של זיהום נגיף זיקה (ZIKV) ושכפול תאים דבקים בזמן אמת, שכן וירוס זה הוא ציטופתוגני מאוד. זוהי בדיקה פשוטה שאינה דורשת שימוש בתוויות או בשיטות פולשניות ויש לה את היתרון של מתן נתונים בזמן אמת. הקינטיקה של זיהום ZIKV תלויה מאוד בקו התא המועסק, בזן הנגיף ובריבוי הזיהום (MOI), שלא ניתן לחקור בקלות באמצעות מבחני נקודות קצה קונבנציונליים. יתר על כן, בדיקת CEI יכולה לשמש גם להערכה ואפיון של תרכובות אנטי-ויראליות, שיכולות להיות בעלות תכונות מעכבות דינמיות במהלך ההדבקה. מאמר שיטות זה נותן הסבר מפורט על הביצוע המעשי של בדיקת CEI ויישומיה הפוטנציאליים במחקר ZIKV ובמחקר אנטי-ויראלי בכלל.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

התפרצויות נגיף זיקה (ZIKV) קשורות לסיבוכי מחלה חמורים, כגון מיקרוצפליה ותסמונת גיליאן-בארה 1,2,3. למרות שמגיפות עתידיות סבירות בשל גורמי סיכון שונים כגון הפצת וקטורי יתושים והגברת העיור, עד כה, שום חיסון או תרופה אנטי ויראלית עדיין לא הגיע לשוק 3,4. לכן, שיטות מחקר ZIKV מסורתיות יש להשלים עם כלים חדשניים כדי לחקור את הנגיף הזה ואת תרכובות אנטי ויראליות פוטנציאליות שלה. מחקר אנטי-ויראלי מבוסס לעתים קרובות על בדיקות פנוטיפיות, כאשר נקודת הקצה היא נוכחות של פרמטר מסוים, כגון הופעת אפקט ציטופתי המושרה על ידי וירוס (CPE) או ייצור של חלבון מסוים המושרה על ידי וירוס באמצעות גן כתב 5,6,7. עם זאת, שיטות אלה יש קריאות נקודות קצה, הם עתירי עבודה, ועשויים לדרוש ניתוח מורכב. לכן, שיטות מבוססות עכבה מציעות אלטרנטיבה אטרקטיבית.

עכבה חשמלית מבוססת תאים (CEI) מוגדרת כהתנגדות לזרימת זרם מאלקטרודה אחת לאחרת, הנגרמת על ידי שכבת תא דבקה שנזרעה על בארות המכילות אלקטרודות. טכנולוגיית CEI המבוססת המשמשת במתודולוגיה זו היא Electric Cell-Substrate Impedance Sensing (ECIS), שפותחה במקור על ידי Giaever ו- Keese 8,9. זה משמש בתחום רחב של תחומי מחקר ביולוגיים, כגון גרורות סרטן, טוקסיקולוגיה, ריפוי פצעים10,11,12. העיקרון שלה מסתמך על שדה חשמלי שנוצר על ידי טאטוא מתמשך של מתחי זרם חילופין (AC) על פני טווח של תדרים13. התאים חשופים לשדות חשמליים לא פולשניים אלה, ובמרווחי זמן קבועים מראש נמדדים שינויי העכבה הנגרמים על ידי גדילת תאים או שינויים בהיצמדות התא או במורפולוגיה14. יתר על כן, שינוי בכדאיות התא מוביל גם לשינויים בעכבה, מה שהופך את הטכנולוגיה לכלי שימושי לניטור זיהום בנגיפים ציטופתוגניים15,16,17. מכיוון ששינויים מורפולוגיים של שכבת התא יתגלו בטווח הננומטרי, הטכנולוגיה מציעה כלי זיהוי רגיש ביותר. בדיקת CEI המתוארת במאמר זה היא שיטה קלה, לא פולשנית, בזמן אמת וללא תוויות למדידת שינויי העכבה של שכבת התא לאורך זמן.

למרות CEI לא שימש כדי להעריך את מהלך זיהום ZIKV או האנטי ויראלים הפוטנציאליים שלה, השימוש בו ככלי אבחון נחקר לפני18. במחקר שנערך לאחרונה, השימוש בבדיקת CEI כדי לקבוע את הפעילות האנטי-ויראלית של מספר מעכבי ZIKV בתאי A549 אומת לראשונה19. מאמר שיטות זה מתאר בדיקת CEI זו בפירוט רב יותר ומרחיב אותה לקווי תאים דבקים שונים, כמו גם למגוון זני ZIKV בהכפלות שונות של זיהום (MOI). בזאת, השימוש הרב-תכליתי בשיטה זו במחקר אנטי-ויראלי flavivirus מודגם. לשיטה יש את היתרון המכריע של ניטור תאים בזמן אמת, המאפשר זיהוי נקודות זמן חשובות של זיהום ופעילות מעכבת דינמית על ידי תרכובות אנטי-ויראליות פוטנציאליות. יחד, טכנולוגיית CEI מציעה כלי רב עוצמה ובעל ערך המשלים את המגוון הנוכחי של מתודולוגיות אנטי-ויראליות.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל השלבים המתוארים מתבצעים בתנאים סטריליים בארון זרימה למינרי של מעבדה ברמת בטיחות ביולוגית 2. כל הנגיפים המשומשים הושגו ושימשו כפי שאושרו, על פי הכללים של ועדת בדיקה מוסדית בלגית (Departement Leefmilieu, Natuur en Energie, protocol SBB 219 2011/0011) וועדת הבטיחות הביולוגית ב- KU Leuven.

1. תחזוקת תרבית תאים

הערה: פרוטוקול זה מבוצע עם מבחר קווי תאים, אך ניתן כמובן להתאים אותו לכל קו תאים דבק, הדורש רק אופטימיזציה של צפיפות זריעת תאים.

  1. גדל את קו תאי אדנוקרצינומה של הריאה האנושית A549, את קו תאי הגליובלסטומה הממאירים האנושיים U87, ואת תאי פיברובלסט הריאה העוברית האנושית HEL 299 בצלוחיות תרבית T75 בטמפרטורה של 37°C ו-5% CO2 באינקובטור לח.
  2. תת-תרבית התאים במפגש של 80%-95%. כל הריאגנטים צריכים להיות בטמפרטורת החדר (RT) לפני תרבית התאים.
  3. הסר את מדיום התרבית המותנה מהתאים. השתמש 5 מ"ל של מלח פוספט חוצץ של Dulbecco (DPBS) כדי לשטוף את monolayer התא פעם אחת.
  4. יש לפזר 1 מ"ל של 0.25% חומצה טריפסין-אתילאנדיאמיןטטראצטית (EDTA) באופן שווה על חד-שכבתי התא. לאחר מכן, לדגור עד 3 דקות ב 37 ° C עד התאים מתחילים להתנתק.
  5. הוסף 9 מ"ל של מדיום גידול מלא טרי (ראה טבלת חומרים לפרטים). פיפט בעדינות למעלה ולמטה כדי להשהות מחדש את התאים.
  6. העבירו את הנפח הרצוי של תרחיף התאים לבקבוק תרבית T75 חדש והוסיפו נפח מתאים של מדיום גידול טרי לקבלת נפח כולל של 15 מ"ל.
    הערה: קווי התאים במבחנה המשמשים בפרוטוקול זה מתורבתים בדילול של 1:4 עד 1:10, בהתאם לקו התאים הספציפי, כדי לאפשר תנאי גידול אידיאליים. תת-תרביות מבוצעות כל 3-4 ימים, כך שנפח תרחיף התאים הרצוי יכול להשתנות גם בהתאם למספר ימי הדגירה.

2. הכנת צלחת CEI

  1. קחו צלחת של 96 בארות עם אלקטרודות בין-ספרתיות (ראו טבלת חומרים) ומלאו את כל הבארות ב-100 מיקרוליטר של מדיום תרבית גידול.
  2. מלא את החללים בין הבארות עם DPBS.
    הערה: זה נעשה כדי להפחית את אפקט הקצה עקב אידוי שנצפה בעת גידול תאים בלוחות 96 באר.
  3. לדגור על הצלחת במשך 4 שעות ב 37 ° C באינקובטור עם 5% CO2.

3. זריעת תאים

  1. נתקו את התאים מבקבוק התרבית, כמתואר בסעיף 1, והשעו אותם מחדש במצע גידול טרי בצינור של 50 מ"ל.
  2. ספור את מספר התאים בני קיימא באמצעות שיטת הבחירה.
    הערה: במקרה של תאי A549, הכדאיות מגיעה בדרך כלל ל~100%. כדי לקבוע את מספר התא, אנו משתמשים במערכת אוטומטית לניתוח תאים המבוססת על צביעת תפוז אקרידין/פרופידיום יודיד (ראה טבלת חומרים). שיטות אחרות לספירת תאים פועלות באותה מידה.
  3. השהה מחדש את התאים במדיום גידול טרי כדי להשיג את צפיפות התאים הרצויה. במחקר זה, צפיפות התאים האופטימלית של A549 היא 0.15 × 106 תאים (בני קיימא) / מ"ל.
  4. קח את צלחת 96 באר עם אלקטרודות interdigitated מתוך האינקובטור ולהסיר את המדיום עם pipet רב ערוצי.
  5. הפק 100 μL של השעיית התא (המקביל ל 15 × 103 תאים במקרה זה) לכל באר בצלחת 96 באר.
  6. אפשר לתאים להתאזן למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר לפני הכנסתם להתקן CEI.

4. הגדרה והפעלה של בדיקת CEI

  1. מקם את האינקובטור המאכלס את מחזיק לוחית המכשיר CEI ב 37 ° C ו 5% CO2.
  2. הניחו את צלחת 96 הבארות במכשיר.
  3. פתח את תוכנת ההתקן והגדר ניסוי חדש על-ידי לחיצה על הגדרה בחלונית איסוף נתונים. המתן עד שהמחשב הנייד יתחבר להתקן ECIS והגדר את הצלחת על ידי בדיקת עכבות הבארות. בדוק אם כל הבארות מוגדרות כראוי, כפי שמצוין על ידי צבע ירוק. אם לא, חזור על שלב 4.2 עד שכל הבארות יהיו ירוקות.
  4. בחלונית Well Configuration, בחר את סוג המערך, בהתאם לתוכנת התרבות המשומשת.
  5. בחר מצב תדירות/זמן מרובים.
    הערה: במצב זה, ההתקן מודד שינויי עכבה במגוון תדרים.
  6. התחל את המדידה על-ידי לחיצה על התחל.
    הערה: ניתן לנטר עכבה בזמן אמת בממשק התוכנה. בחר את התדר הרצוי שיוצג. בדוגמה זו, נבחר 16 קילוהרץ.

5. הכנת תרכובת ודגירה

הערה: כדוגמה לתרכובת אנטי-ויראלית, משתמשים ב-labyrinthopeptin A1 (ראו טבלת חומרים). מאחר שניתן להכליל פרוטוקול זה לכל התרכובות בעלות הפעילות האנטי-ויראלית הפוטנציאלית, אנו מכנים אותו "התרכובת".

  1. אפשר מדיום תרבית תאים שלם ללא תוספת של סרום בקר עוברי (FBS) (המכונה 'חיץ בדיקה') כדי לאזן ב- RT.
  2. שמרו את התרכובות על קרח.
  3. הכינו דילול מרוכז פי 10 של כל תרכובת במדיום בדיקה בצינורות פוליפרופילן 5 מ"ל.
  4. לדלל באופן סדרתי את התרכובות במדיום הבדיקה בצינורות פוליפרופילן 5 מ"ל כדי להשיג את הריכוזים הרצויים פי 10.
  5. השהה את התקן CEI על-ידי לחיצה על השהה בחלונית הגדרת איסוף נתונים. המתן להשלמת נקודת הזמן הנוכחית והוציא את צלחת 96 הקידוחים.
  6. ודא את ההיצמדות ואת היווצרות monolayer של התאים תחת מיקרוסקופ אור.
  7. מוציאים 20 μL מכל באר עם צינור רב ערוצי.
  8. הוסף 20 μL של פתרון מורכב או רכב בבארות הרצוי. הכינו פריסה עם התנאים הספציפיים לצנרת נכונה.
  9. לדגור על הצלחת במשך 15 דקות ב 37 ° C עם 5% CO2.
    הערה: אינקובטור תאים רגיל משמש לשלב דגירה זה במקום התקן CEI. בארות בקרת תאים (CC) הן בארות מטופלות ברכב.

6. הכנת וירוסים והדבקה

  1. הפשירו בקבוקון של מלאי וירוסים. בדוגמה זו, נעשה שימוש ב- ZIKV MR766 וב- ZIKV PRVABC59.
  2. הכן דילול וירוסים ב- MOI הרצוי או דילולים במדיום הבדיקה בצינור פוליפרופילן 15 מ"ל.
    הערה: בדוגמה מייצגת זו, נעשה שימוש ב- MOI 0.5, 0.1, 0.05, 0.01, 0.005, 0.001, 0.005 ו- 0.00005.
  3. הוסף 100 μL של דילול וירוס בבארות שהוקצו של צלחת באר 96. הוסף מדיום בדיקה לבארות CC.
  4. לטהר את מיכלי הנגיף המועסקים.
  5. החזיר את הלוח להתקן CEI והמשך את המדידות במשך 6 ימים רצופים על-ידי לחיצה על חדש ניסוי.
    הערה: בארות בקרת וירוסים (VC) הן תאים נגועים המטופלים ברכב, בעוד שבבארות CC, מתווסף מדיום בדיקה במקום דילול וירוסים. אם ציטוטוקסיות של תרכובות מוערך, להוסיף 100 μL של מאגר הבדיקה במקום דילול וירוסים.

7. ניתוח נתונים

  1. סיים את הניסוי על-ידי לחיצה על סיום והוסף הערות סיכום אופציונליות, כגון מידע אודות תנאי הניסוי הספציפיים בחלון המופיע. לחץ על אישור לאחר השלמת איסוף הנתונים.
  2. בחרו את התדירות הרצויה בחלונית Graph שבה נמדד הפרש העכבה הגדול ביותר בין CC ל-VC בסוף הניסוי.
    1. כדי לקבוע את התדירות הטובה ביותר, הפעל ניסוי פיילוט עם תאים לא נגועים ונגועים ובחר את התדירות שבנקודת הזמן שבה העכבה של התאים הנגועים ירדה לרמה הבסיסית שלה - מובילה להפרש העכבה הגדול ביותר שנצפה בין התאים הלא נגועים והנגועים. במקרה של תאי A549 נגועים ZIKV, זה 16 קילוהרץ.
  3. כדי לייצא את כל הנתונים בתבנית גיליון אלקטרוני, ודא שכל הבארות נבחרו בחלונית Well Configuration ולחץ על File | ייצוא נתונים | נתוני גרף.
  4. נרמל את הנתונים על ידי הפחתת ערך עכבת VC הממוצע שנמדד בסוף הניסוי מכל נקודות הנתונים וחילוק זה בערך עכבת CC הממוצע של נקודת הזמן האחרונה שנמדדה לפני ההדבקה.
  5. התווה את הנתונים המנורמלים בפונקציה של זמן כדי לקבל גרפים פרופיל CEI.
  6. חשב את האזור המנורמל מתחת לעקומה (AUCn) של כל תנאי כדי לקבוע פרמטרים כגון ריכוזים מעכבים של 50% (IC50).
  7. חשב פרמטרים שימושיים אחרים, כגון CIT50, כדי, למשל, להשוות את ההדבקה של זני וירוס שונים.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במאמר זה, השימוש בבדיקת CEI במחקר ZIKV מתואר בפירוט. זרימת העבודה של בדיקה זו מודגמת באיור 1. אנו מדגימים את הנוחות של ניטור בזמן אמת של זיהום ZIKV בסוג התא הרצוי, כמו גם הערכה של עיכוב זיהום על ידי תרכובת אנטי ויראלית. כדוגמה אנטי-ויראלית, אנו משתמשים בפפטיד labyrinthopeptin A1 (Laby A1); אנו מכנים זאת 'התרכובת', שכן תכונותיו הספציפיות חורגות מתחום מאמר שיטות זה ונידונות במקום אחר20,21. יש לציין כי יכולת השחזור של השיטה אינה נדונה בסעיף התוצאות, שכן אנו רוצים להתמקד בפרופילי העכבה האישיים המתקבלים באמצעות המתודולוגיה. עם זאת, זה תואר בעבר19.

בקבוצת הניסויים הראשונה אנו מדגימים את החשיבות של אופטימיזציה של צפיפות התאים בעת ביצוע בדיקות זיהום CEI (איור 2). כאשר יותר מדי תאים נזרעים, חד-שכבת התא תגדל במלואה ולא תוכל להמשיך להתפשט על פני אלקטרודות CEI. זה מוביל להבדל קטן יותר בין CC ו- VC, ולכן רזולוציה נמוכה יותר, מה שמקטין את חלון הזיהוי של פעילות אנטי ויראלית. זה מודגם היטב באיור 2E. עבור סוגי תאים גדולים מסוימים, כמו למשל תאי U87, זריעה צפופה מדי של תאים עשויה אפילו להוביל לניתוק מוחלט של חד-שכבה של התא בעת מניפולציה של הצלחת, כפי שמודגם כאן (איור 2F). זה נצפה גם מיקרוסקופי.

איור 2 גם מדגים שהבדיקה שימושית מאוד לביצוע מחקרי רגישות לתאים. ברור מאיור 2A,B שהקינטיקה של הזיהום תלויה מאוד בסוג התא. איור 2C מדגים שתאי U87 רגישים לזיהום ZIKV רק ברמות MOI גבוהות.

בקבוצת הניסויים השנייה, השימוש הרב-תכליתי בבדיקת זיהום CEI מודגש באמצעות זני ZIKV שונים ב-MOI שונים ובנוכחות תרכובת אנטי-ויראלית מתוארת היטב (איור 3). ניסויים אלה מבוצעים עם תאי A549, מודל נפוץ במחקר flavivirus22,23. קו תאים זה שימש גם במחקרים אחרים שהוכיחו את התאמתו במבחני CEI24. ראשית, קינטיקה של זיהום על ידי זן ZIKV מייצג של השושלת האפריקאית MR766, מושווים לאלה של השושלת האסיאתית PRVABC59. איור 3A מדגים שלשני הזנים יש דפוסי CEI דומים, כאשר ל-PRVABC59 יש תכונות מעט איטיות יותר של השראת CPE. זה משתקף גם על-ידי ערכי CIT50 (איור 3B). פרמטר מעניין זה הוצג לראשונה על ידי Fang et al.16 ולוקח בחשבון את הקינטיקה של מדידות CEI. הוא מוגדר כזמן הדרוש כדי להפחית את העכבה ב -50% בהשוואה לבקרת התא.

לאחר מכן, התאים היו נגועים בשלושה MOI שונים של ZIKV MR766 או PRVABC59, בנוכחות או היעדר ריכוזי תרכובות שונות, ופרופילי העכבה נוטרו. כפי שניתן לראות באיור 3C-H, ריכוזי תרכובות מסוימות מעכבים או מעכבים את ירידת העכבה הנגרמת על-ידי זיהום ZIKV. הדבר משתקף גם בעת חישוב ערכי AUC. תוצאות בדיקת CEI גם מראות חזותית כי הפעילות האנטי-ויראלית תלויה במשרד הפנים ובנקודת הזמן של הערכת העוצמה. ניתן להשתמש בחישובי AUCn כדי לקבוע ערכי IC50, כפי שמודגם באיור 3I. לבסוף, איור 3H מראה שניתן להשתמש בערכי CIT50 גם כדי לקבוע ולהשוות עוצמות מורכבות. תרכובות לא פעילות או ריכוזי תרכובות מאופיינים בפרופילי CEI, AUC ו- CIT50 ערכים דומים לאלה של VC.

figure-results-1
איור 1: סקירה סכמטית של זרימת העבודה של הבדיקה. ציר הזמן ושלבי הטיפול והדגירה השונים של בדיקת CEI מתוארים כאן. קיצורים: CEI = עכבה חשמלית מבוססת תאים; ZIKV = נגיף זיקה; D = ימים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: פרופילי CEI מנורמלים של תאים נגועים ב-ZIKV בצפיפויות שונות. (A,D) A549, (B,E) HEL 299, או (C,F) תאי U87 נזרעו ב-(A-C) 15,000-20,000 ("אופטימלי") או (D-F) 75,000 תאים ("תת-אופטימליים") לכל באר בלוח CEI של 96 בארות. לאחר 24 שעות של ניטור עכבה, התאים היו נגועים בדילול MOI פי עשרה של ZIKV MR766. העכבה נוטרה במשך 5 ימים רצופים. פרופילי CEI (טווח ממוצע ± של שני עותקים טכניים) של ניסוי מייצג מוצגים. קיצורים: CEI = עכבה חשמלית מבוססת תאים; MOI = ריבוי זיהום; ZIKV = נגיף זיקה; נורמה = מנורמל. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: פרופילי CEI מנורמלים של תאי A549 לאחר הדבקה בשני זני ZIKV ועיכוב על-ידי תרכובת אנטי-ויראלית. (A) תאי A549 דבקים היו נגועים ב-MOI שונים של ZIKV MR766 או ZIKV PRVABC59, והעכבה נוטרה ברציפות. מוצג ממוצע ± SD של שלושה שכפולים טכניים של ניסוי מייצג. (B) ערכי CIT50 חושבו בהתבסס על פרופיל CEI של A והושוו. מוצג SD ממוצע ± של שלושה עותקים טכניים שבוצעו. (ג-ח) תאי A549 דבקים טופלו בריכוזי תרכובות שונות ולאחר מכן נדבקו ב-MOI ספציפי של ZIKV MR766 (C-E) או ZIKV PRVABC59 (F-H). העכבה נוטרה באופן רציף. מוצג טווח ± ממוצע של שני שכפולים טכניים של ניסוי מייצג. (I) כדי להשוות עיכוב מורכב כנגד זנים ודילולים שונים של ZIKV, חושב AUC n, ואחוזי העיכוב נקבעו על ידי חיסור כל התנאים על ידי CC AUC n וחלוקה על ידי VC AUC n. (J) ערכי CIT50 של הניסוי המוצג ב-C-H חושבו כדי להשוות בין זני ZIKV השונים לבין MOI. מוצג טווח ± ממוצע של שני עותקים משוכפלים טכניים. קיצורים: CEI = עכבה חשמלית מבוססת תאים; MOI = ריבוי זיהום; ZIKV = נגיף זיקה; נורמה = מנורמל; CIT 50 = הזמן שבו העכבה ירדהב-50% ביחס לבקרה לא מטופלת; AUC = שטח מתחת לעקומה; CC = בקרת תאים; VC = בקרת וירוסים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מאמר זה מתאר את השימוש בבדיקת CEI במחקר אנטי-ויראלי של ZIKV. לבדיקה יש את היתרון של ניטור בזמן אמת ולכן ניתן להשתמש בה כדי להעריך את הקינטיקה של זיהום ZIKV ועיכוב אנטי ויראלי עם תרכובות סלקטיביות. הנתונים המתקבלים בשיטה זו מאפשרים תצפית אובייקטיבית וויזואלית של CPE המושרה על ידי הנגיף ואת העוצמה של תרכובת אנטי ויראלית פוטנציאלית.

מכיוון ש- CEI היא שיטה רגישה מאוד, יש לנקוט בזהירות רבה בעת ביצוע בדיקה סלולרית זו. חשוב מאוד לבצע פיפטינג מדויק כדי להימנע ככל האפשר משינוי הפיפט. יתר על כן, גורמים אחרים שעשויים להשפיע על תוצאות הניסוי, כגון מספר תאים ומלאי נגיפי משומש, חייבים להישמר קבועים בין חזרות הניסוי. אלה הם גורמים המשפיעים מאוד על הקינטיקה של גדילת תאים וזיהום ולכן יכולים להוביל לשונות בערכי CIT50 מחושבים ו / או פרמטרים אחרים.

בעת ביצוע בדיקת CEI בנוכחות תרכובות אנטי-ויראליות (פוטנציאליות), חשוב לקבוע אם הן משפיעות על עכבת התאים בהיעדר וירוס. הטכניקה כל כך רגישה ששינויי עכבה עשויים להימדד הרבה מתחת לריכוזים ציטוטוקסיים של התרכובת19.

למרות שרק נתוני ZIKV מוצגים במאמר זה, ניתן ליישם את הבדיקה בקלות על וירוסים ציטופתוגניים (flavi) אחרים, עם מאמץ אופטימיזציה מינימלי בלבד, כגון קביעת תדירות ניטור CEI אופטימלית. התאמות של בדיקת CEI הופעלו עם וירוסים שונים של בני אדם ובעלי חיים, כגון chikungunya, שפעת A, ו הרפס אנושי סוסים25,26,27,28. כאן, הוא משמש גם כשיטה פשוטה לכימות של titers ויראלי או לזיהוי של תרכובות אנטי ויראליות. מחקרים אלה השתמשו בניתוח תאים בזמן אמת, שיטת CEI חלופית.

השימוש בטכנולוגיית CEI מוגבל לסוגי תאים דבקים, מכיוון שעקרון הבדיקה מסתמך על תכונות התאים הדבקים כדי להתפשט על פני הבארות המשובצות באלקטרודות. ובכן ציפויי פני השטח כגון פיברונקטין ניתן להשתמש כדי לשפר את חיבור התא29. למתודולוגיה יש כמה חסרונות אחרים, הראשון הקשור לעלותה. מלבד ההשקעה במכשיר הניטור CEI ובתוכנה הנלווית אליו, גם החומרים המתכלים יקרים במקצת. יתר על כן, מכיוון שהפרוטוקול דורש ניטור זיהום ויראלי במשך מספר ימים, ניתן להעריך צלחת אחת של 96 בארות בשבוע. יחד עם העלות הגבוהה, זה מגביל את השימוש להגדרות תפוקה נמוכה עד בינונית.

בגלל בעיות תפוקה אלה, הטכנולוגיה אינה מתאימה להגדרות סינון אנטי-ויראליות. עם זאת, הוא מושך מאוד בשלבי ניסוי ראשוניים, למשל, בעת הערכת רגישות התא לחקר זיהום ZIKV בסביבה מסוימת הקשורה למחלה. הטכנולוגיה שימושית גם עם קווי תאים נגועים או נוקאאוט כדי לצפות בקלות בשינויים בקינטיקה של זיהום, למשל, בנוכחות או היעדר קולטני כניסה מסוימים. זה מעניין כאשר חוקרים את המעורבות של גורמים תאיים בזיהום ZIKV. יתר על כן, בשלבים פרה-קליניים מאוחרים יותר, כאשר נבחר מועמד מוביל מסוים, ניתן להשתמש בבדיקת CEI לאפיון מעמיק יותר של תרכובת נבחרת. ניתן לשנות ביוסנסורים CEI גם על ידי השתקת רכיבי זיהוי ביולוגי מסוימים, כגון נוגדנים ספציפיים לנגיף, לזיהוי וירוסים18. בסך הכל, זה מדגיש את השימוש הרב-תכליתי של CEI בסביבה וירולוגיה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מאשרים כי אין ניגוד עניינים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מודים לקלמנט היימן ולגוריט לוטסמה על ההגהה של כתב היד. המחקר נתמך על ידי מענקים פנימיים של המעבדה לווירולוגיה וכימותרפיה (מכון רגה, KU Leuven).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
תאי A549אוסף תרבית מסוג אמריקאי (ATCC)CCL-185תאים אלה מתורבתים ב-MEM Rega-3 בתוספת 10% FBS, 2 מ"מ L-גלוטמין, 0.075% נתרן ביקרבונט.
Acridine Orange/Propidium Iodide StainLogos BiosystemsF23001Cellstar כתם חי/מת
, 15 מ"לגריינר ביו-אחד1,88,271
צינורות פוליפרופילן Cellstar, 50 מ"לגריינר ביו-אחד2,27,261
Dulbecco's Modified Essential Medium (DMEM)Gibco, Thermo Fisher Scientific41965-039מדיום תרבית תאים עבור U87 ו-HEL 299 תאים
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)Gibco, Thermo Fisher Scientific14190-094
ECIS cultureware 96W20idfApplied BioPhysics96W20idf PETלוחית בדיקה למכשיר CEI
חישת עכבה של מצע תא חשמלי (ECIS) תחנת מערך Zביופיזיקהיישומיתמכשיר CEI, כולל תחנת 96 בארות, מודול בקרה חיצוני ומחשב נייד עם תוכנת בקרה, רכישה ותצוגה. התוכנה הדרושה מותקנת לפני המשלוח. הערה: מכשיר זה יצא כעת מייצור והוחלף במכשיר ECIS Z-Theta המתקדם יותר
צינורות פוליסטירן פלקון, 5 מ"לקורנינג352054
סרום בקר עוברי (FBS)CytivaSV30160.03תוסף מדיום תרבית תאים לכל התאים המשומשים
HEL 299 תאיםATCCCCL-137תאים אלה מתורבתים ב-DMEM בתוספת 10% FBS ו-0.01 M HEPES.
מאגר HEPES, 1 MGibco, Thermo Fisher Scientific15630-056תוסף מדיום תרבית תאים לתאי U87
Labyrinthopeptin A1מתנה אדיבה מפרופ' ד"ר רודריך Sü ssmuth, האוניברסיטה הטכנית; t ברלין, גרמניהתרכובת אנטי-ויראלית המשמשת כדוגמה בפרוטוקול זה. הוא מומס ב-DMSO.
L-גלוטמין, 200 מ"מGibco, Thermo Fisher Scientific25030-024תוסף בינוני תרבית תאים לתאי A549
שקופיות ספירת תאי לונהLogos BiosystemsL12001
Luna-FL מונה תאי פלואורסנס כפולLogos BiosystemsL20001מונה כדאיות תאים
Minimum Essential Medium Rega-3 (MEM Rega-3)Gibco, Thermo Fisher Scientific19993013מדיום תרבית תאים לתאי A549
נתרן ביקרבונט, 7.5%Gibco, Thermo Fisher Scientific25080-060תוסף מדיום תרבית תאים לתאי A549
בקבוק תרבית רקמות T75TPPY9076
Trypsin-EDTA, 0.25%Gibco, Thermo Fisher Scientific25200-056מגיב דיסוציאציה
U87 תאיATCCHTB-14תאים אלה מתורבתים ב-DMEM בתוספת 10% FBS ו-0.01 M HEPES.
  טבליות Virkon Rely+OnLanxess115-0020תמיסת חומר חיטוי
וירוס זיקה (ZIKV) MR766ATCCVR-84זן אב טיפוס ZIKV, שבודד מקוף זקיף רזוס באוגנדה בשנת 1968
ZIKV PRVABC59ATCCVR-1843זן ZIKV שבודד מחולה בפורטו ריקו בשנת 2015
צינורות פוליפרופילן

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cao-Lormeau, V. M., et al. Guillain-Barré Syndrome outbreak associated with Zika virus infection in French Polynesia: a case-control study. Lancet. 387 (10027), 1531-1539 (2016).
  2. Mlakar, J., et al. Zika virus associated with microcephaly. The New England. Journal of Medicine. 374 (10), 951-958 (2016).
  3. Pierson, T. C., Diamond, M. S. The emergence of Zika virus and its new clinical syndromes. Nature. 560 (7720), 573-581 (2018).
  4. Pergolizzi, J., et al. The Zika virus: Lurking behind the COVID-19 pandemic. Journal of Clinical Pharmacy and Therapeutics. 46 (2), 267-276 (2021).
  5. Bernatchez, J. A., et al. Development and validation of a phenotypic high-content imaging assay for assessing the antiviral activity of small-molecule inhibitors targeting Zika virus. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 62 (10), e00725(2018).
  6. Zou, J., Shi, P. Y. Strategies for Zika drug discovery. Current Opinion in Virology. 35, 19-26 (2019).
  7. Mottin, M., et al. Discovery of new Zika protease and polymerase inhibitors through the open science collaboration Project OpenZika. Journal of Chemical Information and Modeling. 62 (24), 6825-6843 (2022).
  8. Giaever, I., Keese, C. R. Monitoring fibroblast behavior in tissue culture with an applied electric field. Proceedings of the National Academy of Sciences. 81 (12), 3761-3764 (1984).
  9. Giaever, I., Keese, C. R. A morphological biosensor for mammalian cells. Nature. 366 (6455), 591-592 (1993).
  10. Rahim, S., Üren, A. A real-time electrical impedance based technique to measure invasion of endothelial cell monolayer by cancer cells. Journal of Visualized Experiments. (50), e2792(2011).
  11. Szulcek, R., Bogaard, H. J., van Nieuw Amerongen, G. P. Electric cell-substrate impedance sensing for the quantification of endothelial proliferation, barrier function, and motility. Journal of Visualized Experiments. (85), e51300(2014).
  12. Li, X., et al. Hsp70 suppresses mitochondrial reactive oxygen species and preserves pulmonary microvascular barrier integrity following exposure to bacterial toxins. Frontiers in Immunology. 9, 1309(2018).
  13. Wegener, J., Keese, C. R., Giaever, I. Electric cell-substrate impedance sensing (ECIS) as a noninvasive means to monitor the kinetics of cell spreading to artificial surfaces. Experimental Cell Research. 259 (1), 158-166 (2000).
  14. Xu, Y., et al. A review of impedance measurements of whole cells. Biosensors and Bioelectronics. 77, 824-836 (2016).
  15. Pennington, M. R., Van de Walle, G. R. Electric cell-substrate impedance sensing to monitor viral growth and study cellular responses to infection with alphaherpesviruses in real time. mSphere. 2 (2), e00039(2017).
  16. Fang, Y., Ye, P., Wang, X., Xu, X., Reisen, W. Real-time monitoring of flavivirus induced cytopathogenesis using cell electric impedance technology. Journal of Virological Methods. 173 (2), 251-258 (2011).
  17. McCoy, M. H., Wang, E. Use of electric cell-substrate impedance sensing as a tool for quantifying cytopathic effect in influenza a virus infected MDCK cells in real-time. Journal of Virological Methods. 130 (1-2), 157-161 (2005).
  18. Stukovnik, Z., Bren, U. Recent developments in electrochemical-impedimetric biosensors for virus detection. International Journal of Molecular Sciences. 23 (24), 15922(2022).
  19. Oeyen, M., Meyen, E., Doijen, J., Schols, D. In-depth characterization of Zika virus inhibitors using cell-based electrical impedance. Microbiology Spectrum. 10 (4), e0049122(2022).
  20. Prochnow, H., et al. Labyrinthopeptins exert broad-spectrum antiviral activity through lipid-binding-mediated virolysis. Journal of Virology. 94 (2), e01471(2020).
  21. Oeyen, M., et al. Labyrinthopeptin A1 inhibits dengue and Zika virus infection by interfering with the viral phospholipid membrane. Virology. 562, 74-86 (2021).
  22. Vicenti, I., et al. Comparative analysis of different cell systems for Zika virus (ZIKV) propagation and evaluation of anti-ZIKV compounds in vitro. Virus Research. 244, 64-70 (2018).
  23. Gobillot, T. A., Humes, D., Sharma, A., Kikawa, C., Overbaugh, J. The robust restriction of Zika virus by type-I interferon in A549 cells varies by viral lineage and is not determined by IFITM3. Viruses. 12 (5), 503(2020).
  24. Verma, N. K., Moore, E., Blau, W., Volkov, Y., Babu, P. R. Cytotoxicity evaluation of nanoclays in human epithelial cell line A549 using high content screening and real-time impedance analysis. Journal of Nanoparticle Research. 14, 1137(2012).
  25. Thieulent, C. J., et al. Screening and evaluation of antiviral compounds against Equid alpha-herpesviruses using an impedance-based cellular assay. Virology. 526, 105-116 (2019).
  26. Labadie, T., Grassin, Q., Batéjat, C., Manuguerra, J. -C., Leclercq, I. Monitoring influenza virus survival outside the host using real-time cell analysis. Journal of Visualized Experiments. (168), e61133(2021).
  27. Piret, J., Goyette, N., Boivin, G. Novel method based on real-time cell analysis for drug susceptibility testing of herpes simplex virus and human cytomegalovirus. Journal of Clinical Microbiology. 54 (8), 2120-2127 (2016).
  28. Zandi, K. A real-time cell analyzing assay for identification of novel antiviral compounds against chikungunya virus. Methods in Molecular Biology. 1426, 255-262 (2016).
  29. Ebrahim, A. S., et al. Functional optimization of electric cell-substrate impedance sensing (ECIS) using human corneal epithelial cells. Scientific Reports. 12 (1), 14126(2022).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

IC50

מאמרים קשורים