הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

בידוד, תרבית ואפיון פיברובלסטים עוריים ראשוניים מרקמת קלואיד אנושית

4.5K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/65153

⸱

28 ביולי 2023

 ,  ,  ,  ,  , 
1Dermatology Hospital, Southern Medical University

במאמר זה

סיכום

מחקר זה מתאר פרוטוקול אופטימלי לביסוס פיברובלסטים ראשוניים מרקמות קלואידיות שיכולים לספק פיברובלסטים טהורים ויציבים ביעילות ובהתמדה.

תקציר

פיברובלסטים, סוג התא העיקרי ברקמת קלואיד, ממלאים תפקיד חיוני בהיווצרות והתפתחות קלואידים. הבידוד והתרבית של פיברובלסטים ראשוניים שמקורם ברקמה קלואידית הם הבסיס למחקרים נוספים על הפונקציה הביולוגית והמנגנונים המולקולריים של קלואידים, כמו גם אסטרטגיות טיפוליות חדשות לטיפול בהם. לשיטה המסורתית להשגת פיברובלסטים ראשוניים יש מגבלות, כגון מצב תאי ירוד, ערבוב עם סוגים אחרים של תאים ורגישות לזיהום. מאמר זה מתאר פרוטוקול ממוטב וקל לשחזור שיכול להפחית את התרחשותן של בעיות אפשריות בעת השגת פיברובלסטים. בפרוטוקול זה, ניתן לצפות בפיברובלסטים 5 ימים לאחר הבידוד ולהגיע לכמעט 80% מפגש לאחר 10 ימי תרבית. לאחר מכן, הפיברובלסטים עוברים ומאומתים באמצעות נוגדני PDGFRα ווימנטין לבדיקות אימונופלואורסנציה ונוגדני CD90 לציטומטריית זרימה. לסיכום, פיברובלסטים מרקמה קלואידית ניתן לרכוש בקלות באמצעות פרוטוקול זה, אשר יכול לספק מקור שופע ויציב של תאים במעבדה למחקר קלואיד.

מבוא

קלואיד, מחלה פיברופרוליפרטיבית, מתבטאת בצמיחה מתמשכת של פלאקים שלעתים קרובות פולשים לעור הרגיל שמסביב ללא הגבלה עצמית וגורמים לדרגות שונות של גירוד, כאב ונטל קוסמטי ופסיכולוגי לחולים1. פיברובלסטים, התאים העיקריים המעורבים בקלואידים, ממלאים תפקיד חיוני בהיווצרות ובהתפתחות של מחלה זו באמצעות התרבות יתר, ייצור מטריצות חוץ-תאיות מיותרות וקולגןלא מאורגן 2,3. עם זאת, הפתוגנזה הבסיסית נותרה לא ברורה, ושיטה טיפולית יעילה לקלואיד עדיין חסרה; לכן, יש צורך דחוף במחקר נוסף 4,5.

מכיוון שאין מודל אידיאלי בבעלי חיים למחקר קלואיד in vivo 6,7, בניית מודל במבחנה על ידי רכישת פיברובלסטים ראשוניים מרקמות קלואידיות יכולה להציע היתכנות ואמינות למחקר קלואיד 2,6. תאים ראשוניים הם אלה שמקורם ישירות ברקמה חיה, וידוע בדרך כלל כי תאים אלה יכולים להידמות יותר למצב הפיזיולוגי ולרקע הגנטי של אנשים רבים בהשוואה לשורות תאים 8,9. טיפוח תאים ראשוניים מספק אמצעי רב עוצמה לחקר הצמיחה והמטבוליזם של תאים, כמו גם פנוטיפים אחרים של תאים.

כיום, ישנן שתי שיטות לרכישת פיברובלסטים ראשוניים: עיכול אנזימים ותרבית צמחים. עם זאת, זוהו מספר מכשולים להשגת פיברובלסטים ראשוניים, כגון הסיכון לזיהום על ידי חיידקים או פטריות שונים, ערבוב עם סוגים אחרים של תאים שאינם מוסרים בקלות, התקופה הארוכה של מחזור התרבית, השינויים הבאים במאפייני התא בהשוואה לתאים המקוריים, וכן הלאה9. לכן, פיתוח תהליך אפשרי ויעיל להשגת פיברובלסטים ראשוניים הוא הבסיס למחקרים ויישומים נוספים. מחקר זה מתאר פרוטוקול אופטימלי לחילוץ פיברובלסטים ראשוניים מרקמות קלואידיות שיכולים לספק פיברובלסטים טהורים ויציבים ביעילות ובהתמדה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

מחקר זה אושר על ידי ועדת הסקירה המוסדית של בית החולים לדרמטולוגיה, האוניברסיטה הרפואית הדרומית (2020081). הסכמה מדעת של המטופל התקבלה לפני איסוף הרקמות.

1. הכנה

הערה: יש לבצע את ההליכים הבאים בסביבה סטרילית תחת ארון בטיחות ביולוגי.

  1. הכינו מדיום תרבית שלם על ידי הוספת 10% סרום בקר עוברי (FBS) ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין-אמפוטריצין B תמיסת (PSA) לתמיסת Eagle medium (DMEM) בעלת גלוקוז גבוה של Dulbecco.
  2. הכינו תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS) עם PSA על ידי הוספת 1% PSA ל-1x PBS. הכן PBS עם FBS על ידי הוספת 1% FBS ל- 1x PBS.
  3. הכינו מספר מספריים, מלקחיים ואזמלים מעוקרים על ידי אוטוקלאבינג.

2. השגת רקמות שהוסרו

  1. להשיג רקמות מחולי קלואיד באמצעות ניתוח. אספו את רקמות הקלואיד הטריות בשקית אריזה סטרילית או בצינור צנטריפוגה סטרילי, והעבירו אותן לארון בטיחות ביולוגי במעבדה בהקדם האפשרי.
    הערה: בפרוטוקול זה, גודל הרקמה הקלואידית הנרכשת היה בערך ~ 20 x 20 x 10 מ"מ3, והגודל עשוי להשתנות בהתאם לניתוח.

3. בידוד

  1. הוציאו את הרקמה הקלואידית באמצעות פינצטה סטרילית, והניחו אותה בצינור צנטריפוגה סטרילי של 50 מ"ל המכיל 10-25 מ"ל PBS עם 1% PSA למשך 10 דקות. לאחר מכן, להכין צלחת 6 בארות, ולהוסיף 4 מ"ל של PBS בתוספת 1% PSA לכל באר. הוציאו את הרקמה באמצעות פינצטה מעוקרת, ושטפו אותה פעמיים עם PBS בתוספת 1% PSA. באמצעות מלקחיים סטריליים, להעביר את הרקמה ברצף מבאר אחת לאחרת.
  2. הסר את שכבות השומן והאפידרמיס באמצעות מספריים כירורגיים או אזמל כירורגי, והשאר את שכבת הדרמיס ללא נגיעה. חותכים ומנתחים את שכבת הדרמיס ל 3-5 מ"מ2 חתיכות עם מספריים, מעבירים חתיכות אלה באמצעות מלקחיים סטריליים לבאר הבאה, ושוטפים אותם ב- PBS עם תמיסת PSA 1% שוב.

4. תרבות

  1. מניחים את חתיכות רקמת הדרמיס בצלחות פטרי באמצעות מלקחיים מעוקרים; ודא שמספר החתיכות הוא בין 10 ל -30 והמרחק בין כל חתיכה הוא >5 מ"מ. הניחו את צלחות הפטרי הפוכות באינקובטור 5% CO2 בטמפרטורה של 37°C למשך 30-60 דקות עד שחתיכות הרקמות מתייבשות מעט ונדבקות לצלחת הפטרי. לאחר מכן, להוסיף DMEM בתוספת 10% FBS ו 1% PSA, בזהירות להניח את צלחות פטרי לתוך אינקובטור 5% CO2 ב 37 ° C.
    הערה: פיברובלסטים הם אוכלוסיית תאים הטרוגנית מבחינה מורפולוגית ותפקודית. בהתחשב במורכבות זו, צעדי הבידוד והתרבות צריכים להתבצע בזהירות; בחר את חתיכות רקמת העור קלואיד באופן שווה, וערבב חתיכות אלה היטב לפני הנחתם בצלחת פטרי.
  2. לאחר 3 ימים, החליפו מחצית מהסופרנאטנט במדיום תרבית שלם. שנה את מדיום התרבות כל 2-3 ימים. צפו בפיברובלסטים תחת מיקרוסקופ בהגדלה של פי 40 בכל יום.
    הערה: יש לבצע את כל השלבים בעדינות. אל תזיזו את צלחת הפטרי במשך יומיים לאחר הבידוד, מכיוון שלוקח זמן לחתיכות הרקמה להיצמד לצלחות הפטרי.
  3. כאשר הפיברובלסטים הגדלים סביב חלקי הרקמה מגיעים לכ-90% התמזגות, הסר את פיסות הרקמה ואת מדיום התרבית. שטפו את הפיברובלסטים עם PBS 1x סטרילי, והוסיפו 2 מ"ל של תמיסת טריפסין-EDTA סטרילית 1x לצלחות. לדגור על התאים במשך כ~ 3-5 דקות ב 37 ° C באינקובטור לח 5% CO2 . טפחו בעדינות על צלחת התרבית, והתבוננו בה תחת מיקרוסקופ. כאשר רוב התאים מתנתקים מהצלחת, מוסיפים 2 מ"ל של מדיום שלם כדי לסיים את תהליך העיכול.
  4. מעבירים את מתלה התא לצינור צנטריפוגה סטרילי בנפח 15 מ"ל, וצנטריפוגות את הצינור בטמפרטורה של 300 × גרם למשך 3 דקות בטמפרטורת החדר. השליכו את הסופרנאטנט בזהירות, והשהו מחדש את כדורית התא בתווך מלא. זרעו את הפיברובלסטים בצלחת תרבית תאים בקוטר 9 ס"מ, ודגרו בטמפרטורה של 37°C באינקובטור לח של 5%CO2 .

5. תחזוקה ושימור

  1. כעבור 3-4 ימים, כאשר הפיברובלסטים גדלו למפגש של 80%, חזרו על שלבים 4.2-4.4, ועברו את הפיברובלסטים ביחס של 1:3. השתמש בפיברובלסטים העוברים לניסויים נוספים.
    הערה: יש לעצור את תרבית הפיברובלסטים לאחר 10 מעברים, מכיוון שהתאים עשויים להתחיל להראות מאפיינים משתנים בהשוואה לתאים המקוריים.
  2. Cryoלשמר את התאים העוברים של P1-P3 בחנקן נוזלי לשימוש נוסף.
    1. חזור על שלבים 4.2-4.3. מעבירים את מתלה התא לצינור צנטריפוגה סטרילי בנפח 15 מ"ל, וצנטריפוגות את הצינור למשך 3 דקות ב-300 × גרם. השליכו את הסופרנאטנט בזהירות, השהו מחדש את גלולת התא ב-1 מ"ל של מדיום הקפאת תאים המכיל 90% FBS ו-10% DMSO, והעבירו את התרחיף לצינוריות הקפאה של התא.
    2. העבירו את התאים לקופסה קפואה, ואז הכניסו את הקופסה הקפואה למקפיא בטמפרטורה של -80°C. לאחר יום אחד, להעביר את התאים לחנקן נוזלי לשימור לטווח ארוך.

6. זיהוי פיברובלסטים על ידי צביעה אימונופלואורסצנטית

  1. מניחים את הכיסויים העגולים בצלחת של 24 בארות, ומגדלים את הפיברובלסטים העוברים בריכוז של 1 × 104 תאים/באר. כאשר הפיברובלסטים מגיעים למפגש של 60%, הסר את מדיום התרבית. הוסף 1 מ"ל של 4% paraformaldehyde כדי לקבע את הפיברובלסטים במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר, ולשטוף 3x עם PBS במשך 1 דקות בכל פעם.
    הערה: ספור את מספר התאים באמצעות שקופית המוציטומטר מתחת למיקרוסקופ או מונה תאים אוטומטי.
  2. הסר את PBS, לדגור עם 0.5% Triton X-100 במשך 20 דקות עבור חדירה של קרום התא, ולאחר מכן לשטוף 3x עם PBS במשך 1 דקות בכל פעם. הוסיפו PBS עם אלבומין בסרום בקר 0.5% והשרו למשך 30 דקות. לאחר מכן, הסר אותו, והוסף את נוגדן PDGFR-α/vimentin מדולל בנוגדנים ב 1:1,000. לדגור לילה ב 4 °C (75 °F).
  3. למחרת, להסיר את הנוגדן הראשוני, לשטוף את התאים 3x עם PBS במשך 3 דקות, ולהוסיף את הנוגדן המשני Alexa Fluor-555 עז נגד ארנב IgG מדולל עם נוגדנים מדלל ב 1:200 כדי להשרות במשך 1 שעה.
  4. הסר את הנוגדן המשני, ולשטוף את התאים 3x עם PBS. הוציאו את הכיסויים העגולים בעזרת מלקחיים, הניחו אותם על מגלשות זכוכית והוסיפו 50 μL של תמיסת 5 מיקרוגרם/מ"ל 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) כדי להכתים את גרעיני התא. שמרו את הדגימות בקופסה רטובה וחשוכה, והתבוננו בהן תחת מיקרוסקופ לייזר קונפוקלי פלואורסצנטי.
    הערה: הוסף קבוצת ביקורת שלילית ללא נוגדן ראשוני אך עם נוגדן משני כדי לא לכלול כתמים לא ספציפיים.

7. זיהוי פיברובלסטים לפי ציטומטריית זרימה

  1. אספו את גלולת התא לתוך צינור צנטריפוגה סטרילית של 1.5 מ"ל, והשהו מחדש עם 50 מיקרוליטר של PBS המכיל 1% FBS. יש לדגור עם anti-CD90 למשך 30 דקות בחושך, ולהוסיף בקרת איזוטיפ אנטי-IgG לקבוצת הביקורת. לאחר מכן, הוסף 200 μL של PBS המכיל 1% FBS, וצנטריפוגה את הצינור במשך 10 דקות ב 300 × גרם ב 4 ° C.
  2. הסר את supernatant, ולהוסיף 200 μL של PBS המכיל 1% FBS. השהה מחדש וסנן את המתלה דרך מסננת תאים (70 רשת). הוסף תמיסת מלאי של 5 מיקרוגרם/מ"ל של DAPI בשעה 1:100 לתסנין, ולאחר מכן קבל את התוצאות באמצעות ציטומטריית זרימה. הגדר את הפיזור הקדמי (FSC) כאבסיסה ואת הפיזור הצדדי (SSC) כאורדינטה, והקף את אוכלוסיית התאים הראשית. בחר את אוכלוסיית התא, והגדר את phycoerythrin כמו abscissa ואת הספירה כמו הקואורדינטה לניתוח.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

ציר הזמן של הפרוטוקול מסוכם באיור 1A. כמה תמונות מייצגות של תהליך הבידוד מוצגות באיור 2; שכבות האפידרמיס והשומן הוסרו בקפידה, ושכבת הדרמיס הופרדו לשברים קטנים של 3-4 מ"מ2, שחוסנו לצלחות הפטרי.

כפי שניתן לראות באיור 3A, כמה גידולים פיברובלסטים של חלקי הרקמה נצפו תחת המיקרוסקופ 5 ימים לאחר העיבוד. כפי שניתן לראות באיור 3B, הפיברובלסטים הציגו שיעורי התרבות גבוהים ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

השגת פיברובלסטים ראשוניים מרקמות קלואידיות היא בסיס קריטי למחקר נוסף. עד כה, היו שתי שיטות לרכישת פיברובלסטים ראשוניים: עיכול אנזימים ותרבית צמחים11,12,13,14. עם זאת, לשתי השיטות המסורתיות יש מגבלות, כגון רגישות לזיהום, ערבוב עם סוגים אחרים של תאים, תקופת תרבית ארוכה, ושיעור הצלחה נמוך15,16. מחקר זה תיאר שיטה אופטימלית וסיפק הוראות ברור...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

אין ניגודי עניינים להצהיר.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מספרי מענקים 81903189 ו -82073418) וקרן המדע והטכנולוגיה של גואנגזו (מענק מספר 202102020025).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
צינור צנטריפוגה סטרילי 1.5 מ"לJETBIOFILCFT002015
צינור צנטריפוגה סטרילי 15 מ"לJETBIOFIL8076
4% פוליפורמלדהידBeyotime BiotechnologyP0099קיבוע תאים
50 מ"ל צינור צנטריפוגה סטריליJETBIOFIL8081שים רקמת קלואיד
Alexa Fluor-555 עז נגד ארנב IgG אבקםאלכסה  פלואור  555 נוגדן שני לבדיקת צביעה אימונופלואורסצנטית
אנטי אנושי CD90BioLegendB301002לזהות את טוהר הפיברובלסטים
מדלל נוגדניםBeyotime BiotechnologyP0262
ארון בטיחות ביולוגית Thermo Scientific1300 series A2תאי בידוד ותרבית
סרום בקר אלבומיןאלאדיןB265993חסימה לבדיקת צביעה אימונופלואורסצנטית
חממת פחמן דו חמצניESCOCCL-170B-8שימוש לתרבית תאים
קריו-צינורות תאיםקורנינג43513אחסן את התאים במכונה
צנטריפוגליתתרמו פישרST 16Rלהשליך סופרנטנט 
DAPIBeyotime BiotechnologyC1006מכתים את גרעין התא
DMSOMP Biomedicals196055שימוש לשימור תאים
מדיום הנשר השונה של DulbeccoGibcoC11995500BTCulture תמיסה בינונית
סרום בקר עובריBI04-001-1A
ציטומטר זרימהBDBD FACSתצפית על סלסטה זהות התאים
הקפואה קופסהThermo Scientific  5100-0050
מיקרוסקופ הפוךNikonECLIPSE Ts2
מיקרוסקופ קונפוקלילייזר NikonAIR-HD25התבוננות בבדיקת הצביעה האימונופלואורסצנטית
PDGFR-& נוגדןCST3174Tנוגדן ראשון לבדיקת צביעת אימונופלואורסצנציה
תמיסת פניצילין-סטרפטומיצין-AmSolarbioP1410הוסף בתרבית תמיסה בינונית כדי למנוע זיהום
צלחת פטריJETBIOFIL7556תרבית פיברובלסטים
תמיסת מלח חוצצת פוספט תמיסת מלחGibcoC10010500BTCulture תמיסה בינונית
ארנב (DAIE) mAB IgG XR (R) בקרת איזוטוג' (PE)טכנולוגיית איתות תאים5742Sכבקרה לזרימה ציטומטריית כיסוי
עגולBiosharp801007תרבית תאים
Triton X 100SolarbioT8200ניקוב חורים בקרום התא
Trypsin-EDTAGibco25200072משמש לתאי מעבר
נוגדן וימנטיןAbcamab8978נוגדן ראשון לבדיקת צביעה אימונופלואורסצנטית
בטמפרטורה נמוכה

מקורות

  1. Zhu, Y. Q., et al. Genome-wide analysis of Chinese keloid patients identifies novel causative genes. Annals Of Translational Medicine. 10 (16), 883(2022).
  2. Feng, F., et al. Biomechanical regulatory factors and therapeutic targets in keloid fibrosis. Frontiers in Pharmacology. 13, 906212(2022).
  3. Cohen, A. J., Nikbakht, N., Uitto, J. Keloid disorder: Genetic basis, gene expression profiles, and immunological modulation of the fibrotic processes in the skin. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. , (2022).
  4. Wang, W., et al. Current advances in the selection of adjuvant radiotherapy regimens for keloid. Frontiers in Medicine. 9, 1043840(2022).
  5. Ghadiri, S. J., Kloczko, E., Flohr, C. Topical treatments in the management of keloids and hypertrophic scars: A critically appraised topic. British Journal of Dermatology. 187 (6), 855-856 (2022).
  6. Neves, L. M. G., Wilgus, T. A., Bayat, A. In vitro, ex vivo, and in vivo approaches for investigation of skin scarring: Human and animal models. Advances in Wound Care. 12 (2), 97-116 (2023).
  7. Supp, D. M. Animal models for studies of keloid scarring. Advances in Wound Care. 8 (2), 77-89 (2019).
  8. Künzel, S. R., et al. Ultrasonic-augmented primary adult fibroblast isolation. Journal of Visualized Experiments. (149), e59858(2019).
  9. He, Y., et al. An improved explants culture method: Sustainable isolation of keloid fibroblasts with primary characteristics. Journal of Cosmetic Dermatology. 21 (12), 7131-7139 (2022).
  10. Philippeos, C., et al. Spatial and single-cell transcriptional profiling identifies functionally distinct human dermal fibroblast subpopulations. Journal of Investigative Dermatology. 138 (4), 811-825 (2018).
  11. Li, L., et al. Hydrogen sulfide suppresses skin fibroblast proliferation via oxidative stress alleviation and necroptosis inhibition. Medicine and Cellular Longevity. 2022, 7434733(2022).
  12. Zhou, B. Y., et al. Nintedanib inhibits keloid fibroblast functions by blocking the phosphorylation of multiple kinases and enhancing receptor internalization. Acta Pharmacologica Sinica. 41 (9), 1234-1245 (2020).
  13. Wang, X. M., Liu, X. M., Wang, Y., Chen, Z. Y. Activating transcription factor 3 (ATF3) regulates cell growth, apoptosis, invasion and collagen synthesis in keloid fibroblast through transforming growth factor beta (TGF-beta)/SMAD signaling pathway. Bioengineered. 12 (1), 117-126 (2021).
  14. Sato, C., et al. Conditioned medium obtained from amnion-derived mesenchymal stem cell culture prevents activation of keloid fibroblasts. Plastic and Reconstructive Surgery. 141 (2), 390-398 (2018).
  15. Li, J., et al. Long-term explant culture: An improved method for consistently harvesting homogeneous populations of keloid fibroblasts. Bioengineered. 13 (1), 1565-1574 (2022).
  16. Wang, Q., et al. Altered glucose metabolism and cell function in keloid fibroblasts under hypoxia. Redox Biology. 38, 101815(2021).
  17. Fan, C., et al. Single-cell transcriptome integration analysis reveals the correlation between mesenchymal stromal cells and fibroblasts. Frontiers in Genetics. 13, 798331(2022).
  18. Yao, L., et al. Temporal control of PDGFRα regulates the fibroblast-to-myofibroblast transition in wound healing. Cell Reports. 40 (7), 111192(2022).
  19. Domdey, M., et al. Consecutive dosing of UVB irradiation induces loss of ABCB5 expression and activation of EMT and fibrosis proteins in limbal epithelial cells similar to pterygium epithelium. Stem Cell Research. 40, 102936(2022).
  20. Lin, Z., et al. Renal tubular epithelial cell necroptosis promotes tubulointerstitial fibrosis in patients with chronic kidney disease. FASEB Journal. 36 (12), e22625(2022).
  21. Korosec, A., et al. Lineage identity and location within the dermis determine the function of papillary and reticular fibroblasts in human skin. Journal of Investigative Dermatology. 139 (2), 342-351 (2019).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

PDGFR AlphaCD90
בידוד, תרבית ואפיון פיברובלסטים עוריים ראשוניים מרקמת קלואיד אנושית
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.