מאמר שיטה

יצירת ציבריד טרנסוכונדריאלי באמצעות קווי תאים סרטניים

DOI:

10.3791/65186

⸱

17 במרץ 2023

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry, University of Zaragoza, 2Institute for Biocomputation and Physics of Complex Systems, University of Zaragoza, 3Sequencing and Functional Genomics Unit, University of Zaragoza-IACS

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר טכניקה ליצירת ציבריד מתאי סרטן הגדלים בתרחיף ככלי לחקר תפקיד המיטוכונדריה בתהליך הגידולי.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בשנים האחרונות חלה עלייה משמעותית במספר המחקרים המוקדשים לבירור הקשר בין מיטוכונדריה לסרטן. עם זאת, עדיין נדרשים מאמצים נוספים כדי להבין באופן מלא את הקשר הכרוך בשינויים במיטוכונדריה ובגידולים, כמו גם לזהות פנוטיפים מיטוכונדריאליים הקשורים לגידול. לדוגמה, כדי להעריך את תרומתם של מיטוכונדריה בתהליכי גידולים וגרורות, חיוני להבין את השפעת המיטוכונדריה מתאי הגידול בסביבות גרעיניות שונות. לשם כך, גישה אפשרית אחת כוללת העברת מיטוכונדריה לרקע גרעיני אחר כדי להשיג את מה שמכונה תאי ציבריד (cybrid). בטכניקות הציברידגיזציה המסורתיות, קו תאים חסר mtDNA (ρ0, תא תורם גרעיני) מאוכלס מחדש במיטוכונדריה שמקורה בתאים או טסיות דם. עם זאת, תהליך ההדבקה של התאים דורש הידבקות טובה של התאים לצלחת התרבית, תכונה שאובדת באופן חלקי או מלא במקרים רבים בתאים פולשניים. בנוסף, קושי נוסף שנמצא בשיטות המסורתיות הוא השגת הסרה מלאה של mtDNA אנדוגני מקו התאים המקבל המיטוכונדריאלי כדי לקבל רקע DNA גרעיני ומיטוכונדריאלי טהור, תוך הימנעות מנוכחות של שני מיני mtDNA שונים בציבריד שנוצר. בעבודה זו, אנו מציגים פרוטוקול חילופי מיטוכונדריה המיושם על תאים סרטניים הגדלים בתרחיף, בהתבסס על אכלוס מחדש של תאים שטופלו מראש ברודמין 6G עם מיטוכונדריה מבודדת. מתודולוגיה זו מאפשרת לנו להתגבר על מגבלות הגישות המסורתיות, ובכך יכולה לשמש ככלי להרחבת הבנת התפקיד המיטוכונדריאלי בהתקדמות סרטן וגרורות.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תכנות מחדש של מטבוליזם אנרגיה הוא סימן ההיכר של סרטן1 שנצפה לראשונה על ידי אוטו ורבורג בשנות השלושים2. בתנאים אירוביים, תאים נורמליים ממירים גלוקוז לפירובט, שמייצר אצטיל-CoA, מתדלק את המנגנון המיטוכונדריאלי ומקדם נשימה תאית. עם זאת, ורבורג הראה כי גם בתנאים נורמוקסיים, רוב התאים הסרטניים ממירים פירובט המתקבל מתהליך הגליקוליזה ללקטט, ומשנים את דרכם להשגת אנרגיה. התאמה מטבולית זו ידועה בשם "אפקט ורבורג" ומאפשרת לחלק מתאי הסרטן לספק את דרישותיהם האנרגטיות לגדילה וחלוקה מהירה, למרות ייצור ATP ביעילות פחותה מהתהליך האירובי 3,4,5. בעשורים האחרונים, עבודות רבות תמכו במשמעות של תכנות מחדש של חילוף החומרים בהתקדמות הסרטן. לפיכך, אנרגיית הגידול נחשבת למטרה מעניינת נגד סרטן1. כמרכז מרכזי בחילוף חומרים אנרגטי ובאספקת מבשרים חיוניים, מיטוכונדריה ממלאים תפקיד מפתח בהסתגלויות התאים הללו, שעד היום אנו מבינים רק באופן חלקי.

בהתאם לאמור לעיל, מוטציות DNA מיטוכונדריאלי (mtDNA) הוצעו כאחד הגורמים האפשריים לתכנות מחדש מטבולי זה, אשר עלול להוביל לפגיעה בביצועי שרשרת הובלת אלקטרונים (ETC)6 ויסבירו מדוע תאים סרטניים מסוימים משפרים את חילוף החומרים הגליקוליטי שלהם כדי לשרוד. ואכן, דווח כי mtDNA צובר מוטציות בתוך תאים סרטניים, להיות נוכח לפחות 50% של גידולים7. לדוגמה, מחקר שנערך לאחרונה על ידי יואן ואחרים דיווח על נוכחות של מולקולות mtDNA hypermutated וקטוע בסרטן הכליות, המעי הגס ובלוטת התריס8. יתר על כן, עבודות רבות הוכיחו כי מוטציות מסוימות mtDNA קשורות לפנוטיפ גידול אגרסיבי יותר ולעלייה בפוטנציאל הגרורתי של תאים סרטניים 9,10,11,12,13,14,15,16.

למרות הרלוונטיות לכאורה של הגנום המיטוכונדריאלי בהתקדמות הסרטן, המחקר של מוטציות אלה ותרומתן למחלה היה מאתגר בשל מגבלות במודלים ובטכנולוגיות הניסוי הזמינות כיום17. לכן, יש צורך בטכניקות חדשות כדי להבין את ההשפעה האמיתית של DNA מיטוכונדריה על התפתחות מחלות סרטן והתקדמותן. בעבודה זו, אנו מציגים פרוטוקול לייצור ציבריד טרנסוכונדריאלי מתאי סרטן הגדלים בתרחיף, המבוסס על אכלוס מחדש של תאים שטופלו ברודמין 6G עם מיטוכונדריה מבודדת, המתגבר על האתגרים העיקריים של שיטות גישור מסורתיות18,19. מתודולוגיה זו מאפשרת שימוש בכל תורם גרעינים ללא קשר לזמינות קו תאי ρ0 המתאים להם ולהעברת מיטוכונדריה מתאים אשר, בעקבות הטכניקות המסורתיות, יהיה קשה לחנך (כלומר, קווי תאים שאינם דבקים).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: כל מדיית התרבות והרכבי החיץ מפורטים בטבלה 1. לפני יצירת ציבריד יש להקליד פרופילי דנ"א מיטוכונדריאלי וגרעיני מתאי התורם והמקבל כדי לאשר את קיומם של הבדלים גנטיים בשני הגנומים בין שורות התא. במחקר זה נעשה שימוש בקו תאי L929 זמין מסחרית וקו התאים הנגזר ממנו, L929dt, שנוצר באופן ספונטני במעבדה שלנו (ראו13 למידע נוסף). קווי תאים אלה מציגים שני הבדלים ברצף הגן mt-Nd2 שלהם, אשר ניתן להשתמש בהם כדי לאשר את טוהר mtDNA לאחר השלמת תהליך cybridization13. במקרה זה, טוהר הרקע הגרעיני אושר על ידי רגישות לאנטיביוטיקה, שכן, בניגוד לתאי L929dt, L929 היו עמידים לגנטיקה.

1. דלדול מיטוכונדריאלי על ידי טיפול רודאמין 6G (תאים מקבלים)

הערה: הצעד הראשון ליצירת ציבריד מוצלח הוא ביטול מוחלט ובלתי הפיך של תפקודי המיטוכונדריה בתאים המקבלים. לשם כך, יש צורך לקבוע בעבר, עבור כל קו התא, את הריכוז המתאים ואת משך הטיפול עם רודאמין 6G. ריכוז נאות זה צריך להיות מעט מתחת למוות תאי הנגרם על ידי תרופות (הגבוה ביותר שאינו הורג את התאים במהלך הטיפול). בצע את הפעולות הבאות לאחר הגדרת התנאים האופטימליים.

  1. זרעו 106 תאים בצלחת של 6 בארות באמצעות מדיום תרבית שלם (ראו טבלה 1 לפרטים) וטפלו בהם מדי יום עם הריכוז האופטימלי של רודמין 6G במשך 3-10 ימים, בהתאם לקו התא. ריכוזים מסורתיים נעים בין 2 ל 5 מיקרוגרם / מ"ל במשך 3-10 ימים20,21. במחקר זה, עבור תאים שמקורם ב-L929, 2.5 מיקרוגרם/מ"ל רודאמין 6G במשך 7 ימים היה הטיפול שנבחר13,22.
  2. כדי לשמור על התאים בחיים, להשלים את מדיום תרבית התאים עם 50 מיקרוגרם / מ"ל של אורידין ו 100 מיקרוגרם / מ"ל של פירובט ולחדש אותו כל 24 שעות.
  3. לאחר הטיפול ולפני האיחוי, לשנות את התווך של תאים שטופלו ברודמין 6G כדי להשלים את תרבית התאים מדיום ללא רודאמין 6G, ולהשאיר אותם בתווך זה במשך 3-4 שעות באינקובטור ב 37 ° C עם 5% CO2.
    הערה: ההשפעה הרעילה של רודמין 6G היא בלתי הפיכה, ותאים עם מיטוכונדריה לא מתפקדים לא אמורים להתאושש20. לכן, לאחר הטיפול, תאים שאינם מקבלים מיטוכונדריה פונקציונלית צריכים למות אפילו בתווך תרבית בתוספת אורידין. לכן, אין צורך בברירה גרעינית. עם זאת, מומלץ לבצע איחוי מבוקר של תאים שטופלו ברודקמין 6G ללא מיטוכונדריה.

2. הרחבה ובידוד מיטוכונדריאלי (תאי תורם)

  1. הרחיבו את תאי תורם המיטוכונדריה במהלך פרק הזמן של הטיפול ברודמין 6G כדי להשיג סביב 25 x 106 תאים.
  2. ביום השביעי, קצרו תאים הגדלים באופן אקספוננציאלי בצינור של 50 מ"ל ואספו אותם באמצעות צנטריפוגה במהירות של 520 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT). שטפו את התאים 3x במי מלח חוצצי פוספט קר (PBS) ושקעו אותם בצנטריפוגה במהירות של 520 x גרם למשך 5 דקות ב-RT. מעתה ואילך, בצע את כל השלבים של מיצוי מיטוכונדריאלי ב 4 ° C, באמצעות ריאגנטים קרים ושמירה על צינורות עם תאים או מיטוכונדריה על קרח.
  3. לאחר הצנטריפוגה השלישית, יש להשליך את הסופרנאטנט על ידי שאיפה באמצעות פיפטה מזכוכית המוצמדת למשאבת ואקום ולהשהות מחדש את התאים הארוזים בנפח של חיץ היפוטוני השווה לפי 7 מנפח כדורי התא. לאחר מכן, להעביר את תרחיף התא לתוך צינור homogenizer ולתת לתאים להתנפח על ידי דגירה אותם על קרח במשך 2 דקות.
  4. שברו את קרומי התא על ידי ביצוע 8 עד 10 פעימות בהומוגנייזר המחובר למזיק מונע מנוע המסתובב ב-600 סל"ד.
    הערה: השלב של הפרעה בקרום התא עשוי להשתנות בין סוגי תאים; לכן, זה צריך להיות מותאם עבור כל סוג התא.
  5. הוסף את אותו נפח של חיץ היפרטוני לתרחיף התא (פי 7 מנפח כדורי התא) כדי ליצור סביבה איזוטונית.
  6. מעבירים את ההומוגנאט לצינור של 15 מ"ל וצנטריפוגות אותו ברוטור קבוע ב 1,000 x גרם למשך 5 דקות ב 4 ° C. לאחר מכן, אספו רק 3/4 מהסופרנאטנט שמשאיר שוליים גדולים מהכדורית, כדי למנוע זיהום בגרעין או בתאים שלמים, והעבירו אותו לצינור אחר. חזור על אותו תהליך פעמיים. שימו לב שיש לשמור את הסופרנאטנט ולהשליך את הכדור.
  7. שמור את החלק המיטוכונדריאלי (supernatant). העבר אותו לצינורות 1.5 מ"ל וצנטריפוגה במהירות מרבית (18,000 x גרם) למשך 2 דקות ב- 4 ° C.
  8. השליכו את הסופרנאטנט ושטפו את הגלולה המועשרת במיטוכונדריה עם חיץ A, תוך שילוב התוכן של שני הצינוריות לאחד וצנטריפוגה באותם תנאים כמתואר בשלב 2.7. חזור על אותו תהליך עד שכל החומר נמצא בצינור אחד בלבד.
  9. בצע שטיפה נוספת עם 300 μL של חיץ A וכמת את ריכוז החלבון המיטוכונדריאלי באמצעות בדיקת ברדפורד23. עבור כל בדיקת cybridization, יש לקבוע את הכמות האופטימלית של מיטוכונדריה עבור הליך ההעברה (במקרה שלנו, ריכוז בין 10-40 מיקרוגרם של חלבון מיטוכונדריאלי לכל 106 תאים).
  10. במקביל, הכינו את התאים המטופלים ברודמין 6G לאיחוי על ידי איסופם בצינור של 15 מ"ל וצנטריפוגה ב 520 x גרם למשך 5 דקות ב- RT. שים לב שהגלולה מקבלת צבע ורוד ניאון עקב טיפול ברודמין 6G.
  11. כדי להבטיח שגם ביטול תפקוד המיטוכונדריה בתאי הקולטן וגם טיהור אברונים מתורמים בוצעו כראוי, זרעו מספר קטן של תאים שטופלו ברודמין 6G ובודדו מיטוכונדריה באמצעות מדיום התרבית המלא בצלחת של 6 בארות ותרבו אותם במשך חודש כדי לבדוק שלא נותרו תאים ששרדו באף אחת מהבארות (איור 2).
  12. במקביל, להעריך את היעדר מזהמי גרעינים בחלק המיטוכונדריאלי על ידי זיהוי חיסוני של חלבונים גרעיניים (כלומר, למין בטא, היסטון H3 וכו ') או על ידי הגברה כמותית של תגובת שרשרת פולימראז (qPCR) של גן גרעיני (כלומר, SDH, 18S rRNA, וכו ').
    הערה: כדי למנוע זיהומים, מומלץ לבצע את כל השלבים בתנאים אספטיים בעבודה תחת מכסה מנוע זרימה למינרית.

3. היתוך ויצירת סייבריד

  1. כדי להמשיך עם האיחוי, הוסיפו בזהירות 106 תאים שטופלו ברודמין 6G לגלולת המיטוכונדריה המבודדת (10-40 מיקרוגרם חלבון מיטוכונדריאלי) וצנטריפוגה ב 520 x גרם למשך 5 דקות כדי לאפשר לתאים להתערבב עם המיטוכונדריה.
  2. הוסף 100 μL של פוליאתילן גליקול (PEG, 50%) והשהה בעדינות את הגלולה למשך 30 שניות. לאחר מכן, לאפשר לנוח ללא פגע עוד 30 שניות.
  3. לבסוף, מעבירים את התערובת לצלחת בת 6 בארות עם מדיום תרבית תאים שלמה טרייה ומניחים באינקובטור בטמפרטורה של 37°C עם 5% CO2. לאחר כמה ימים (בדרך כלל שבוע אחד), ציברידים טרנסוכונדריאליים אמורים להתחיל לגדול (איור 2), מה שמוליד שיבוטים שניתן לבחור בנפרד או לערבב בבריכה לפני הניתוח שלהם.

4. אימות הרקע המיטוכונדריאלי והגרעיני

הערה: לאחר שקו התאים החדש התבסס והתאים מתחילים לגדול באופן אקספוננציאלי, יש לאמת את טוהר הדנ"א המיטוכונדריאלי והגרעיני שלהם. לפיכך, קווי התאים המקוריים צריכים להכיל מוטציות או פולימורפיזמים שונים בתוך הגנום שלהם כדי להפוך אותם לניתנים לזיהוי.

  1. בידוד DNA מוחלט
    1. לבודד את הדנ"א הגנומי של כל קווי התאים המשמשים לייצור ציבריד על ידי שימוש בערכת מיצוי DNA גנומית מסחרית (ראה טבלת חומרים) או על ידי ביצוע פרוטוקול סטנדרטי באמצעות מיצוי אלכוהול פנול-כלורופורם-איזואמיל ומשקעים אלכוהוליים24.
  2. הערכת mtDNA (איור 3)
    הערה: ניתן לבצע מספר טכניקות, כגון ריצוף, ניתוח פולימורפיזם אורך מקטע הגבלה (RFLP), או qPCR ספציפי לאלל, כדי לנתח את טוהר mtDNA. כדי לאשר את נוכחותם של וריאציות רצף mtDNA על ידי RFLP, בצע את שלבי הפרוטוקול הבאים.
    1. להגביר מקטע mtDNA המכיל את שינוי הנוקלאוטידים על ידי PCR.
      1. כאן, תאי L929dt מציגים מוטציה mtDNA במיקום 4206, בתוך גן mt-Nd2 (m.4206C>T) שחסר בתאי L929. כדי לאשר את נוכחותו של תחליף זה בציברידים הטרנסוכונדריאליים, להגביר קטע 397 bp על ידי PCR באמצעות פרוטוקול סטנדרטי ואת הפריימרים הבאים: 1) 5'-AAGCTATCGGG
        CCCATACCCCG-3' (עמדות 3862-3884) ו-2) 5'-TAATCAGAAGTGGAATGGGGCG -3' (עמדות 4236-4258).
    2. לנתח את נוכחותו של החלפת הנוקלאוטידים הרצויה על ידי RFLP, באמצעות אנדונוקלאז ספציפי המזהה את שינוי הרצף ומייצר דפוס חיתוך שונה עבור שני קווי התא.
      הערה: כאשר קיים וריאנט mtDNA L929dt (4206T), האמפליקון המתקבל בשלב 4.2.1 מכיל שני אתרי הגבלה עבור SspI (ראה טבלת חומרים) המייצרים שלושה מקטעי DNA של 306 bp, 52 bp ו- 39 bp. אתר ההגבלה שמייצר את התדרים 52 ו-39 משתבש כאשר קיימת גרסת ה-Wild-type (WT) C4206, ומופיעה להקה חדשה של 91 bp. לכן, בקרה פנימית לעיכול מלא עבור SspI נכלל בניתוח. תגובת העיכול מבוצעת ב 37 מעלות צלזיוס, בהתאם להוראות היצרן.
    3. הפרידו את מקטעי ההגבלה על ידי אלקטרופורזה והשוו את תבנית הפס.
      1. לאחר ביצוע העיכול, נתח את קטעי ההגבלה המתקבלים על ידי אלקטרופורזה בג'לים 10% polyacrylamide-Tris-borate-EDTA (TBE) (ראה טבלה 1 עבור הרכב TBE 1x). הפעל את האלקטרופורזה ב- 80 V למשך שעה אחת ב- RT. דמיין את מקטעי ה- DNA לאחר צביעת ג'ל בתמיסה של אתידיום ברומיד ב- 1x TBE למשך 15 דקות ב- RT (ראה טבלה 1 להרכב תמיסת צביעת ג'ל).
  3. גנוטיפ DNA גרעיני
    הערה: גנוטיפ DNA גרעיני חייב להתבצע באמצעות דגימת מיצוי ה- DNA הקודמת ששימשה לניתוח RFLP.
    1. הגבר 16 אתרים (D21S11, CSF1PO, vWA, D8S1179, TH01, D18S51, D5S818, D16S539, D3S1358, D2S1338, TPOX, FGA, D7S820, D13S317, D19S433 ו- AMEL) באמצעות מאגר של אוליגונוקלאוטידים ספציפיים למסחר (ראה טבלת חומרים).
    2. לבצע אלקטרופורזה באמצעות מנתח גנטי על מנת להפריד את השברים שהתקבלו בעבר.
      הערה: לאחר הגברתם, המוקדים השונים מנותחים על ידי אלקטרופורזה באמצעות מערכת קפילרית (ראה טבלת חומרים). השברים מופרדים בקפילר באורך 50 ס"מ המלא בפולימר מסחרי. מאגרי קתודה ואנודה זמינים גם הם באופן מסחרי, כפי שמוצג בטבלת החומרים. אלקטרופורזה מבוצעת ב 19.5 kV במשך 20 דקות ב 60 ° C.
    3. השתמש בכלים ביואינפורמטיים כדי לקבוע את האללים המתאימים לכל מוקד מוגבר (ראה טבלת חומרים).
    4. השוו את הנתונים שהתקבלו בשלב 4.3.3 עם מסד הנתונים של פרופיל הדנ"א הגרעיני (טבלה 1), כדי לבדוק אם פרופיל הדנ"א הגרעיני תואם לפרופיל קו התא של קולטן המיטוכונדריה (איור 4).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לאחר ביצוע הפרוטוקול שהוצג לעיל, יש לקבל קו תאי ציבריד הומופלסמיים עם רקע גרעיני שמור אך עם גנוטיפ מיטוכונדריה חדש, כפי שמיוצג בסכמות באיור 1 ובאיור 2. טוהר הדנ"א המיטוכונדריאלי והגרעיני שנמצא בציברידים יכול להיות מאושר על-ידי RFLP, כפי שמוצג באיור 3, ועל-ידי ניתוח גנוטיפ של דנ"א גרעיני, כפי שמוצג באיור 4.

אם העברת המיטוכונדריה נעשתה בהצלחה, התוצאות שהתקבלו בניתוח RFLP עבור ק...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מאז שאוטו ורבורג דיווח כי תאים סרטניים משנים את חילוף החומרים שלהם ומעצימים "גליקוליזה אירובית"3,4 תוך הפחתת הנשימה המיטוכונדריאלית, העניין בתפקיד המיטוכונדריה בטרנספורמציה ובהתקדמות סרטן גדל באופן אקספוננציאלי. בשנים האחרונות, מוטציות ב- mtDNA ותפקוד לקוי של המיטוכונדריה הונחו כסימני היכר של סוגי סרטן רבים25. עד כה, מחקרים רבים ניתחו את השונות mtDNA של גידולים ספציפיים 6,26,27,28,29,30,31,32...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה מומן על ידי מענק מספר PID2019-105128RB-I00 ל- RSA, JMB ו- AA, ו- PGC2018-095795-B-I00 ל- PFS ו- RML, שניהם מומנו על ידי MCIN/AEI/10.13039/501100011033 ומספרי מענקים B31_20R (RSA, JMA ו- AA) ו- E35_17R (PFS ו- RML) ומומנו על ידי Gobierno de Aragón. העבודה של RSA נתמכה על ידי מענק של Asociación Española Contra el Cáncer (AECC) PRDAR21487SOLE. המחברים מבקשים להכיר בשימוש ב-Servicio General de Apoyo a la Investigación-SAI, Universidad de Zaragoza.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מנתח גנטי 3500XL ThermoFisher Scientific4406016
צלחת 6 בארותקורנינג08-772-1B
אמוניום פרסולפטסיגמא-אולדריץ'A3678
AmpFlSTR מזהה בתוספת ערכת הגברת PCRThermoFisher Scientific4427368
מיכל חיץ אנודה 3500 סדרהביו-מערכות יישומיות4393927
חומצה בוריתPanReac131015
ברדפורד מבחןBiorad5000002
קתודה מיכל 3500 סדרתApplied Biosystems4408256
צלוחיות תרבית תאיםTPP90076
DMEM גלוקוז גבוהGibco11965092
EDTAPanReac131026
אתידיום ברומידSigma-AldrichE8751
גנטיציןGibco10131027
הומוגנייזר עלי טפלוןDeltalab196102
L929 קו תאיםATCCCCL-1
MiniProtean Tetra4 מערכת ג'לBioRad1658004
MOPSSigma-AldrichM1254
PCR פריימריםSigma-Aldrichמותאמים אישית
תמיסת פוליאקרילאמיד 30%PanReacA3626
פוליאתילן גליקולסיגמא-אולדריץ'P7181
POP-7יישומי ביוסיסטמס4393714
פירובטסיגמא-אולדריץ'P5280
QIAmp DNA מיני קיטQiagen51306
רודמין-6Gסיגמא-אולדריץ'R4127
סרום בקר עובריסיגמא-אולדריץ'F7524
SspIניו אינגלנד ביולאבסR3132
סטרפטומיצין/פניציליןPAN ביוטקP06-07100
סוכרוזסיגמא-אולדריץ'S3089
TEMEDסיגמא-אולדריץ'T9281
טריספנריאקP14030b
אורידיןסיגמא-אולדריץ'U3750
מוצרים

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hanahan, D. Hallmarks of cancer: new dimensions. Cancer Discovery. 12 (1), 31-46 (2022).
  2. Wind, F., Warburg, O. H. The Metabolism of Tumors: Investigation from the Kaiser Wilhelm Institute for Biology. , Constable. Berlin-Dahlem. (1930).
  3. Warburg, O. On respiratory impairment in cancer cells. Science. 124 (3215), 269-270 (1956).
  4. Warburg, O. On the origin of cancer cells. Science. 123 (3191), 309-314 (1956).
  5. Weinhouse, S. On respiratory impairment in cancer cells. Science. 124 (3215), 267-269 (1956).
  6. Brandon, M., Baldi, P., Wallace, D. C. Mitochondrial mutations in cancer. Oncogene. 25 (34), 4647-4662 (2006).
  7. Ju, Y. S., et al. Origins and functional consequences of somatic mitochondrial DNA mutations in human cancer. eLife. 3, 02935(2014).
  8. Yuan, Y., et al. Comprehensive molecular characterization of mitochondrial genomes in human cancers. Nature Genetics. 52 (3), 342-352 (2020).
  9. Arnold, R. S., et al. metastasis in prostate cancer: Recurring mitochondrial DNA mutation reveals selective pressure exerted by the bone microenvironment. Bone. 78, 81-86 (2015).
  10. Imanishi, H., et al. Mitochondrial DNA mutations regulate metastasis of human breast cancer cells. PLoS One. 6 (8), 23401(2011).
  11. Lu, J., Sharma, L. K., Bai, Y. Implications of mitochondrial DNA mutations and mitochondrial dysfunction in tumorigenesis. Cell Research. 19 (7), 802-815 (2009).
  12. Luo, Y., Ma, J., Lu, W. The significance of mitochondrial dysfunction in cancer. International Journal of Molecular Sciences. 21 (16), 5598(2020).
  13. Marco-Brualla, J., et al. Mutations in the ND2 subunit of mitochondrial complex I are sufficient to confer increased tumorigenic and metastatic potential to cancer cells. Cancers. 11 (7), 1027(2019).
  14. Schopf, B., et al. OXPHOS remodeling in high-grade prostate cancer involves mtDNA mutations and increased succinate oxidation. Nature Communications. 11 (1), 1487(2020).
  15. Yuan, Y., et al. Nonsense and missense mutation of mitochondrial ND6 gene promotes cell migration and invasion in human lung adenocarcinoma. BMC Cancer. 15, 346(2015).
  16. Zielonka, J., Kalyanaraman, B. 34;ROS-generating mitochondrial DNA mutations can regulate tumor cell metastasis"--a critical commentary. Free Radicals Biology and Medicine. 45 (9), 1217-1219 (2008).
  17. Welch, D. R., Foster, C., Rigoutsos, I. Roles of mitochondrial genetics in cancer metastasis. Trends in Cancer. 8 (12), 1002-1018 (2022).
  18. Cavaliere, A., Marchet, S., Di Meo, I., Tiranti, V. An in vitro approach to study mitochondrial dysfunction: A cybrid model. Journal of Visualized Experiments. (181), e63452(2022).
  19. King, M. P., Attardi, G. Human cells lacking mtDNA: repopulation with exogenous mitochondria by complementation. Science. 246 (4929), 500-503 (1989).
  20. Bacman, S. R., Moraes, C. T. Transmitochondrial technology in animal cells. Methods in Cell Biology. 80, 503-524 (2007).
  21. Moraes, C. T., Dey, R., Barrientos, A. Transmitochondrial technology in animal cells. Methods in Cell Biology. 65, 397-412 (2001).
  22. Acin-Perez, R., et al. Respiratory complex III is required to maintain complex I in mammalian mitochondria. Molecular Cell. 13 (6), 805-815 (2004).
  23. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
  24. Bayona-Bafaluy, M. P., et al. Revisiting the mouse mitochondrial DNA sequence. Nucleic Acids Research. 31 (18), 5349-5355 (2003).
  25. Srinivasan, S., Guha, M., Kashina, A., Avadhani, N. G. Mitochondrial dysfunction and mitochondrial dynamics-The cancer connection. Biochimica et Biophysica Acta. Bioenergetics. 1858 (8), 602-614 (2017).
  26. Bartoletti-Stella, A., et al. Mitochondrial DNA mutations in oncocytic adnexal lacrimal glands of the conjunctiva. Archives of Ophthalmology. 129 (5), 664-666 (2011).
  27. Chinnery, P. F., Samuels, D. C., Elson, J., Turnbull, D. M. Accumulation of mitochondrial DNA mutations in ageing, cancer, and mitochondrial disease: is there a common mechanism. The Lancet. 360 (9342), 1323-1325 (2002).
  28. Copeland, W. C., Wachsman, J. T., Johnson, F. M., Penta, J. S. Mitochondrial DNA alterations in cancer. Cancer Investigation. 20 (4), 557-569 (2002).
  29. Gasparre, G., et al. Clonal expansion of mutated mitochondrial DNA is associated with tumor formation and complex I deficiency in the benign renal oncocytoma. Human Molecular Genetics. 17 (7), 986-995 (2008).
  30. Kopinski, P. K., Singh, L. N., Zhang, S., Lott, M. T., Wallace, D. C. Mitochondrial DNA variation and cancer. Nature Review Cancer. 21 (7), 431-445 (2021).
  31. Pereira, L., Soares, P., Maximo, V., Samuels, D. C. Somatic mitochondrial DNA mutations in cancer escape purifying selection and high pathogenicity mutations lead to the oncocytic phenotype: pathogenicity analysis of reported somatic mtDNA mutations in tumors. BMC Cancer. 12, 53(2012).
  32. Wallace, D. C. Mitochondria and cancer. Nature Reviews. Cancer. 12 (10), 685-698 (2012).
  33. Hopkins, J. F., et al. Mitochondrial mutations drive prostate cancer aggression. Nature Communications. 8 (1), 656(2017).
  34. Weerts, M. J. A., Smid, M., Foekens, J. A., Sleijfer, S., Martens, J. W. M. Mitochondrial RNA expression and single nucleotide variants in association with clinical parameters in primary breast cancers. Cancers. 10 (12), 500(2018).
  35. Jimenez-Morales, S., Perez-Amado, C. J., Langley, E., Hidalgo-Miranda, A. Overview of mitochondrial germline variants and mutations in human disease: Focus on breast cancer (Review). International Journal of Oncology. 53 (3), 923-936 (2018).
  36. Hardie, D. G. AMP-activated/SNF1 protein kinases: conserved guardians of cellular energy. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 774-785 (2007).
  37. Perrone, A. M., et al. Potential for mitochondrial DNA sequencing in the differential diagnosis of gynaecological malignancies. International Journal of Molecular Sciences. 19 (7), 2048(2018).
  38. Musicco, C., et al. Mitochondrial dysfunctions in type I endometrial carcinoma: Exploring their role in oncogenesis and tumor progression. International Journal of Molecular Sciences. 19 (7), 2076(2018).
  39. Li, N., et al. Dissecting the expression landscape of mitochondrial genes in lung squamous cell carcinoma and lung adenocarcinoma. Oncology Letters. 16 (3), 3992-4000 (2018).
  40. Kim, H. R., et al. Spectrum of mitochondrial genome instability and implication of mitochondrial haplogroups in Korean patients with acute myeloid leukemia. Blood Research. 53 (3), 240-249 (2018).
  41. Tyagi, A., et al. Pattern of mitochondrial D-loop variations and their relation with mitochondrial encoded genes in pediatric acute myeloid leukemia. Mutation Research. 810, 13-18 (2018).
  42. Vidone, M., et al. A comprehensive characterization of mitochondrial DNA mutations in glioblastoma multiforme. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 63, 46-54 (2015).
  43. Chatterjee, A., Mambo, E., Sidransky, D. Mitochondrial DNA mutations in human cancer. Oncogene. 25 (34), 4663-4674 (2006).
  44. Arnold, R. S., et al. An inherited heteroplasmic mutation in mitochondrial gene COI in a patient with prostate cancer alters reactive oxygen, reactive nitrogen and proliferation. BioMed Research International. 2013, 239257(2013).
  45. Petros, J. A., et al. mtDNA mutations increase tumorigenicity in prostate cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences. 102 (3), 719-724 (2005).
  46. Wallace, D. C., Fan, W., Procaccio, V. Mitochondrial energetics and therapeutics. Annual Review of Pathology. 5, 297-348 (2010).
  47. Reznik, E., et al. Mitochondrial DNA copy number variation across human cancers. eLife. 5, 10769(2016).
  48. Soler-Agesta, R., et al. PT-112 induces mitochondrial stress and immunogenic cell death, targeting tumor cells with mitochondrial deficiencies. Cancers. 14 (16), 3851(2022).
  49. Trounce, I., Wallace, D. C. Production of transmitochondrial mouse cell lines by cybrid rescue of rhodamine-6G pre-treated L-cells. Somatic Cell and Molecular Genetics. 22 (1), 81-85 (1996).
  50. Pastushenko, I., Blanpain, C. EMT transition states during tumor progression and metastasis. Trends in Cell Biology. 29 (3), 212-226 (2019).
  51. Pastushenko, I., et al. Identification of the tumour transition states occurring during EMT. Nature. 556 (7702), 463-468 (2018).
  52. Thiery, J. P., Sleeman, J. P. Complex networks orchestrate epithelial-mesenchymal transitions. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (2), 131-142 (2006).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Rhodamine 6GDNARFLP

מאמרים קשורים