הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

הליך עבור עכבר שורש גבי גנגליון Cryosectioning

8.3K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/65232

⸱

9 ביוני 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pain Management, Xuanwu Hospital, Capital Medical University, 2Department of Anesthesia and Perioperative Care, University of California San Francisco, 3Department of Anesthesiology, Sun Yat-Sen University, 4University of Washington

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

מוצג כאן הפיתוח לרכישה עקבית של קטעי קריוסטט גנגליון שורש גבי באיכות גבוהה.

תקציר

קטעי קריוסטט איכותיים של גנגליון שורש גבי של עכבר (DRG) חיוניים לצביעת אימונוכימיה נכונה ולמחקרי RNAscope בחקר כאב דלקתי ונוירופתי, גירוד, כמו גם מצבים נוירולוגיים היקפיים אחרים. עם זאת, זה עדיין אתגר להשיג באופן עקבי קטעי קריוסטט איכותיים, שלמים ושטוחים על שקופיות זכוכית בגלל גודל הדגימה הזעיר של רקמת DRG. עד כה, אין מאמר המתאר פרוטוקול אופטימלי עבור קריוסקציה DRG. פרוטוקול זה מציג שיטה שלב אחר שלב לפתרון הקשיים הנפוצים הקשורים להקפאת DRG. המאמר המוצג מסביר כיצד להסיר את הנוזל שמסביב מדגימות רקמת DRG, למקם את קטעי DRG על השקופית הפונים לאותו כיוון, ולשטח את החלקים במגלשת הזכוכית מבלי להתעקל כלפי מעלה. למרות פרוטוקול זה פותח עבור cryosectioning דגימות DRG, זה יכול להיות מיושם עבור cryosectioning של רקמות רבות אחרות עם גודל מדגם קטן.

מבוא

גנגליון השורש הגבי (DRG) מכיל את נוירוני החישה הראשוניים, את המקרופאגים הרקמתיים, ואת תאי הלוויין המקיפים את נוירוני החישה הראשוניים 1,2,3,4. זהו מבנה אנטומי מרכזי בעיבוד אותות מזיקים ומזיקים, וממלא תפקידים קריטיים בכאב, גירוד והפרעות עצביות היקפיות שונות 5,6,7,8,9,10,11,12,13. למרות שפותחו מספר שיטות לניתוח רקמת DRG מחוט השדרה של העכבר14,15,16, הקפאה של רקמת DRG נותרה מאתגרת מכיוון שרקמת DRG קטנה למדי, וקטעי קריוסטט של דגימות DRG נוטים להתעקם לגלילים, מה שמקשה על העברה נכונה של קטעי הקריוסטט לשקופיות זכוכית. עם זאת, קריוסקציה נכונה של רקמת DRG חיונית למחקרי אימונוהיסטוכימיה ולמבנה של נוירונים חושיים DRG 17,18,19,20,21,22,23. יתר על כן, מכיוון שתוצאות ריצוף RNA חד-תאי חשפו את ההטרוגניות יוצאת הדופן של נוירונים חושיים DRG הן בבני אדם24 והן בעכברים25, קריוסקציה נכונה של רקמת DRG היא קריטית לחקר התפקיד התפקודי של תאי DRG שונים במצבים פיזיולוגיים ופתולוגיים שונים.

למרות שטכניקת ניקוי הרקמות יושמה כדי לחקור את השחזור התלת-ממדי של DRG26 כטכניקה חלופית של הקפאת DRG, טכניקת ניקוי הרקמות גוזלת זמן ועבודה. לשם השוואה, קריוסקציה של DRG היא מהירה וקלה יחסית לביצוע, ולכן היא נותרה טכניקה מרכזית לאימונוהיסטוכימיה ומחקרי מבנה של DRG ואזורים אחרים של מערכת העצבים המרכזית. עם זאת, השגת קטעי קריוסטט איכותיים, שלמים ושטוחים על שקופיות זכוכית נותרה אתגר במחקר מדעי המוח בגלל גודל הדגימה הזעיר של רקמות, כמו DRG ואזורי מוח מסוימים, ואין מאמר המתאר את הפרוטוקול האופטימלי בשלב זה להקפאה של דגימות רקמות בגודל קטן, כגון DRG עכבר.

פרוטוקול זה מספק טכניקה קלה, שלב אחר שלב, לחתך קריוסטט של DRG העכבר כדי להשיג באופן אמין כמה שיותר קטעי DRG באיכות גבוהה בשקופיות עבור מחקרי DRG הבאים. בעוד שתוכננה במיוחד עבור דגימות DRG בהקפאה, טכניקה זו יכולה לשמש באופן פוטנציאלי להקפאת רקמות שונות אחרות עם גודל מדגם קטן.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

עבור המחקר הנוכחי, הניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של UCSF ונערכו בהתאם למדריך NIH לטיפול ושימוש בחיות מעבדה. עכברים בוגרים בני 8-12 שבועות C57BL/6 זכרים ונקבות (גזע ביתי) שימשו כאן.

1. הכנת מדגם DRG

  1. מרדימים את העכברים עם 2.5% אברטין (ראו טבלת חומרים). להבטיח הרדמה נאותה על ידי חוסר תגובה לגירוי כואב. יש לערבב את בעלי החיים באופן טרנסקרדילי עם 1x מלוחים חוצצי פוספט (PBS) ואחריו 4% פורמלדהיד, כפי שתואר קודם לכן14,15,16.
  2. לנתח רקמת DRG מחוט השדרה, כפי שתואר קודם 14,15,16.
  3. לאחר תיקון DRGs מנותחים ב 4% פורמלדהיד במשך 3 שעות בטמפרטורת החדר.
  4. שים את DRGs ב 30% סוכרוז ב PBS ב 4 ° C במשך הלילה.
  5. הכנת טמפרטורת החיתוך האופטימלית של הבסיס (OCT)
    1. הוסיפו את תרכובת OCT (ראו טבלת חומרים) כדי לכסות את פני השטח העליונים של גוש האלומיניום וקפאו בטמפרטורה של -20°C למשך 5-10 דקות (איור 1A).
    2. חתכו את החלק העליון של ה-OCT באמצעות הקריוסטט (ראו טבלת חומרים) בעובי של 30 מיקרומטר עד שפני השטח שלו שטוחים כ-OCT הבסיס (איור 1B).
    3. סמנו בתחתית (מיקום השעה שש) של OCT הבסיס כדי לסמן את הכיוון שלו, לפני שאתם מורידים את בלוק האלומיניום מהקריוסטט (איור 1C).
    4. בשלבים הבאים, שמור את הסימון במיקום השעה שש כדי לשמור על אותו כיוון, מה שיכול להוביל להשגת חלקים נוספים של דגימת DRG.
      הערה: אם הכיוון אובד ודגימת DRG נחתכת בזווית שונה, לא ניתן לחתוך את דגימת DRG לחלוטין מלמעלה למטה, מה שישאיר חלק מהדגימות שהושארו בחוץ בבסיס OCT ומבוזבזות, מכיוון שה-OCT הבסיסי ייתקל בעת ניסיון לחתוך את דגימת DRG (איור 1C).
  6. ביצוע הטמעת OCT של DRGs
    1. יבש את רקמת DRG לפני לשים אותו על OCT.
      1. לפני הוספת DRG לבלוק, הקפד להסיר את תמיסת 30% סוכרוז / PBS סביב הדגימה.
      2. יבשו את דגימת ה-DRG על-ידי הנחתה על צלחת פטרי יבשה (איור 2A) והעברתה ממקום אחד לאחר פעמיים או שלוש עם פינצטה יבשה (איור 2B).
      3. יבשו את הפינצטה עם רקמה נטולת סיבים לפני שתזיזו דגימת DRG נוספת (איור 2C).
    2. הניחו את ה-DRG היבש על בסיס OCT.
      1. בעזרת פינצטה יבשה, הניחו את ה-DRG היבש על ה-OCT הבסיסי בשעה 12 (איור 1D).
      2. שמור לפחות 5 מ"מ בין הקצה העליון של DRG לבין הקצה העליון של הבסיס OCT.
      3. הניחו את החלק הגבי של DRG במצב השעה 12 ואת החלק הגחוני במצב השעה שש (איור 1D).
    3. הטמע את רקמת DRG עם OCT.
      1. הוסף OCT נוסף כדי לכסות את כל דגימת DRG בצורה עגולה או אליפטית, עם DRG במרכז (איור 1E).
      2. ודא שהקצה העליון של OCT מכסה את DRG בקצה העליון של OCT הבסיס (איור 1F), מכיוון שזה מקל על העברת החלק אל מגלשת הזכוכית (איור 3A).
        הערה: אם OCT הכיסוי נמצא באמצע OCT הבסיס, הקצה העליון של OCT הבסיס יחסום את שקופית הזכוכית כדי לאסוף את המקטע (איור 3B).
      3. הקפיאו את דגימת OCT ו-DRG של הכיסוי בטמפרטורה של -20°C למשך 5 דקות נוספות (איור 1G). אין לחתוך את ה-OCT סביב דגימת DRG.
      4. חותכים את החלק העליון של הכיסוי בעובי של 30 מיקרומטר עד שה-DRG גלוי.

2. Cryosectioning של DRG

  1. שנו את עובי מקטע הקריוסטט ל-12 מיקרומטר כדי לחתוך מקטעי DRG לשקופית (איור 1H).
  2. החזיקו את מקטע ה-OCT בתחתית בעזרת מברשת צבע קטנה מקוררת לטמפרטורה של -20°C.
    הערה: חשוב לא לחתוך את כל החלק לחלוטין, אלא להשאיר 1-3 מ"מ לא חתוכים (איור 1I).
  3. השתמשו בקצה של פינצטה בטמפרטורת החדר כדי לגעת בעדינות בתחתית (מיקום השעה שש) של החלק כך שהוא יידבק למשטח הפלטפורמה (איור 1J). פעולה זו מונעת מהמקטע להתעקל בחזרה בגליל, דבר המקשה על איסוף המקטע בשקופית.
    הערה: כאשר החלק התחתון של המקטע נדבק למשטח הרציף, והחלק העליון של המקטע עדיין מתחבר ל-OCT של הכיסוי, המקטע נמצא בצורה שטוחה (איור 1K), מה שמקל מאוד על איסוף המקטע בשקופית.
  4. קח שקופית זכוכית טעונה (ראה טבלת חומרים) והנח את השקופית באיטיות מעל המקטע. ברגע שהמקטע מתחיל להידבק לשקופית, משכו בעדינות את המגלשה לאחור (איור 1L).
  5. בצע את אותו התהליך כדי להעלות מקטעי DRG נוספים לשקופית מבלי לחפוף בין המקטעים (איור 1M). ודא שמקטע DRG חדש אינו ממוקם מעל OCT של מקטע DRG אחר (איור 4), מכיוון שמקטע כזה אינו יכול להישאר טוב בשקופית וניתן לשטוף אותו במהלך תהליך הצביעה האימונוכימית.

3. צביעת ניסל של קטע DRG על מגלשת הזכוכית

  1. שטפו את המקטעים במשך 10 דקות ב-PBS בתוספת 0.1% Triton X-10. לאחר מכן, שטפו את החלקים פעמיים עם PBS.
  2. יש למרוח על המגלשה כתם בקנ"מ 1:300 (ראו טבלת חומרים) ולדגור במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.
  3. שטפו את החלק עם PBS בתוספת 0.1% Triton X-100. לאחר מכן, שטפו את החלקים פעמיים עם PBS במשך 5 דקות, ולאחר מכן במשך שעתיים בטמפרטורת החדר.
  4. יש למרוח 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) fluoromount-G (ראה טבלת חומרים) כדי לכסות את החלקים עם תלוש כיסוי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

המחקר הנוכחי אסף כ -16 קטעי DRG רציפים ואיכותיים מעכבר אחד L4 DRG. הקטעים שהתקבלו היו ללא כל עיוות. איור 1 מתאר את ההליך שלב אחר שלב עבור ההקפאה. סילוק נוזלים עודפים מחלקי הרקמה מוצג באיור 2. תהליך הטמעת OCT של הרקמות מודגש באיור 3. איור 4 מראה את המיקום הנכון של מקטעי DRG על שקופיות הזכוכית. איור 5 מראה את תמונת המיקרוסקופ הפלואורסצנטי הקונפוקלי של המבנה ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

פרוטוקול זה מספק הליך קל שלב אחר שלב עבור חתך קריוסטט של DRG העכבר כדי להשיג קטעי DRG באיכות גבוהה על שקופיות בצורה אמינה. ישנם ארבעה שלבים קריטיים בפרוטוקול זה. ראשית, דגימת DRG והפינצטה חייבות להיות יבשות לפני העברת דגימת DRG לבסיס OCT. כל נוזל המקיף את דגימת DRG ייצור קליפת קרח סביבה, וכתוצאה מכך קטעי DRG נפרדים מה-OCT ומתעקלים כלפי מעלה. שנית, אם לבלוק האלומיניום אין סימן, או אם OCT הבסיס מכסה את הסימן, חשוב לסמן בתחתית (מיקום השעה שש) של OCT הבסיס ולשמור על סימן זה במיקום השעה שש לאורך כל התהליך. שמירה על כיוון קבוע...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
AvertinSigma-AldrichT48402-25Gמרדים בעלי חיים
Epredia  Cryotome Cryostat Cryocassettes, קוטר 25 מ"מ. פישרברנד1910החזק את קטע ה-OCT בתחתית 
פינצטה ErgoFisherbrandS95310שימוש בקצה פינצטה כדי לגעת בעדינות בתחתית (6 מעלות שעון) של הקטע כך שיידבק למשטח הפלטפורמה כדי למנוע מהקטע להתעקל לאחור בגליל 
פישרברנד  שקופיות מיקרוסקופ סופרפרוסט פלוספישרברנד1255015לאסוף את מדור ה-DRG 
עטי סימוןפישרברנד133794  סמן את הכיוון של OCT
Scigen  בסיס; Tissue-Plus O.C.T. COMPOUNDFisherbrand  23730571הטמעת מדיום לדגימות רקמות קפואות כדי להבטיח טמפרטורת חיתוך אופטימלית (O.C.T).
צולב

מקורות

  1. Guan, Z., et al. Injured sensory neuron-derived CSF1 induces microglial proliferation and DAP12-dependent pain. Nature Neuroscience. 19 (1), 94-101 (2016).
  2. Yu, X., et al. Dorsal root ganglion macrophages contribute to both the initiation and persistence of neuropathic pain. Nature Communications. 11 (1), 264(2020).
  3. Costa, F. A. L., Moreira Neto, F. L. Satellite glial cells in sensory ganglia: its role in pain. Brazilian Journal of Anesthesiology. 65 (1), 73-81 (2015).
  4. Noguri, T., Hatakeyama, D., Kitahashi, T., Oka, K., Ito, E. Profile of dorsal root ganglion neurons: study of oxytocin expression. Molecular Brain. 15 (1), 44(2022).
  5. Su, P. P., Zhang, L., He, L., Zhao, N., Guan, Z. The role of neuro-immune interactions in chronic pain: implications for clinical practice. Journal of Pain Research. 15, 2223-2248 (2022).
  6. Esposito, M. F., Malayil, R., Hanes, M., Deer, T. Unique characteristics of the dorsal root ganglion as a target for neuromodulation. Pain Medicine. 20, S23-S30 (2019).
  7. Chen, X. J., Sun, Y. G. Central circuit mechanisms of itch. Nature Communications. 11 (1), 3052(2020).
  8. Guan, Z., Hellman, J., Schumacher, M. Contemporary views on inflammatory pain mechanisms: TRPing over innate and microglial pathways. F1000Research. , (2016).
  9. Boadas-Vaello, P., et al. Neuroplasticity of ascending and descending pathways after somatosensory system injury: reviewing knowledge to identify neuropathic pain therapeutic targets. Spinal Cord. 54 (5), 330-340 (2016).
  10. Guha, D., Shamji, M. F. The dorsal root ganglion in the pathogenesis of chronic neuropathic pain. Neurosurgery. 63, 118-126 (2016).
  11. Shorrock, H. K., et al. UBA1/GARS-dependent pathways drive sensory-motor connectivity defects in spinal muscular atrophy. Brain. 141 (10), 2878-2894 (2018).
  12. Sleigh, J. N., et al. Trk receptor signaling and sensory neuron fate are perturbed in human neuropathy caused by Gars mutations. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (16), E3324-E3333 (2017).
  13. Rubio, M. A., Herrando-Grabulosa, M., Gaja-Capdevila, N., Vilches, J. J., Navarro, X. Characterization of somatosensory neuron involvement in the SOD1(G93A) mouse model. Scientific Reports. 12 (1), 7600(2022).
  14. Sleigh, J. N., West, S. J., Schiavo, G. A video protocol for rapid dissection of mouse dorsal root ganglia from defined spinal levels. BMC Research Notes. 13 (1), 302(2020).
  15. Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia. BMC Research Notes. 9, 82(2016).
  16. Perner, C., Sokol, C. L. Protocol for dissection and culture of murine dorsal root ganglia neurons to study neuropeptide release. STAR Protocols. 2 (1), 100333(2021).
  17. Haberberger, R. V., Barry, C., Matusica, D. Immortalized dorsal root ganglion neuron cell lines. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, 184(2020).
  18. Pokhilko, A., Nash, A., Cader, M. Z. Common transcriptional signatures of neuropathic pain. Pain. 161 (7), 1542-1554 (2020).
  19. Martin, S. L., Reid, A. J., Verkhratsky, A., Magnaghi, V., Faroni, A. Gene expression changes in dorsal root ganglia following peripheral nerve injury: roles in inflammation, cell death and nociception. Neural Regeneration Research. 14 (6), 939-947 (2019).
  20. Miller, R. J., Jung, H., Bhangoo, S. K., White, F. A. Cytokine and chemokine regulation of sensory neuron function. Handbook of Experimental Pharmacology. (194), 417-449 (2009).
  21. Neto, E., et al. Axonal outgrowth, neuropeptides expression and receptors tyrosine kinase phosphorylation in 3D organotypic cultures of adult dorsal root ganglia. PLoS One. 12 (7), e0181612(2017).
  22. Nascimento, A. I., Mar, F. M., Sousa, M. M. The intriguing nature of dorsal root ganglion neurons: Linking structure with polarity and function. Progress in Neurobiolology. 168, 86-103 (2018).
  23. Middleton, S. J., Perez-Sanchez, J., Dawes, J. M. The structure of sensory afferent compartments in health and disease. Journal of Anatomy. 241 (5), 1186-1210 (2022).
  24. Nguyen, M. Q., von Buchholtz, L. J., Reker, A. N., Ryba, N. J., Davidson, S. Single-nucleus transcriptomic analysis of human dorsal root ganglion neurons. eLife. 10, e71752(2021).
  25. Usoskin, D., et al. Unbiased classification of sensory neuron types by large-scale single-cell RNA sequencing. Nature Neuroscience. 18 (1), 145-153 (2015).
  26. Hunt, M. A., et al. DRGquant: A new modular AI-based pipeline for 3D analysis of the DRG. Journal of Neuroscience Methods. 371, 109497(2022).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

DRGDRGOCTRNAscope
הליך עבור עכבר שורש גבי גנגליון Cryosectioning
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.