הפרוטוקול מתאר את המתודולוגיה של רישום חוץ-תאי בקליפת המוח המוטורית (MC) כדי לחשוף תכונות אלקטרופיזיולוגיות חוץ-תאיות בעכברים מודעים הנעים בחופשיות, כמו גם ניתוח נתונים של פוטנציאלי שדה מקומיים (LFPs) וקוצים, אשר שימושי להערכת הפעילות העצבית ברשת העומדת בבסיס התנהגויות מעניינות.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
הקלטה חוץ-תאית רב-ערוצית בעכברים הנעים בחופשיות
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
מטרת הפרוטוקול היא לחשוף את התכונות של ירי עצבי ופוטנציאלי שדה מקומי ברשת (LFPs) בעכברים מתנהגים המבצעים משימות ספציפיות על ידי מתאם האותות האלקטרופיזיולוגיים עם התנהגות ספונטנית ו / או ספציפית. טכניקה זו מייצגת כלי רב ערך בחקר פעילות הרשת העצבית העומדת בבסיס התנהגויות אלה. המאמר מספק הליך מפורט ומלא להשתלת אלקטרודות וכתוצאה מכך להקלטה חוץ-תאית בעכברים מודעים הנעים בחופשיות. המחקר כולל שיטה מפורטת להשתלת מערכי מיקרואלקטרודות, לכידת אותות LFP וקוצים עצביים בקליפת המוח המוטורית (MC) באמצעות מערכת רב-ערוצית, וניתוח נתונים לא מקוונים לאחר מכן. היתרון של הקלטה רב ערוצית בבעלי חיים מודעים הוא כי מספר גדול יותר של נוירונים קוצים ותת-סוגים עצביים ניתן להשיג ולהשוות, אשר מאפשר להעריך את הקשר בין התנהגות מסוימת לבין אותות אלקטרופיזיולוגיים הקשורים. יש לציין כי טכניקת ההקלטה החוץ תאית הרב-ערוצית והליך ניתוח הנתונים המתואר במחקר הנוכחי יכולים להיות מיושמים על אזורי מוח אחרים בעת ביצוע ניסויים בעכברים מתנהגים.
מבוא
פוטנציאל השדה המקומי (LFP), מרכיב חשוב של אותות חוץ-תאיים, משקף את הפעילות הסינפטית של אוכלוסיות גדולות של נוירונים, היוצרים את הקוד העצבי להתנהגויות מרובות1. קוצים הנוצרים על ידי פעילות עצבית נחשבים כתורמים ל- LFP והם חשובים לקידוד עצבי2. שינויים בקוצים וב-LFPs הוכחו כמתווכים מספר מחלות מוח, כגון מחלת אלצהיימר, כמו גם רגשות כגון פחד וכו'.3,4. ראוי לציין כי מחקרים רבים הדגישו כי פעילות ספייק שונה באופן משמעותי בין מצב ער למצב מורדם בבעלי חיים5. למרות שהקלטות בבעלי חיים מורדמים מציעות הזדמנות להעריך LFPs עם ממצאים מינימליים במצבי סנכרון קלי....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל העכברים הושגו באופן מסחרי והוחזקו במחזור אור של 12 שעות / 12 שעות חושך (האור דולק בשעה 08:00 בבוקר זמן מקומי) בטמפרטורת חדר של 22-25 מעלות צלזיוס ולחות יחסית של 50%-60%. לעכברים הייתה גישה לאספקה רציפה של מזון ומים. כל הניסויים בוצעו בהתאם להנחיות לטיפול ושימוש בחיות מעבדה של אוניברסיטת דרום סין הרגילה ואושרו על ידי ועדת האתיקה המוסדית של בעלי חיים. עכברי C57BL/6J זכרים בני 3-5 חודשים שימשו לניסויים.
1. הרכבת מערכת מיקרו-כונן
- חברו שני לוחות שתוכננו על-ידי מחשב באמצעות שני סטולים ובורג שמחזיק את המיקרו-כונן הנייד וחברו את המחבר ללוח אחד (איור 1A, Bi-iii). הנע את כונ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
מסנן בעל מעבר גבוה (250 הרץ) הופעל כדי לחלץ את הקוצים מרובי היחידות מהאותות הגולמיים (איור 6A). יתר על כן, היחידות המתועדות מה-MC של עכבר רגיל שמוינו על-ידי PCA אומתו (איור 7A-D), ורוחב העמק ומשך צורת הגל של היחידות ב-MC של העכבר נרשמו. התוצאות הראו שגם רוחב העמק וגם משך צורת הגל של תאי העצב הפירמידליים המשוערים MC (Pyn) בעכברים גבוהים יותר מאלה של הנוירונים האינטרנוירונים המשוערים (IN) (איור 7E,F; .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
הקלטה רב-ערוצית בעכברים הנעים בחופשיות נחשבה לטכנולוגיה שימושית במחקרים במדעי המוח, אך עדיין מאתגר למדי למתחילים להקליט ולנתח את האותות. במחקר הנוכחי, אנו מספקים הנחיות פשוטות ליצירת מערכות מיקרו-דרייב וביצוע השתלת אלקטרודות, כמו גם נהלים פשוטים ללכידה וניתוח של אותות חשמליים באמצעות תוכנת מיון ספייק ותוכנה לניתוח נתונים נוירופיזיולוגיים.
בהתחשב בכך שהאיכות של מערכת מיקרו-כונן בהתאמה אישית תורמת רבות לרכישת אותות יציבים ואיכותיים בעכברים הנעים בחופשיות14,15,16,17
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין מה לחשוף.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (31871170, 32170950 ו-31970915), הקרן למדעי הטבע של מחוז גואנגדונג (2021A1515010804 ו-2023A1515010899), קרן גואנגדונג למדעי הטבע לפרויקט טיפוח מרכזי (2018B030336001) ומענק גואנגדונג: טכנולוגיות מפתח לטיפול בהפרעות מוחיות (2018B030332001).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| כותרת פינים 2.54 מ"מ | YOUXIN Electronic Co., Ltd. | 1 x 5 | הגשת בקשה לכונן המיקרו הניתן להזזה שיכול להחליק על הרגליים שלו. |
| Adobe Illustrator CC 2017 | Adobe | N/A | כדי למטב תמונות מ-GraphPad. |
| BlackRock Microsystems | Blackrock Neurotech | Cerebus | מערכות אלה כוללות headsatge, המרת DA, מגבר ומחשב. |
| אגוז פליז | דונגגוואן Gaosi טכנולוגיה ושות', בע"מ | אגוז פליז M0.8 | האום מקבע את מיקום הבורג. |
| בורג פליז | דונגגוואן Gaosi טכנולוגיה ושות', בע"מ | בורג פליז M0.8 x 11 מ"מ | בורג המחזיק את המיקרו-כונן הניתן להזזה. |
| C57BL / 6J | גואנגדונג Zhiyuan טכנולוגיה ביו-רפואית ושות', בע"מ | לא ישים | גיל 12 שבועות. |
| צינור צנטריפוגה | Biosharp | 15 מ"ל; BS-150-M | לאחסון מוח עכברים עם סולוטיות סוכרוז. |
| מוליך בדיקת מבנה צבע | , בע"מ | 7440-22-4 | כדי לשפר את איכות חיבור העופרת בין פיני המחבר לחוטי Ni. |
| סרט רדיד נחושת מוליך | 3M | 1181 | להפחתת הפרעות. |
| מחבר | YOUXIN אלקטרונית ושות', בע"מ | 2 x 10P | כדי לחבר את הכותרת למערכת מיקרו-כונן. |
| ספק כוח DC | Maisheng | MS-305D | מכשיר חשמל עבור נגע אלקטרוליטי. |
| מלט שיניים | שנחאי New Century Dental Materials Co., Ltd. | לא ישים | כדי לתקן את מערכי האלקטרודות על גולגולת העכבר לאחר סיום ההשתלה. |
| ממיר אנלוגי דיגיטלי | Blackrock | 128-Channel | מכשיר הממיר נתונים דיגיטליים לאותות אנלוגיים. |
| שרף אפוקסי | Alteco | N / A | לכיסוי סיכות. |
| Excel | Microsoft N/A | כדי לסכם נתונים לאחר ניתוח. | |
| מספריים לעיניים | JiangXi YuYuan ציוד רפואי ושות', בע"מ | לא ישים | לניתוח או חיתוך חוט הניכרום. |
| מלקחיים עדינים | JiangXi YuYuan ציוד רפואי ושות', בע"מ | לא ישים | לניתוח. |
| מלקחיים | JiangXi YuYuan ציוד רפואי ושות', בע"מ | לא ישים | לניתוח או להרכבת מערכת mirco-drive. |
| מיקרוטום מקפיא | Leica | CM3050 S | לחתוך את העכבר' המוח לפרוסות |
| צינורות נימי סיליקה התמזגו | Zhengzhou INNOSEP Scientific Co., Ltd. | TSP050125 | To משמשים כצינורות המנחה לחוטי ני-כרום. |
| מיקרואלקטרודה מזכוכית | Sutter Instrument Company | BF100-50-10 | לסימון המיקומים הרצויים להשתלה באמצעות הדיו המלא. |
| תוכנת GraphPad Prism 7 | GraphPad | לא ישים | כדי לנתח ולדמיין את התוצאות. |
| טכנולוגיות Polymicro | של צינור מנחה | 1068150020 לטעינת חוטי Ni-chrome. | |
| Headstage | Blackrock | N/A | כלי להעברת אותות. |
| בלון הליום | Yili מוצרים חגיגיים ושות', בע"מ | 24 אינץ' | כדי לקזז את המשקל של ראש הבמה ומערכת המיקרו-כונן. |
| דיו | מלח עט ושות', בע"מ. | 13-2001 | לסמן את המיקומים הרצויים להשתלה. |
| תמיסת יוד | גואנגדונג Hengjian פרמצבטיקה ושות', בע"מ | לא ישים | לחיטוי הקרקפת של העכבר. |
| לינקומיצין בהידרוכלוריד ולידוקאין ג'ל הידרוכלוריד | Hubei kangzheng Pharmaceutical Co., Ltd. | 10 גרם | תרופה המשמשת להפחתת דלקת. |
| מלוקסיקם | ויקי ביוטכנולוגיה ושות', בע"מ | 71125-38-7 | להפחתת כאבים לאחר ניתוח בעכברים. |
| מיקרומניפולטורים | Scientifica | Scientifica IVM משולש | להשתלת מערכי אלקטרודות. |
| מיקרוסקופ | Nikon | ECLIPSE Ni-E | צלם את התמונות של קטעי מוח |
| בודק עכבה nanoZ | Plexon | nanoZ | למדידת עכבה או ביצוע ספקטרוסקופיה של עכבת אלקטרודה (EIS) עבור מערכי מיקרואלקטרודות רב-ערוציים. |
| NeuroExplorer | Plexon | NeuroExplorer | כלי לניתוח הנתונים האלקטרופיזיולוגיים. |
| נוירואקספלורר | Plexon, ארה"ב | תוכנה לא ישים | . |
| חוט ני-כרום | קליפורניה חוט עדין ושות' | M472490 | 35 μ m חוט ני-כרום. |
| סדרן לא מקוון | Plexon | סדרן לא מקוון | כלי למיון היחידות המרובות המוקלטות. |
| לוח PCB | האנגג'ואו Jiepei טכנולוגיית מידע ושות', בע"מ | לא ישים | לוח מעוצב ממוחשב. |
| פנטוברביטל | סיגמא | P3761 | להרדמת עכברים. |
| פנטוברביטל נתרן | סיגמא | 57-33-0 | להרדמת העכבר. |
| משאבה פריסטלטית | ארוכה יותר | BT100-1F | מכשיר המשמש לזלוף |
| פוליפורמלדהיד | סנגון ביוטק | A500684-0500 | המרכיב העיקרי של תמיסת קיבוע לקיבוע מוח עכבר |
| PtCl4 | Tianjin Jinbolan Fine Chemical Co., Ltd. | 13454-96-1 | הכנה לנוזל ציפוי זהב. |
| מלוח | גואנגדונג Hengjian פרמצבטיקה ושות', בע"מ | לא ישים: | כדי לנקות את גולגולת העכבר. |
| חוט כסף | Suzhou Xinye אלקטרוניקה ושות', בע"מ | קוטר 2 מ"מ | הגשת בקשה לאלקטרודות הארקה וייחוס. |
| מקדחת גולגולת | RWD Life Science | 78001 | לקדוח בזהירות שני חורים קטנים בגולגולת העכבר. |
| ברגי נירוסטה | YOUXIN אלקטרונית ושות', בע"מ | M0.8 x 2 | כדי להגן על מערכת המיקרו-הנעה ולקשר את ההארקה ואלקטרודות הייחוס. |
| מכשיר סטריאוטקסי | RWD מדעי החיים | 68513 | לביצוע הקואורדינטות הסטריאוטקסיות של קליפת המוח המוטורית הדו-צדדית. |
| סוכרוז | דמאו | 57-50-1 | לייבוש מוח העכבר לאחר זלוף. |
| סופר דבק | הנקל AG ושות' | PSK5C | כדי לתקן את צינור ההנחיה וחוט Ni-chrome. |
| בקר טמפרטורה | מכשיר הרווארד | TCAT-2 | לשמירה על טמפרטורת פי הטבעת של העכבר ב-37 מעלות; C |
| משחת עיניים טטרציקלין | גואנגדונג Hengjian פרמצבטיקה ושות', בע"מ | לא ישים | כדי להגן על עיני העכבר במהלך הניתוח. |
| שרשור | Rapala | N/A | כדי לקשר בין בלון לבמה. |
| וזלין | יוניליוור plc | N/A | כדי לכסות את הפער בין מערכי האלקטרודות לגולגולת העכבר. |
מקורות
- Buzsáki, G., Anastassiou, C. A., Koch, C. The origin of extracellular fields and currents--EEG, ECoG, LFP and spikes. Nature Reviews Neuroscience. 13 (6), 407-420 (2012).
- Singer, W. Synchronization of cortical ac....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
תגיות
