פרוטוקול זה מתאר את הבידוד החצי-אוטומטי של מקטע כלי הדם סטרומה (SVF) מרקמת השומן של מורין כדי להשיג קדם-אדיפוציטים ולהשיג התמיינות אדיפוציט במבחנה. שימוש בדיסוציאטור רקמות לעיכול קולגנאז מפחית את השונות הניסיונית ומגביר את יכולת הרבייה.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
בידוד חצי אוטומטי של מקטע כלי הדם הסטרומלי מרקמת השומן הלבנה באמצעות דיסוציאטור רקמות
במאמר זה
סיכום
תקציר
המחקר במבחנה של התמיינות אדיפוציט לבן, חום ובז' מאפשר לחקור פונקציות אוטונומיות תאיות של אדיפוציטים ומנגנוניהם. קווי תאים קדם-אדיפוציטיים לבנים אימורטליים זמינים לציבור ונמצאים בשימוש נרחב. עם זאת, הופעתם של אדיפוציטים בצבע בז' ברקמת השומן הלבן בתגובה לרמזים חיצוניים קשה לשחזר את מלוא ההיקף באמצעות קווי תאי אדיפוציט לבנים הזמינים לציבור. בידוד של מקטע כלי הדם סטרומה (SVF) מרקמת שומן מורין מבוצע בדרך כלל כדי להשיג preadipocytes ראשוני ולבצע התמיינות אדיפוציט. עם זאת, טחינה ועיכול collagenase של רקמת שומן ביד יכול לגרום לשינויים ניסיוניים נוטה לזיהום. כאן, אנו מציגים פרוטוקול חצי אוטומטי שונה המשתמש בדיסוציאטור רקמות לעיכול collagenase כדי להשיג בידוד קל יותר של SVF, במטרה להפחית את השונות הניסיונית, להפחית את הזיהום ולהגדיל את יכולת השחזור. ניתן להשתמש בפראדיפוציטים המתקבלים ובאדיפוציטים מובחנים לניתוחים פונקציונליים ומכניסטיים.
מבוא
ביולוגיה של רקמת השומן מושכת תשומת לב הולכת וגוברת בגלל השכיחות הגוברת של השמנת יתר וסוכרת מסוג 2 ברחבי העולם1. אדיפוציטים מאחסנים אנרגיה עודפת בצורה של טיפות שומנים, אשר משתחררים עם רעב. יתר על כן, רקמת השומן שומרת על הומאוסטזיס אנרגיה מערכתית על ידי משמש כאיבר אנדוקריני ותקשורת עם רקמות אחרות 2,3. באופן מסקרן, גם עודף רקמת שומן (השמנת יתר) וגם אובדן שומן (ליפודיסטרופיה) קשורים לתנגודת לאינסולין ולסוכרת1. אדיפוציטים מחולקים לשלושה סוגים: לבן, חום ובז'1. אדיפוציטים לבנים מאחסנים בעיקר אנרגיה עודפת כשומנים, בעוד שאדיפוציטים חומים ובז' מפזרי....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל הניסויים בבעלי חיים המתוארים בפרוטוקול זה אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) של אוניברסיטת טוקיו ובוצעו בהתאם להנחיות המוסדיות של אוניברסיטת טוקיו.
1. הכנת תמיסת אנזים ומדיום
- שים את שני הצדדים של רקמת שומן לבן מפשעתי (צד ימין וצד שמאל, כ 150 מ"ג) מעכבר בן 7-8 שבועות ו 2.5 מ"ל של תמיסת אנזים לתוך צינור C של dissociator.
- Reformed Enzyme D עם 3 מ"ל של מדיום הנשר המעובד (DMEM)/F12 של Dulbecco ללא נסיוב בקר עוברי (FBS) או אנטיביוטיקה, אנזים R עם 2.7 מ"ל של DMEM/F12 ללא FBS או אנטיביוטיקה, ואנזים A עם 1 מ"ל של חיץ A.
- הכן 2.5 מ"ל של תמיסת אנזים על ידי הוספת 100 μL של אנזים....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
פרוטוקול זה מניב אדיפוציטים ממוינים לחלוטין ועמוסי שומנים 7 ימים לאחר גרימת התמיינות האדיפוציטים. ניתן להעריך את מידת התמיינות האדיפוציט על-ידי צביעת שמן אדום o של טריגליצרידים ושומנים (איור 1A), או ניתוח ביטוי mRNA באמצעות qPCR-RT של גנים אדיפוציטים, כגון הרגולטור הראשי של אדיפוגנזה Pparg והמטרה שלו Fabp4 (איור 1B). כדי לגרום להתמיינות אדיפוציט בז 'במבחנה, מחלקה thiazolidinediones של אגוניסט PPARγ, כגון rosiglitazone, ניתן להשתמש. ואכ.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
כאן, תיארנו פרוטוקול לבידוד של SVF מרקמת שומן מורין כדי לקבל preadipocytes ולבצע התמיינות אדיפוציט במבחנה. השימוש בדיסוציאטור רקמות לעיכול קולגנאז הפחית את השונות הניסיונית, הפחית את הסיכון לזיהום והגדיל את יכולת הרבייה. בעוד הליך זה הוא שלב קריטי בתוך הפרוטוקול המוצג, התהליך הוא אוטומטי מאוד אופטימיזציה אין צורך. עם זאת, בהתאם לגיל העכבר ולמחסן רקמת השומן, ייתכן שיהיה צורך באופטימיזציה של טחינה, למשל חתיכות בגודל או זמן חיתוך.
SVF ידוע כאוכלוסייה הטרוגנית המורכבת מפראדיפוציטים, תאי ח.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
לאף אחד מהמחברים אין אינטרס כלכלי מתחרה הקשור לעבודה זו.
תודות
המחברים רוצים להודות לטקאהיטו ואדה ולסייקו יושידה (אוניברסיטת טוקיו, טוקיו, יפן) על עזרתם בניסוי. עבודה זו מומנה על ידי המענקים הבאים לי.ה.: מענק מחקר מתוכנית החוקרים הצעירים המצטיינים של אוניברסיטת טוקיו; האגודה היפנית לקידום המדע (JSPS) KAKENHI מענק סיוע למדענים בתחילת דרכם, מענק מספר 19K17976; מענק ל-Front Runner of Future Diabetes Research (FFDR) מהקרן היפנית לאנזימולוגיה יישומית, מענק מספר 17F005; מענק מהקרן למחקר פרמקולוגי; מענק מקרן הזיכרון Mochida למחקר רפואי ופרמצבטי; מענק מקרן MSD למדעי החיים; מענק מקרן Daiwa Securities Health; מענק מקרן המחקר הביוכימי של טוקיו; מענק מחקר במדעי החיים מקרן טקדה למדע; ומענק מקרן המחקר הרפואי SENSHIN.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| צלחת 100 מ"מ | קורנינג | 430167 | |
| צלחת 12 בארות | קורנינג | 3513 | |
| צלחת 60 מ"מ | IWAKI | 3010-060 | |
| ערכת דיסוציאציה של רקמות שומן, עכבר וחולדה | Miltenyi Biotec | 130-105-808 | תכולה: אנזים D, אנזים R, אנזים A ומאגר A |
| מסננת תאים 70 ומיקרו; m | BD falcon | #352350 | |
| כלים מצופים קולגן, 100 מ"מ | BD | #356450 | |
| כלים מצופים קולגן, 60 מ"מ | BD | #354401 | |
| קולגן I ציפוי מיקרופלייט 6 בארות | IWAKI | 4810-010 | |
| Dexamethasone | Wako | 041-18861 | |
| ניתוח מלקחיים | N/A | N/A | חיטוי לפני השימוש |
| מספריים לניתוח, חיטוי קהה / | חד N / A | N / A | לפני השימוש |
| מספריים לניתוח, | חיטוי | חד N / A | N / A |
| DMEM / F-12, תוסף GlutaMAX | Gibco | 10565-042 | |
| סרום בקר עוברי (FBS) | N / A | N / A | |
| gentleMACS C Tubes | Milteny Biotec | 130-093-237 | |
| gentleMACSOcto Dissociator עם מחממים | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | |
| Humulin R Injection U-100 | Eli Lilly | 872492 | |
| Indomethacin | Sigma | I7378-5G | |
| Isobutylmethylxanthine (IBMX) | Sigma | 17018-1G | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668-019 | |
| Neomycin סולפט | פוג'יפילם | 146-08871 | |
| Opti-MEM | Invitrogen | 31985-062 | |
| pBABE-neo largeTcDNA (SV40) | הוסף גן | #1780 | |
| טבליות PBS | Takara | T900 | |
| Platinum-E (Plat-E) אריזה רטרו-ויראלית תא קו | תא biolab | RV-101 | |
| Polybrene | Nacalai Tesque | 12996-81 | |
| Power Sybr Green Master Mix | Applied Biosystems | 4367659 | |
| ReverTra Ace qPCR RT Master Mix | TOYOBO | #FSQ-201 | |
| RNeasy Mini Kit (250) | QIAGEN | 74106 | |
| Rosiglitazone | Wako | 180-02653 | |
| T3 | Sigma | T2877-100mg | |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Gibco | 25200-056 |
מקורות
- Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. What we talk about when we talk about fat. Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).
- Hotamisligil, G. S., Shargill, N. S., Spiegelman, B. M. Adipose expression of tumor necrosis factor-alpha: direct role in obesity-linked insulin resistance. Science.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
