מאמר שיטה

מידול גידולי מוח in vivo באמצעות העברה מבוססת אלקטרופורציה של DNA פלסמיד המייצג חתימות מוטציה של מטופל

DOI:

10.3791/65286

⸱

23 ביוני 2023

 , 
1Board of Governor’s Regenerative Medicine Institute, Cedars-Sinai Medical Center, 2Center for Neural Sciences in Medicine, Cedars-Sinai Medical Center, 3Department of Biomedical Sciences, Cedars-Sinai Medical Center, 4Samuel Oschin Comprehensive Cancer Institute, Cedars-Sinai Medical Center, 5Department of Medicine, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שימוש במודל גידול אוטוכתוני חיסוני המונע על ידי מוטציות נפוצות של חולים לבדיקות פרה-קליניות הוא קריטי לבדיקות אימונותרפיות. פרוטוקול זה מתאר שיטה ליצירת מודלים של עכברי גידול במוח באמצעות העברה מבוססת אלקטרופורציה של DNA פלסמיד המייצגים מוטציות נפוצות של חולים, ובכך מספקים מודל עכבר מדויק, ניתן לשחזור ועקבי.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מודלים של גידולים הם קריטיים לבדיקה פרה-קלינית של גידולי מוח במונחים של בחינת טיפולים חדשים ויעילים יותר. עם עניין משמעותי באימונותרפיה, חיוני עוד יותר שיהיה מודל עקבי, רלוונטי קלינית וכשיר חיסון של עכברים כדי לבחון את אוכלוסיות הגידול ותאי החיסון במוח ואת תגובתם לטיפול. בעוד שרוב המודלים הפרה-קליניים משתמשים בהשתלה אורתוטופית של קווי תאי גידול מבוססים, מערכת המידול המוצגת כאן מאפשרת ייצוג "מותאם אישית" של מוטציות גידוליות ספציפיות למטופל בהתפתחות הדרגתית אך יעילה ממבני DNA המוחדרים לתאים מבשרי עצבים מתחלקים (NPCs) in vivo. מבני דנ"א כוללים את ניתוח הפסיפס בשיטת MADR (dual-recombinase-mediated cassette exchange), המאפשרת מוטגנזה סומטית של מוטציות מניעות בעותק יחיד. באמצעות גורי עכברים שזה עתה נולדו בין הלידה לגיל 3 ימים, NPCs ממוקדים על ידי ניצול התאים המתחלקים האלה המצפים את החדרים הצדיים. מיקרו-הזרקה של פלסמידים של DNA (למשל, MADR-derived, טרנספוזונים, sgRNA מכוון קריספר) לתוך החדרים מלווה אלקטרופורציה באמצעות משוטים המקיפים את האזור הרוסטרלי של הראש. לאחר גירוי חשמלי, הדנ"א נקלט לתוך התאים המתחלקים, עם פוטנציאל להשתלב בגנום. השימוש בשיטה זו הוכח בהצלחה בפיתוח גידולי מוח הן בילדים והן במבוגרים, כולל גידול המוח הממאיר הנפוץ ביותר, גליובלסטומה. מאמר זה דן ומדגים את השלבים השונים של פיתוח מודל גידול במוח באמצעות טכניקה זו, כולל הליך של הרדמת גורי עכברים צעירים, למיקרו-הזרקה של תערובת הפלסמיד, ולאחר מכן אלקטרופורציה. באמצעות מודל עכבר אוטוכתוני וחיסוני זה, לחוקרים תהיה היכולת להרחיב גישות מודלים פרה-קליניים, במאמצים לשפר ולבחון טיפול יעיל בסרטן.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מודלים של גידולי מוח הם חיוניים להבנת המנגנונים של היווצרות גידולי מוח וטיפול בהם. המודלים הנוכחיים כוללים בדרך כלל השתלות תת-עוריות או אורתוטופיות המיוצרות במהירות של קווי תאים סרטניים נפוצים, בהתבסס על מספר מוגבל של מוטציות מניעות או מודלים של xenograft שמקורם בחולה, תוך שימוש בעכברים מדוכאי חיסון המעכבים מחקרי אימונותרפיה תקינים 1,2,3,4. בנוסף, תוצאות פרה-קליניות אלה יכולות להוביל לתוצאות חיוביות שגויות, בכך שמודלים כאלה יכולים להציג השפעות דרמטיות, לעתים קרובות מרפאות, בתגובה לטיפול, אך זה לא מתורגם למרפאה 2,5,6,7. היכולת לייצר במהירות מודלים פרה-קליניים של עכברים מהונדסים גנטית המשקפים יותר את חתימות המוטציות של המטופל היא הכרחית לשיפור תוקפן של תוצאות פרה-קליניות.

העברה מבוססת אלקטרופורציה (EP) של פלסמידים של DNA כדי לגרום הן למוטציות אובדן תפקוד (LOF) והן למוטציות רווח תפקוד (GOF) מאפשרת יצירת מודלים כאלה. פיתחנו שיטה לייצוג מדויק עוד יותר של מוטציות דרייבר GOF הנקראת ניתוח פסיפס עם החלפת קלטות בתיווך רקומבינאז כפול, או MADR8. שיטה זו מאפשרת ביטוי של גן (או גנים) בעלי עניין באופן מבוקר וספציפי ללוקוס בתאים סומטיים8. בשילוב עם כלים מולקולריים אחרים, כגון Clustered regular interspaced short palindromic repeats (CRISPR), ניתן לשלב מוטציות שונות של חולים כדי לפתח מודלים של גידולי מוח בעכבר. שיטה זו שימשה לגידולי מוח שונים בילדים, כולל גליומות ואפנדימומה8, כמו גם מודלים של גידולי מוח במבוגרים, כגון גליובלסטומה (GBM).

בעוד ששיטת EP של מידול גידולים אינה נפוצה כמו השתלה, הדברים הבאים מדגימים עד כה את הקלות והשכפול הגבוה של מערכת מידול זו. עכברי mTmG משמשים להחדרת DNA MADR-פלסמיד 8,9. מערכת זו מאפשרת רקומבינציה של אתרי יעד loxP ו- Flp recombinase (FRT) הממוקמים במוקד Rosa26 להחדרה עוקבת של פלסמיד ה- DNA התורם (כלומר, גן GOF של עניין)8,9. הפרוטוקול הבא מדגים את הפשטות של שיטה זו לאחר תרגול קפדני, ואת היכולת לפתח מודלים של גידולי מוח בעכבר באופן אוטוכתוני ועקבי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל ההליכים בפרוטוקול זה אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של המרכז הרפואי סידרס סיני (IACUC). עכברי mTmG הומוזיגוטיים גודלו עם עכברי C57BL/6J כדי להשיג המלטות של עכברי mTmG מעורבים, הטרוזיגוטיים לשימוש בפרוטוקול הבא. בעלי החיים התקבלו ממקור מסחרי (ראו טבלת חומרים). גורי עכברים התחשמלו בין הימים 0 ו-3 לאחר הלידה (P0-P3).

1. מערך כירורגי

  1. רססו את שולחן הניתוחים בחומר חיטוי כימי (למשל, Vimoba) ונגבו, ולאחר מכן 70% אתנול, ונגבו שוב.
  2. הניחו את המכשירים/החומרים הבאים על שולחן הניתוחים: פיפטות נימי זכוכית משוכות (ראה הפניה10 על משיכת פיפטה), מספריים קטנים, מיכל פסולת חדים קטן לסיכון ביולוגי, קצות פיפטור ופיפטה מיקרוליטר, חתיכות מרובעות חתוכות פי 2 של סרט פרפין, ג'ל אלקטרודות, אלקטרודות, מחזיק למזרק המיקרו ותערובת פלסמיד DNA (ראה טבלת חומרים וקובץ משלים 1).
  3. הניחו את האביזרים הבאים על הציוד שעל שולחן הניתוחים או על הרצפה כאשר צוין: לוח הבקרה של המיקרו-מזרק, המחזיק והתקע המחוברים למכשיר, מעמד להחזקת מחזיק המיקרו-מזרק בצד (עזר הלחמה), דוושת רגל מיקרו-מזרק (על הרצפה), אלקטרודות המחוברות למכונה ודוושת רגל אלקטרודה (על הרצפה) (ראו טבלת חומרים).
    הערה: דוושת רגל האלקטרודה הונחה בצד ימין של דוושת כף הרגל של המיקרו-מזרק כתזכורת לסדר השימוש.
  4. הפעל את לוחות הבקרה של המיקרו-מזרק והאלקטרודות.
    1. בדוק את ההגדרות על מזרק מיקרו נכונים עבור הניסוי: הלחץ חייב להיות בין 220-450 hPa, תלוי איך תערובת פלסמיד נלקח.
    2. בדוק שההגדרות בלוח האלקטרודות נכונות עבור הניסוי.
      הערה: עבור הניסוי הנוכחי (ורוב המודלים של גידולי המוח שלנו), נעשה שימוש בחמישה פולסים של 120 וולט (50 מילישניות; מופרדים על ידי 950 מילישניות).

2. הכנה טרום ניתוחית

  1. מכינים את תערובת פלסמיד ב microinjector.
    1. שלפו פיפטה נימית אחת משוכה מזכוכית והכניסו אותה למחזיק המיקרו-מזרק. ודאו שהקצה מוברג כדי להחזיק אותו במקומו.
    2. להחזיק את מחזיק microinjector ביד אחת ואת מספריים קטנים עם השני; יש את קצה פיפטה מעל מיכל חד קטן biohazard. כשהמספריים סגורים, לחצו קלות על פיפטת נימי הזכוכית המוארכת. חותכים במקום שבו רואים את העיקול, כ-2 מ"מ מהפתח. אם החיתוך נראה מוצלח, מניחים בזהירות בצד.
    3. הניחו את צינור תערובת הפלסמיד הזמין מסחרית שטוח על שולחן הניתוחים ופתחו. החזיקו את קופסת קצה הפיפט או פריט אחר מאחורי תחתית הצינור כדי לשמור על יציבותו בזמן הכנת תערובת הפלסמיד. מניחים את פיפטת הזכוכית המחוברת לקו המיקרו-מזרק שטוח על השולחן ומכניסים בעדינות לצינור תערובת הפלסמיד, מוודאים שהקצה נמצא היטב בתערובת בסמוך לתחתית הצינור.
      הערה: בשל שאיבת כוח הכבידה הטבעית, שאיבת תערובת הפלסמיד תתחיל בפיפטת הזכוכית לפני שתמשוך פנימה באופן פעיל.
    4. עם קצה פיפטת הזכוכית בתערובת הפלסמיד, השתמש בלוח המיקרו-מזרק כדי להגדיל את הכמות הנמשכת פנימה. החל מ-0, סובבו את הידית הימנית וחייגו בכיוון השלילי לכיוון -60 - זה יכניס את תערובת הפלסמיד לפיפטת הזכוכית. הביאו רק ~ 1 אינץ 'של תערובת פלסמיד. סובב את הידית בחזרה ל- 0 ולאחר מכן הסר את קצה פיפטה מהתערובת.
      הערה: אין להסיר את קצה פיפטה מהתערובת כאשר הוא בכיוון שלילי, מכיוון שזה יורה את התערובת לתוך המיקרו-מזרק ואולי לתוך הצינור.
    5. בדוק את כמות התערובת בהזרקה אחת על ידי הזרקת התערובת על רצועה אחת של סרט פרפין. השתמש בדוושת הרגל ולחץ פעם אחת כדי להזריק את התערובת על סרט הפרפין. השתמש פיפטור להגדיר על 1 μL כדי לקחת את התערובת על סרט פרפין כדי לראות אם זה בדיוק 1 μL.
      הערה: אם הוא מעט פחות מ -1 μL, ניתן להגדיל את הלחץ של המיקרו-מזרק. אם הלחץ מתקרב ל-450 hPa ועדיין פחות מ-1 μL, פתח פיפטת הזכוכית קטן מדי ויהיה צורך לחתוך אותו יותר. מומלץ להחזיר את תערובת הפלסמיד לצינור לפני החיתוך. למרות זאת, עדיין תהיה תערובת שיורית על המספריים, ולכן חובה לנקות היטב את המספריים לאחר מכן עם DNase כדי להסיר את כל התערובת שנותרה. אם ההזרקה היא יותר מ 1 μL, פיפטה זכוכית משוך חדש יהיה צורך להשתמש וגזוז. כאשר כמות הבדיקה היא בדיוק 1 μL, קצה פיפטה זכוכית הוא בגודל הנכון.
    6. חזור על שלב 2.1.4 כדי לצייר תערובת פלסמיד נוספת עבור ההליך, או כ 2-3 אינץ 'לתוך פיפטה זכוכית משוך. ודא שהתערובת לא הולכת רחוק מדי לתוך המיקרו-מזרק שבו לא ניתן לראות את הסוף.
      הערה: כאשר מציירים את תערובת הפלסמיד, חשוב להימנע מבועות אוויר. אם קיימות בועות, יש צורך לבצע שוב שלב זה על ידי הסרת תערובת הפלסמיד מפיפטת הזכוכית המשוכה ולהתחיל שוב. בועות אוויר הקיימות יפגעו בשלבים הבאים בעת הזרקה לחדר הגור.
    7. כאשר תערובת הפלסמיד מוכנה בפיפטת הזכוכית המשוכה, הניחו את הפיפט המוכן בצד על מעמד עזר ההלחמה והרחק מהדרך כדי לא לגעת/להכות אותו בטעות.
  2. הכינו את בעלי החיים לניסוי.
    1. הכינו דלי קרח להרדים גורים. הוסיפו מים לדלי הקרח כדי להמיס ועזרו לקרר את מחזיק ההרדמה (למשל, ראש קופסת פיפטה).
    2. הניחו את ראש הקופסה על הקרח המומס להתקרר.
    3. הוציאו בזהירות את הגור(ים) מהכלוב והכניסו אותם לראש הקופסה המקוררת, שנשאר על הקרח. הניחו חלק עליון נוסף באופן רופף מעל החלק התחתון כדי לסייע בתהליך הקירור.
    4. לאחר 2-3 דקות, בדקו את הגורים. הפרידו את הגורים זה מזה תוך שמירה על תנוחת נטייה.
      הערה: הגורים יתפתלו, אבל זה יאט ככל שההרדמה הקרה תיכנס לפעולה. ניתן להשאיר את ראש הקופסה לצפייה קלה בגורים.
    5. כדי לבדוק הרדמה נכונה, צבטו את זנבו של הגור וחפשו תגובה. אם יש תגובה, חזור על שלב 2.2.4. אם לא נעשית צווחה או תנועה קטנה, הגור מוכן להליך.
      הערה: אין להחזיק עכברים על קרח לפרקי זמן ממושכים מכיוון שהדבר ישפיע על יכולתם להתאושש לאחר ההליך. רק מספר הגורים שניתן להזריק ולחשמל בעודם תחת הרדמה חייב להיות מונח על קרח בכל פעם; מספרים גדולים יותר ניתן לעשות עם ניסיון.

3. מיקרו-הזרקה של תערובת פלסמיד DNA לחדר המוח

  1. הניחו גור על השולחן במצב הגחון.
  2. משוך מעט לאחור בחלק האחורי של הראש כדי לדמיין את תפרי הגולגולת דרך העור. מצא למבדה על הגולגולת. החדר/אזור ההזרקה יהיה באמצע הדרך בין הלמדא לעין.
    הערה: Lambda הוא המקום שבו התפרים sagittal ו lambdoid מצטלבים. ראה הערה11 לזיהוי למדא על גולגולת העכבר.
  3. חוררים את העור עם קצה פיפטת הזכוכית בזווית ניצבת (הפיפטה ישרה לכיוון התקרה). שימו לב לכניסה קעורה קלה בעת לחיצה על הגולגולת והתנגדות ראשונית. לאחר הפירסינג וקצה פיפטת הזכוכית מציץ דרך הכניסה הקעורה, מגיעים לרמת ההזרקה המתאימה.
  4. החזיקו את קצה פיפטת הזכוכית במקומו ולחצו פעם אחת על דוושת כף הרגל של המיקרו-מזרק כדי להזריק 1 מיקרוליטר של תערובת הפלסמיד.
    הערה: ישנן שתי דרכים לראות בבירור שההזרקה הצליחה. ראשית, בקשו מחבר מעבדה אחר לצפות בתערובת הפלסמיד יורדת בפיפטת הזכוכית בזמן הזרקתה. כמו כן, אם משתמשים בצבע ירוק מהיר או בצבע אחר בתערובת הפלסמיד, הצבע יתפשט באופן גלוי בחדר מתחת לעור לאחר ההזרקה וניתן יהיה לראותו בקלות כאשר מחזיקים אותו מול מנורת ניתוח.

4. אלקטרופורציה

  1. מניחים חתיכת סרט פרפין (ריבוע אחד) על השולחן וסוחטים את ג'ל האלקטרודות על גבי הסרט. כסו את משוטי האלקטרודות בג'ל אלקטרודות על ידי הברשה נדיבה על כל משוט. כל עודף ג'ל שמטפטף ניתן להחליק על מגבת נייר.
    הערה: לאחר ה-EP הראשון, אל תתנו לג'ל מכל משוט לגעת בצד השני. פעולה זו תעביר את המטען, וכאשר מורחים על ראשו של הגור, ניתן לשמוע צליל רוחש. זה יקרה גם אם הג'ל על ראשו של הגור מאלקטרודה אחת בא במגע עם הג'ל מאלקטרודה אחרת.
    זהירות: יש להקפיד להרחיק את האצבעות מהמשוטים במהלך ההתחשמלות.
  2. החזיקו את גוף הגור ביד אחת (בדרך כלל היד הלא דומיננטית), ושמרו על האצבעות היטב מאחורי הראש.
    הערה: אם אתה ימני, הכי קל להחזיק את הגור ביד שמאל ואלקטרודות ביד ימין. אם אתה שמאלי, עשה את ההפך.
  3. קרבו את האלקטרודות לראשו של הגור כדי לוודא שהן נמצאות במיקום הנכון, כאשר האלקטרודה החיובית נמצאת בצד החיצוני של הראש למקום אליו מכוון החדר (למשל, אם אתם מכוונים לחדר השמאלי, מקמו את החיובי בצד שמאל של הגור ואת השלילי בצד ימין של הגור). תוך כדי מיקום האלקטרודות, החליקו בעדינות אצבע (בדרך כלל האגודל) בצד הגבי של הגוף/הצוואר האחורי לראש כדי לעזור להרים את הראש למקומו.
  4. בדוק את עומק ההרדמה על ידי צביטת הזנב והמשך עם אלקטרופורציה רק אם הגור נמצא במישור ההרדמה המתאים. סחטו קלות את משוטי האלקטרודות על החלק הרוסטרלי של ראש העכבר, והניחו אותם על העיניים. לחץ על דוושת רגל האלקטרודה פעם אחת כדי להתחיל את ההתחשמלות. פרוטוקול זה משתמש בחמישה פולסים של 120 וולט (50 אלפיות השנייה, מופרדים על ידי 950 אלפיות השנייה); כל פעימה תישמע.
    1. עם כל פעימה, סובב את משוטי האלקטרודה מעט נגד כיוון השעון כך שהמשוט החיובי ינוע לכיוון החלק העליון של הראש.
      הערה: עם אלקטרופורציה נכונה, אדם ירגיש / יראה את גופו של גור העכבר מתעוות עם כל פעימה.
  5. לאחר הדופק האחרון, להסיר את המשוטים ומניחים בצד. העבירו את הגור למגבת נייר נקייה ובקשו מחבר מעבדה אחר לנקות את הג'ל מראשו של הגור ולהניח מתחת למנורת חום על "סירה" של מגבת נייר.
    הערה: ודא שמנורת החום אינה קרובה מדי לגורים. דאגו שחבר מעבדה נוסף יעזור לכם בשלב זה והשגיחו כל הזמן על הגורים. לעתים קרובות זה עוזר להחזיק את הגורים ביד מתחת למנורת החום כדי להגביר את החום עבור הגור. עיסוי עדין של בטנו של הגור יכול גם לעזור בהתאוששות.
  6. החזירו את הגורים לכלוב הביתי ברגע שגופם קיבל צבע ורדרד בריא ויש להם תגובה חורקת לצביטת זנב קלה.
    הערה: לפני החזרתם לכלוב, קחו כמות קטנה מחומר המצעים של הכלוב הביתי והברישו איתו קלות את הגורים לריח הכלוב. החזירו את הגורים לכלוב מתחת לחומר המצעים וחזרו לחדר ההמתנה.

5. צעדים לאחר הניתוח

  1. החזירו את תערובת הפלסמיד שלא נעשה בה שימוש מפיפטת זכוכית המיקרו-מזרק בחזרה לצינור. אם נשארה מספיק תערובת, ניתן להשתמש בה בהליכים עתידיים. יש לאחסן בטמפרטורה של -20°C.
  2. נגבו את הג'ל משוטי האלקטרודות במגבות נייר.
  3. החזירו את כל חלקי הציוד למקומם המקורי.
    הערה: אם השתמשו במספריים כדי לחתוך את קצה פיפטת הזכוכית לאחר שתערובת הפלסמיד נלקחה, השאירו את המספריים בחוץ לניקוי יסודי עם תמיסת DNase.
  4. רססו את השולחן בחומר חיטוי כימי, נגבו, ולאחר מכן תרססו 70% אתנול, ואז נגבו שוב.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול המתואר לעיל שימש לפיתוח מוצלח של מודלים של עכברי גידול מוח בילדים ובמבוגרים, כאשר הראשון פורסם בפירוט רב בכתב העת Kim et al.8. עם טכניקה נכונה ותכנון קפדני של תכנון פלסמיד, ההצלחה לפיתוח EP של גידולים היא בדרך כלל 100%. היסטולוגיה היא הדרך המהירה והקלה ביותר לבדוק החדרה מוצלחת של פלסמיד DNA כאשר נעשה שימוש בחלבון כתב. פרוטוקול זה כולל שלבים כיצד לפתח מודל גידול מוח GBM עם 100% חדירה, כפי שאושר על ידי ניתוח היסטולוגי. פלסמיד תורם MADR ביטא הן חלבון כתב (smTagBFP2-V5) והן SpCas9 (ק...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

העברה מבוססת אלקטרופורציה של DNA פלסמיד מאפשרת שימוש in vivo בביולוגיה מולקולרית, בדומה לזו המשמשת במודלים של עכברים מהונדסים גנטית, אך עם המהירות, הלוקליזציה והיעילות של התמרה ויראלית 8,13,14. עם זאת, עם האחרון מגיעים חששות בטיחות, כמו גם תגובות חיסוניות. הראינו במערכת המידול שלנו באמצעות העברת EP של דנ"א פלסמיד כי תגובה חיסונית מינימלית מתרחשת עקב החדרה ראשונית של פיפטה נימי זכוכית לחדר המוח8. ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים לג'י בום קים על הצביעה האימונופלואורסצנטית והתמונות. אנו מודים גם לאמילי הטנאקה, נעמי קובריץ ופול לינש על העצות המועילות לגבי הפרוטוקול.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.1-2.5 ומיקרו; L פיפטה 1 ערוץEppendorf3123000012
2 ומיקרו; טיפים לפיפטה L פישרסיינטיפיק02-707-442
20 ומיקרו; טיפים לפיפטה L פישרסיינטיפיק02-707-432
2-20 ומיקרו; L 1-ערוץפיפטה Eppendorf3123000098
DNAZap PCR פתרונות פירוק DNAפישר מדעיAM9890
ECM 830 מרובע פורטור אלקטרופורטורBTX45-0662
אלקטרודה ג'לParker LabsPLI152CSZ
צבע ירוק מהירSigma-AldrichF7258-25G
עוזר לידיים סיוע בהלחמהPro'sKit900-015
מספריים מיקרו ניתוח, 4.5 אינץ' ישרחד RobozRS-5916
זן עכבר: C57BL / 6Jמעבדת ג'קסוןJAX: 000664
זן עכבר: Gt (ROSA) 26Sortm4 (ACTB-tdTomato, -EGFP) Luo / Jמעבדת ג'קסון  JAX: 007676
Parafilm Grainger16Y894
פלסמיד: pCag-FlpO-2A-Cre EV Addgene129419
Platinum Tweezertrode, 7 מ"מ קוטרBTX45-0488
מיכל חדים, 1 ליטרUlineS-15307
נימי זכוכית סטנדרטיים, 4 אינץ', 1 מ"מ OD, 0.58 מ"מ IDWorld Precision Instruments1B100F-4יש למשוך פיפטות נימיות - ראה הפניה 10 לפרטים. 
Vertical Micropipette PullerSutter InstrumentsP-30הגדרות חום: חום #1 ב-880, חום #2 ב-680; משוך ב-800. ראה הפניה 10 לפרטים נוספים על משיכה. 
פתרון טאבלט VimobaQuip LaboratoriesVIMTAB
XenoWorks מיקרו-מזרק דיגיטליSutter InstrumentsBRE
XenoWorks מחזיק מיקרופיפטהSutter InstrumentsBR-MH

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Brabetz, S., et al. A biobank of patient-derived pediatric brain tumor models. Nature Medicine. 24 (11), 1752-1761 (2018).
  2. Hadad, A. F., et al. Mouse models of glioblastoma for the evaluation of novel therapeutic strategies. Neuro-Oncology Advances. 3 (1), (2021).
  3. He, C., et al. Patient-derived models recapitulate heterogeneity of molecular signatures and drug response in pediatric high-grade glioma. Nature Communications. 12 (1), 4089(2021).
  4. Szatmári, T., et al. Detailed characterization of the mouse glioma 261 tumor model for experimental glioblastoma therapy. Cancer Science. 97 (6), 546-553 (2006).
  5. Genoud, V., et al. Responsiveness to anti-PD-1 and anti-CTLA-4 immune checkpoint blockade in SB28 and GL261 mouse glioma models. Oncoimmunology. 7 (12), 1501137(2018).
  6. Reardon, D. A., et al. Effect of Nivolumab vs Bevacizumab in patients with recurrent glioblastoma: the CheckMate 143 phase 3 randomized clinical trial. JAMA Oncology. 6 (7), 1003-1010 (2020).
  7. Wainwright, D. A., et al. Durable therapeutic efficacy utilizing combinatorial blockade against IDO, CTLA-4, and PD-L1 in mice with brain tumors. Clinical Cancer Research. 20 (20), 5290-5301 (2014).
  8. Kim, G. B., et al. Rapid generation of somatic mouse mosaics with locus-specific, stably integrated transgenic elements. Cell. 179 (1), 251-267 (2019).
  9. Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
  10. Rincon Fernandez Pacheco, D., Sabet, S., Breunig, J. J. Preparation, assembly, and transduction of transgenic elements using mosaic analysis with dual recombinase (MADR). STAR protocols. 1 (3), 100199(2020).
  11. White, H. E., Goswami, A., Tucker, A. S. The intertwined evolution and development of sutures and cranial morphology. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 653579(2021).
  12. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  13. Breunig, J. J., et al. Ets factors regulate neural stem cell depletion and gliogenesis in Ras pathway glioma. Cell Reports. 12 (2), 258-271 (2015).
  14. Hambardzumyan, D., Parada, L. F., Holland, E. C., Charest, A. Genetic modeling of gliomas in mice: new tools to tackle old problems. Glia. 59 (8), 1155-1168 (2011).
  15. Feng, W., et al. CRISPR-mediated loss of function analysis in cerebellar granule cells using in utero electroporation-based gene transfer. Journal of Visualized Experiments. (136), e57311(2018).
  16. Zhang, L., et al. Gene knock-in by CRISPR/Cas9 and cell sorting in macrophage and T cell lines. Journal of Visualized Experiments. (177), e62328(2021).
  17. Artegiani, B., Lange, C., Calegari, F. Expansion of embryonic and adult neural stem cells in utero electroporation or viral stereotaxic injection. Journal of Visualized Experiments. (68), e4093(2012).
  18. Rice, H., Suth, S., Cavanaugh, W., Bai, J., Young-Pearse, T. L. In utero electroporation followed by primary neuronal culture for studying gene function in subset of cortical neurons. Journal of Visualized Experiments. (44), e2103(2010).
  19. Zanders, E. D., Svensson, F., Bailey, D. S. Therapy for glioblastoma: is it working. Drug Discovery Today. 24 (5), 1193-1201 (2019).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים