Method Article

כימות מבוסס פלואורסצנטיות של פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית ורמות הסופראוקסיד באמצעות הדמיה חיה בתאי HeLa

DOI:

10.3791/65304

⸱

May 12th, 2023

 , 
1Department of Cell Biology, Duke University Medical Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טכניקה זו מתארת זרימת עבודה יעילה כדי להמחיש ולמדוד כמותית את פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית ואת רמות הסופראוקסיד בתוך תאי HeLa באמצעות הדמיה חיה מבוססת פלואורסצנטיות.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מיטוכונדריה הם אברונים דינמיים החיוניים להומאוסטזיס מטבולי על ידי שליטה בייצור האנרגיה באמצעות סינתזת ATP. כדי לתמוך בחילוף החומרים בתאים, מנגנוני בקרת איכות מיטוכונדריאליים שונים משתפים פעולה כדי לשמור על רשת מיטוכונדריאלית בריאה. מסלול אחד כזה הוא מיטופגיה, שבה קינאז 1 המושרה על ידי PTEN (PINK1) ופרקין פוספו-יוביקוויטינציה של מיטוכונדריה פגומה מסייעים לקיבוע אוטופגוזום ולאחר מכן לסילוק מהתא באמצעות איחוי ליזוזומים. מיטופגיה חשובה להומאוסטזיס תאי, ומוטציות בפרקין קשורות למחלת פרקינסון (PD). בשל ממצאים אלה, הושם דגש משמעותי על חקירת נזק ותחלופת מיטוכונדריה כדי להבין את המנגנונים המולקולריים והדינמיקה של בקרת איכות מיטוכונדריאלית. כאן, נעשה שימוש בהדמיה של תאים חיים כדי להמחיש את הרשת המיטוכונדריאלית של תאי HeLa, כדי לכמת את פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית ואת רמות הסופראוקסיד לאחר טיפול בקרבוניל ציאניד m-chlorophenyl hydrazone (CCCP), חומר לפירוק צימוד מיטוכונדריאלי. בנוסף, מוטציה הקשורה לפרקינסון של פרקין (ParkinT240R) המעכבת מיטופגיה תלוית פרקין באה לידי ביטוי כדי לקבוע כיצד ביטוי מוטנטי משפיע על הרשת המיטוכונדריאלית בהשוואה לתאים המבטאים פרקין מסוג פרא. הפרוטוקול המתואר כאן מתאר זרימת עבודה פשוטה באמצעות גישות מבוססות פלואורסצנטיות לכימות יעיל של פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית ורמות הסופראוקסיד.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הרשת המיטוכונדריאלית היא סדרה של אברונים מחוברים זה לזה הממלאים תפקיד מכריע בייצור אנרגיה1, חסינות מולדת2,3 ואיתות תאי 4,5. חוסר ויסות מיטוכונדריאלי נקשר למחלות נוירודגנרטיביות כגון מחלת פרקינסון (PD)6,7. פרקינסון היא הפרעה נוירודגנרטיבית מתקדמת המשפיעה על נוירונים דופמינרגיים של החומר השחור המשפיעה על כמעט 10 מיליון אנשים ברחבי העולם8. מחלת פרקינסון נקשרה גנטית למיטופגיה, מסלול בקרת איכות מיטוכונדריאלי הנחוץ לשמירה על הומאוסטזיס תאי המסי....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנת דגימות ביולוגיות

הערה: בצע את השלבים הבאים באמצעות טכניקה סטרילית בארון בטיחות ביולוגית. רססו את פני הארון ואת כל החומרים באתנול 70%.

  1. תרבית תאי HeLa וטרנספקציה
    1. תרבית 30,000 תאי HeLa בתווך הנשר המעובד של דולבקו (DMEM) המכילים 4.5 גרם / ליטר גלוקוז בתוספת 10% נסיוב בקר עוברי ותמיסת L-גלוטמין 1% (HeLa media; ראה טבלת חומרים). לוחים את התאים על צלחות הדמיה בעלות תחתית זכוכית בקוטר 35 מ"מ (ראו Table of Materials) המכילות 2 מ"ל של מדיה HeLa שחוממה מראש. שמור על תרביות HeLa ב 5% CO2 ו 37 ° C26,27.
      2. ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בפרוטוקול זה, נעשה שימוש בכימות מבוסס פלואורסצנטיות כדי למדוד את פוטנציאל הממברנה ואת רמות הסופראוקסיד של הרשת המיטוכונדריאלית לאחר טיפול CCCP (איור 1). תהליך עבודה זה השתמש בתאי HeLa, קו תאים אימורטלי שמקורו בסרטן צוואר הרחם. תאי HeLa משמשים באופן שגרתי לחקר ביולוגיה מיטוכונדריאלית והם שטוחים יחסית, מה שמקל על הדמיה של הרשת המיטוכונדריאלית באמצעות מיקרוסקופיה. כדי לחקור את תפקידו של פרקין בשמירה על בריאות הרשת המיטוכונדריאלית, תאי HeLa הודבקו באופן זמני בווקטור בקרה ריק, ParkinWT.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ניתן להשתמש בתהליך העבודה המתואר כאן כדי לכמת את פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית ואת רמות הסופראוקסיד בצורה חזקה וניתנת לשחזור באמצעות הדמיה מבוססת פלואורסצנטיות30. ישנן מגבלות טכניות חשובות שיש לקחת בחשבון בעת תכנון ניסויים אלה. תאי HeLa הודבקו בווקטור YFP ריק, YFP-ParkinWT או YFP-ParkinT240R. וקטור YFP הריק שימש כבקרה כדי לאשר שממצאי הניסוי היו ספציפיים לפרקין. עבור טרנספקציה חולפת, יחס מסה של 1:3 עבור DNA למגיב טרנספקציה נקבע בניסוי כמניב את שיעור הטרנספקציה הגבוה ביותר, .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין אינטרסים מתחרים להצהיר.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים לחברי מעבדת אוונס על המשוב המתחשב שלהם על כתב היד הזה. עבודה זו נתמכת על ידי מלגות דיוק וייטהד, חוקרי המדע והטכנולוגיה של דיוק ומלגת חנה גריי של המכון הרפואי הווארד יוז (HHMI). איור 1A נוצר באמצעות BioRender.com.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
<כימיקלים >חזקים, פפטידים וחלבונים רקומביננטיים
CCCP (קרבוניל ציאניד m-כלורופניל הידרזון) Sigma-AldrichC2759
DMEM (1x) עם 4.5 גרם/ליטר גלוקוזGibco11-965-084
DMSO,ThermoFisher ScientificD12345
סרום בקר עובריHycloneSH3007103
FuGENE 6 (מגיב טרנפיקציה)PromegaE2691
GlutaMAX 100x (תמיסת L-גלוטמין) גיבקו 35-050-061
Hoescht 33342ThermoFisher Scientific62249
MitoSOX  אדום ThermoFisher ScientificM36008
MitoTracker אדום עמוקThermoFisher ScientificM7514
Opti-MEM (מדיית סרום מחודשת)ThermoFisher31985070מדעי
טטרמתילרודמין, אתיל אסתר, פרכלורט (TMRE) ThermoFisher ScientificT669
<מודלים ניסיוניים חזקים>: אורגניזמים/זנים
HeLa-M (Homo sapiens)A. Peden (מכון קיימברידג' למחקר רפואי)N/A
DNA רקומביננטי
EYFP וקטור ריקN/AN/A
YFP-Parkin T240Rמאמר זהנוצר על ידי מוטגנזה מכוונת אתר מ- YFP-Parkin
YFP-ParkinWT Addgene; PMID:19029340RRID:Addgene_23955
Software and Algorithms
Adobe IllustratorAdobe Inc.https://www.adobe.com/products/illustrator(שינדלין, 2012)
אקסל (תוכנת גיליונות אלקטרוניים)מיקרוסופט אופיס 
ImageJhttps://imagej.net/software/fiji/
Leica Application Suite (LAS X)Leicahttps://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/
Microsoft ExcelMicrosoft Office
Prism9 (סטטיסטי) תוכנת ניתוח)תוכנת GraphPadhttps://www.graphpad.com
<חזקה>אחר
35 מ"מ צלחת, כיסוי מס' 1.5, קוטר זכוכית 20 מ"מ,MatTekP35G-1.5-20-C
(תא סביבתי)Okolabhttps://www.oko-lab.com/cage-incubator
DMiL מיקרוסקופ הפוךLeicaN/A
תוכנת דה-קונבולוציה של ברקLeicaN/A
STELLARIS 8 מיקרוסקופ קונפוקליLeicaN/A
נטול מים https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel https://www.microsoft.com/excel חממת כלוב לא מצופה

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Spinelli, J. B., Haigis, M. C. The multifaceted contributions of mitochondria to cellular metabolism. Nature Cell Biology. 20 (7), 745-754 (2018).
  2. West, A. P., Shadel, G. S., Ghosh, S. Mitochondria in innate immune responses. Nature Reviews. Immunology. 11 (....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Mitochondrial Membrane PotentialSuperoxide LevelsLive Cell ImagingHeLa CellsFluorescence QuantificationMitochondrial NetworkTMRE StainingMitoSOX FluorescenceParkin MutationMitochondrial Quality Control

Related Articles