Method Article

הערכת ההשפעה של מערכת מעבד תאי קירור חדשה על מתקן בידוד תאי האי

DOI:

10.3791/65321

⸱

August 11th, 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Qatar Metabolic Institute, Hamad Medical Corporation, 2Univ-Lille, Inserm, CHU Lille, Institute Pasteur Lille, U1190 - EGID F-59000 Lille, 3Department of Nephrology, Leiden University Medical Center (LUMC)

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול כאן מתאר מערכת מעבד תאי קירור מותאמת אישית התואמת לחדר נקי של שיטות ייצור טובות (GMP) כדי לשפר את כדאיות התאים לאחר העיבוד.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ציוד סטנדרטי לטיפול תאי, כולל מעבד תאים סטנדרטי זהב לטיהור איים אנושיים להשתלה קלינית, כמעט ולא נשמר בקירור, מה שעלול לחשוף תאים לטמפרטורות גבוהות במהלך שלב הצנטריפוגה. למערכות קירור מותאמות אישית יש יתרון ישיר על הכדאיות והתפקוד של האי האנושי. המחקר הנוכחי נועד לבחון את יעילותה של מערכת מעבד תאים מקוררים שפותחה לאחרונה וזמינה ודורשת שינויים מינימליים ולהעריך את השפעתה על כדאיות התאים האנושיים וסביבת החדר הנקי GMP. מערכת הקירור, מחליף חום מקורר מכני המוגדר ב-30 מעלות צלזיוס, שימשה להעברת אוויר יבש מקורר בדרגה רפואית לקערת מעבד התאים דרך חור שנקדח במכסה הצנטריפוגה. עם הזמינות המוגבלת של תורמי לבלב בקטאר, אימות המערכת נעשה עם טיהור שיפוע צפיפות רציף של פרוות באפי מח עצם אנושי. סטריליות, מערבולות וספירת חלקיקים נמדדו בסביבות חדרים נקיים מסוג C ו-B. לא התפתחה מערבולת סביב מעבד התא המקורר, ולא נוצרו חלקיקים מוטסים עודפים של 0.5 מיקרומטר ו-5 מיקרומטר בהתאם לתקני GMP לחדר נקי. בתחילת ובסוף שלבי האיסוף, הטמפרטורה עלתה בהתאמה ל-21.50 מעלות צלזיוס ±-0.34 מעלות צלזיוס ו-21.93 מעלות צלזיוס ±-0.20 מעלות צלזיוס במעבד התא הלא-מקורר ול-10.9 מעלות צלזיוס בלבד ±-0.17 מעלות צלזיוס ו-11.16 מעלות צלזיוס ±-0.35 מעלות צלזיוס במעבד התא המקורר (p <0.05). מעבד התא המקורר הוביל הן לשיפור ההתאוששות (98%) של חלק התא החד-גרעיני והן ליכולת הקיום (100% ± 2%) לאחר העיבוד. מערכת הקירור החדשה מפחיתה ביעילות את החום המיוצר על ידי מעבד התא תוך היעדר השפעה חלקיקית על סביבת החדר הנקי GMP. מעבד התאים המקוררים המתואר כאן הוא שיטה זולה (16,000 דולר ללא מיסים, שחרור ממכס והובלה) וזעיר פולשנית לספק קירור חזק. נכון לעכשיו, טכנולוגיה זו במתקן הטיפול בתאי GMP מיושמת לבידוד והשתלת תאי איים אנושיים עבור התוכנית הקלינית.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השתלת איים לסוכרת מסוג 1 חמורה יכולה להחזיר את הפרשת האינסולין האנדוגנית והפכה לסטנדרט הטיפול במספר מדינות1. בידוד איים הוא הליך רב-שלבי הכולל עיכול אנזימטי ומכני חם של הלבלב, ואחריו שלבים מקוררים לשחזור רקמה מעוכלת וטיהור איים עם שיפועי צפיפות רציפים או לא רציפים במעבד תאים. קירור מהיר מאט את שלב העיכול האנזימטי ומגן על האיים מפני אנזימי עיכול המשתחררים על ידי זיהום תאים אצינאריים. מעבד התאים תוכנן במקור להפריד רכיבי דם תאיים בטמפרטורת הסביבה2. הוא הוסב לטיהור איי הלבלב האנושיים של לנגרהנס ב-19893. במשך שלושה עשורים, איים אנושיים טוהרו לניסויים קליניים, ולאחרונה, לטיפול סטנדרטי, במעבד תאים עם שיפועים לא רציפים4 או שיפועי צפיפות רציפים1 שנוצרו עם gradient maker1 או שווה ערך המופעל על ידי מחשב mixer5,6,7. קבוצות אחרות דיווחו על טיהור איים מיונקים גדולים ובני אדם באמצעות בקבוקי פלסטיק גליליים גדולים8,7,9, מה ששיפר באופן משמעותי את יעילות הטיהור ואיכות האי.

ואכן, בהתחשב בתקן הזהב לטיהור איים אנושיים להשתלה קלינית10,11, מעבד התאים המיוצר היה ללא קירור. כתוצאה ישירה מהיעדר קירור, האיים נחשפו לטמפרטורות עולות במהלך שלב הטיהור. במהלך הצנטריפוגה מתרחשת עלייה בלתי מבוקרת בטמפרטורה עקב החיכוך המכני של הרוטור12,13. מעבדי התאים הותאמו למערכת קירור במרכזי בידוד איים שהגדילה סטטיסטית את הפרשת האינסולין המושרה על ידי גלוקוז ואת כדאיות התאים, מה שאישר את היתרון של שמירה על איי הלבלב בטמפרטורות נמוכות במהלך הליך הטיהור14,15.

יש לציין כי בסוף שנות ה-80 נבנו 10 אבות טיפוס מקוררים כדי להפחית את נזקי האי במהלך טיהור שיפוע הצפיפות, אך לא זכו לתשומת לב נוספת. אבות הטיפוס של מעבד התאים התבססו על קירור ציר וקערה עם פוליאתילן גליקול צונן. בפרט, פתרונות לטיהור איים, כולל פתרונות לשימור איברים ושיפועי צפיפות פוליסכרידים, עלולים להזיק לכדאיות האי כאשר משתמשים בהם בטמפרטורת החדר או מעל טמפרטורת החדר16,17,18. השוואה בין אסטרטגיות קירור שונות של מעבד התאים לטיהור תאי איים לעומת מעבד התאים המקורי שאינו מקורר הוערכה כדי להילחם בעלייה הבלתי מבוקרת של הטמפרטורה המתרחשת עקב חיכוך הרוטור. נעשו מספר ניסיונות לקרר את מעבד התאים במהלך טיהור האיים האנושיים. ניתן למקם את מעבד התא באופן זמני או קבוע בחדר קירור שתוכנן במיוחד כדי לשמור על טמפרטורה של 0-8 מעלות צלזיוס19 במהלך צנטריפוגת השיפוע המשמשת כיום במרכזי בידוד האיים באוניברסיטת אילינוי שיקגו19, אוניברסיטת מיאמי14, אוניברסיטת אוקספורד facilities15ואוניברסיטת סן פרנסיסקו (יחידת הקירור המותאמת אישית עוטפת את המעבד הסלולרי)., שינוי נוסף כולל קירור ליבה של ציר מעבד התא עם מערכת קירור המשתמשת בקירור חנקן נוזלי מבוקר אלקטרונית בז'נבה, שוודיה וצ'כיה15,19. חלופה נוספת באמצע שנת 2000 הייתה קירור הליבה של מעבד התא עם יחידת מיזוג אוויר12 או על ידי קירור נוזלי של הפיר באוניברסיטת ליל.

שינויי קירור של מעבד התא אינם זמינים ומגיעים עם סיכונים (לחות, הצטברות עיבוי) בתוך סביבות חדר נקי GMP, כולל אובדן אחריות וסירוב של הקונסטרוקטור לטפל במכונה. כתוצאה מכך, חלק ממרכזי האיים, כולל מילאנו, איטליה, אוסלו, נורבגיה ואדינבורו, סקוטלנד, אינם משתמשים במערכת קירור למעבדי תאים במהלך תהליך טיהור האיים15.

המחקר הנוכחי תוכנן לבחון את היעילות של מצנן זמין שפותח לאחרונה בשילוב עם מערכת מעבד תאים שהשתנתה באופן מינימלי. בקצרה, המצנן מבוסס האוויר המתואר כאן הוא מחליף חום בקירור מכני השולט בטמפרטורה של 1 רגל מעוקב סטנדרטי לדקה (SCFM) של גז יבש בין -40 מעלות צלזיוס ל-100 מעלות צלזיוס. מערכת קירור זו דורשת אספקת אוויר רפואי יבש. האוויר יזרום דרך הקו ומחליף החום והחוצה דרך הזרבובית (7.9 מ"מ). תנור חימום הממוקם בתוך הזרבובית מספק חום כדי לשלוט בטמפרטורת זרם האוויר. נרכש כיסוי צנטריפוגה מפלסטיק מוצק רזרבי, ובוצעו שינויים מינימליים. בכיסוי נקדח חור בקוטר 13.3 מ"מ, ואוויר מקורר הועבר מפיית הקירור למעבד התא דרך החור במכסה הצנטריפוגה. האוויר הרפואי המקורר הוזרק בתוך קערת הצנטריפוגה של מעבד התא עם שליטה מתמדת על טמפרטורת הנוזלים או שיפועי הצפיפות.

הערכנו את הביצועים הטכניים של מעבד התא המקורר ואת ההשפעה של גוף הקירור על סביבת החדר הנקי GMP. המוקד העיקרי היה להשיג טמפרטורה נמוכה מאוד (<10 מעלות צלזיוס) במהלך טיהור האיים האנושיים כדי לשמר את הכדאיות. באמצעות הפרדת צפיפות מעיל באפי כפרוקסי לבידוד איים, קבענו את היעילות של פרוטוקול קירור זה על כדאיות התא.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה השתמש בדם מלא שהושלך ואינו מתאים לשימוש בהתאם להנחיות המוסד. אישור IRB והסכמה מדעת אינם רלוונטיים.

1. הגדרת מעבד תאים מקוררים

הערה: כל ההליכים חייבים להיעשות בסביבת חדר נקי, והצוות חייב לכבד נהלי לבוש בחדר נקי.

  1. רכישת ציוד
    1. רכשו מכסה פרספקס רזרבי. רכשו את מערכת ציוד הקירור, מצנן עם בקר טמפרטורת זרם גז בקירור מכני, מייבש אוויר, ווסת לחץ וזרימה, ואת האחריות (אופציונלי). ראה טבלת חומרים להפניות.
      הערה: העלות הכוללת היא 16,133 דולר ללא דמי משלוח או מכס.
    2. הזמינו אוויר רפואי יבש, גז רפואי דחוס העומד בתקן (פרמקופיאה אירופאית רפרנס 1238) מספק הגז הרפואי המקומי. רכשו 2 צילינדרים של 6.8 מ"ק (47 ליטר: 23 ס"מ x 153 ס"מ; קוטר x אורך).
  2. הגדרת הציוד (<מחלקה חזקה = "xfig">איור 1 ו- <מחלקה חזקה = "xfig">איור 2)
    1. יש להזין את הציוד בחדר הנקי GMP (יש לחטא לפני הכניסה לחדר הנקי בהתאם לנהלי GMP).
    2. עבור האוויר הדחוס בדרגה רפואית, התקן קו גז במקום למקם את בלון הגז ישירות בחדר הנקי.
  3. שינוי מעבד התא לקירור
    1. ראשית, הסר את מכסה הפרספקס. שמור את כיסוי הפרספקס המקורי למקרה שיש בעיה באחריות. קדחו חור במכסה הרזרבי של מעבד התאים בקוטר שיתאים ויתאים לקוטר החיצוני של קצה פיית מכשיר הקירור כדי למנוע סדקים במכסה הצנטריפוגה (מומלץ 13.3 מ"מ).
    2. תקן סוגריים יחד עם חתיכת קצף עגולה. זה נעשה כדי למנוע שבירה ו/או שריטות של המכסה, להחזיק את פיית הקירור במקומה מעל מעבד התא, כדי להגן על המכסה מפני כיפוף יתר עקב הלחץ הגבוה של האוויר המוזרק, כדי לתמוך במשקל הזרבובית, ולבסוף כדי להבטיח את הבטיחות המרבית למפעיל כדי לקבל גישה חופשית ובטוחה לכל פונקציות מעבד התאים הנדרשות במהלך הליך הניסוי.
    3. חבר את מערכת הקירור למעבד התא על ידי הצמדת פיית הקירור לחור בפרספקס. אבטח אותו עם סוגריים וכריות קצף.
    4. הנח את בית הקירור במרחק של עד 8 רגל (2.44 מ') מהזרבובית. אחסן את בקר הטמפרטורה בארון נפרד והנח אותו בטווח של 6 רגל (1.83 מ') מבית הקירור.
    5. הגדר את נקודת ההגדרה של המצנן על -40 מעלות צלזיוס לקירור זרם האוויר על המצנן. טמפרטורת אוויר היציאה מצוינת ברציפות על המחוון הדיגיטלי לרזולוציה של 0.1 מעלות צלזיוס. הגדר את טמפרטורת היציאה באופן דיגיטלי ל-0.1 מעלות צלזיוס עם בקר הטמפרטורה.
    6. שלוט בלחץ ובקצב הזרימה של אספקת האוויר במודול וסת הלחץ והזרימה (<מחלקה חזקה = "xfig">איור 2) לפני ההזנה לצידנית. הגדר אותם לקצבי זרימה של 55 psi ו-4 SCFM, בהתאמה, כדי להגיע לתנאים האופטימליים בזרם אוויר מקורר ב-30 מעלות צלזיוס ±-2 מעלות צלזיוס.
    7. ודא שאספקת הגז הרפואי מווסתת בלחץ יוצא של 5 בר ויכולה להימשך לפחות 90 דקות, מכיוון שהדבר נדרש כדי שהאוויר הדחוס יגיע ל-30 מעלות צלזיוס.< br/> הערה: אוויר יבש רפואי הוא גז רפואי דחוס, ואוויר יבש בלחץ מלא תואם את הדרגה הסטנדרטית.
    8. העבר 5 בר מפיית קירור המחוברת למכסה מעבד התא דרך חור שנקדח במכסה הצנטריפוגה. הזריקו את האוויר הרפואי המקורר לתוך קערת הצנטריפוגה של מעבד התא (איור 2). בחר את מיקום הזרקת האוויר באופן שהאוויר המקורר מופנה בניצב לשפת האלומיניום של רוטור הצנטריפוגה.
    9. בעת הכנת מעבד התאים, ודא שהרוטור נמצא בטמפרטורת החדר (18 מעלות צלזיוס). הגדר את הרגולטור התרמי האוטומטי של מערכת הקירור ל-30 מעלות צלזיוס וכוון הזרקות אוויר קריר לרוטור.
      הערה: תנאי ניסוי שונים נבדקו כדי להגיע לשיפוע טמפרטורה אופטימלי של +4 מעלות צלזיוס, הדרוש כדי להתגבר על ההתנגדות התרמית של מערכת מפריד התאים של מעבד התאים וחימום הרוטור במהלך צנטריפוגה. הרגולטור התרמי המתוכנת ישמור על טמפרטורת היעד האופטימלית בתוך מכונת עיבוד התאים במהלך ההליך, במיוחד במהלך הצנטריפוגה, בטמפרטורת חדר נקייה של +18 מעלות צלזיוס.
      1. הגדר את מעבד התא עם שלב הקירור המקדים הראשון כדי לקרר את המעבד (ללא ערכת המעבד התא) ב-+3 מעלות צלזיוס למשך 30 עד 45 דקות, ושלב הקירור המקדים השני של הפעלת מעבד התא צריך להיות עם הערכה מקוררת מראש ב-+4 מעלות צלזיוס ב-134 x גרם, למשך 5 דקות.

2. ספירת חלקיקים מוטסים

  1. הערך את התאימות של מכשיר הקירור לסביבת החדר הנקי GMP לפי תקן ISO 14644-1 כדי להעריך את ההשפעה של התקני חום בשלב הפעולה.
  2. השתמש בניטור ספירת חלקיקים כדי לספק ראיות לכך שרמת הניקיון הנדרשת מושגת בנקודות בקרה קריטיות במנוחה ובפעולה.
    1. המספר המינימלי של מיקומי הדגימה תלוי באזור הנמדד. חשב זאת באמצעות המשוואה
      figure-protocol-1
      כאשר A הוא השטח של החדר הנקי או החלל הנקי הנשלט באוויר ב-m2, ו-NL הוא מספר מיקומי הדגימה המעוגלים למספר שלם.
    2. נפח הדגימה המוטס הוא הנפח המינימלי בכל מיקום. ודא שנפח האוויר גדול מספיק כדי לספור 20 חלקיקים בגודל החלקיקים הגדול ביותר שצוין. חשב את נפח הדגימה המוטסת באמצעות המשוואה
      V= 20/C x 1000
      כאשר V הוא נפח הדגימה הבודד המינימלי לכל מיקום, מבוטא ב-L, ו-C הוא מגבלת המחלקה (מספר חלקיקים/מ"ק).
    3. עבור כל מיקום, בהתאם לאזור, השתמש בדגימה אחת או יותר. ודא שהנפח הנמוך ביותר שנדגם בכל מיקום הוא 2 ליטר וזמן הדגימה המינימלי הוא לפחות דקה אחת.
  3. לפני הדגימה, נקה את מכשיר מונה החלקיקים בעזרת פילטר טיהור. הסר את המסנן והנח אותו עם הגשושית האיזוקינטית לדגימה.
  4. הנח את מכשיר מונה החלקיקים במיקום הדגימה המזוהה. התחל איסוף דגימות מהמסך הראשי של התקן מונה החלקיקים.
  5. לאחר סיום הדגימה, קח את מכשיר מונה החלקיקים למיקום הבא. לאחר סיום כל המיקומים לדגימה, סקור את הנתונים והדפס דוח.
  6. כאשר ריכוז החלקיקים הממוצע עבור כל נקודות הדגימה באזור יורד מתחת למגבלת המחלקה המצוינת בטבלה 1, שקול את החדר שהועבר לריכוז החלקיקים המותר.

3. הכנת שיפוע ועיבוד הפרדת תאים

  1. לפני הניסוי, יש לקרר מראש את שיפועי הצפיפות הקלים והכבדים וערכות מעבד התאים למשך הלילה בטמפרטורה של +4 מעלות צלזיוס במקרר.
  2. יש לקרר מראש את מעבד התאים למשך 45 דקות במנוחה (כלומר, להפעיל את מעבד התא לפני השימוש). שמור על הטמפרטורה בין +2 מעלות צלזיוס ל-+5 מעלות צלזיוס. הכנס את ערכת המעבד הסלולרי מקוררת מראש ב-+4 מעלות צלזיוס.
  3. עבור יצרנית השיפוע הסטנדרטית מקוררת אתנול עם מעיל כפול (אופציונלי; <מחלקה חזקה="xfig">איור 3) חבר את 2 תאי הזכוכית והנח אותם על מערבל מגנטי. מהדק את הצינור בין 2 התאים. מצננים את יצרנית השיפוע עם צ'ילר קירור במחזור אתנול ב-0 מעלות צלזיוס.
  4. ראשית, התכוננו להעמיס את השכבה הכבדה בתחתית השקית על ידי מילוי החדר ב-130 מ"ל של שיפוע צפיפות כבד (HD; 1.087 גרם/מ"ל). טען במהירות משאבה של 150 מ"ל לדקה.
  5. לאחר שהשיפוע הכבד נמצא בתיק, הוסף 130 מ"ל של צפיפות גבוהה (HD) לכוס הקדמית ו-140 מ"ל של שיפועים בצפיפות נמוכה (LD; 1.063 גרם/מ"ל) מאחור (מהדק סגור).
  6. הסר clamp את ההמוסטט/clamp בין 2 התאים וצור שיפוע רציף במהירות משאבה של 50 מ"ל/דקה.
  7. הכינו מראש תאי מעיל באפי חד-גרעיניים אנושיים לטיהור ממספר פרוות באפי אנונימיות שנאספו מתוצרי פסולת דם מלא (40 מ"ל עד 60 מ"ל של דם מלא נוספו ל-10 שקיות מעיל באפי) בהתאם לזמינות מבנק הדם.
    1. הפרדת MNC
      1. השתמש בצנטריפוגה של שיפוע צפיפות לבידוד תאים חד-גרעיניים אנושיים בצפיפות נמוכה. לשם כך, בצע את השלבים המתוארים להלן.
      2. להכנת תאים, חשב את נפח הדם (דם מלא נוגד קרישה או מעיל באפי תלוי). לדלל את הדם בתמיסת חיץ 2x-4x על ידי ערבוב היפוך. ככל שהדם מדולל יותר, כך טוהר התאים החד-גרעיניים טוב יותר.
      3. הכן את המאגר על ידי ערבוב מאגר פוספט עם נוגד קרישה. חשב את מספר הצינורות הדרושים על ידי חלוקת נפח הדם ב -35 מ"ל ושפך 15 מ"ל של תמיסת שיפוע בצפיפות 1.073 בכל צינור.
      4. שכבה הדרגתית של 35 מ"ל של תרחיף הדם המדולל על שיפוע הצפיפות על ידי ריצה עדינה על פני שיפוע הצפיפות באמצעות מזרק של 60 מ"ל המחובר למחט; לנפחים קטנים, השתמש בפיפטה. נסו לא לשבש את הממשק, מכיוון שהדבר יגרום לשכבה חד-גרעינית גרועה.
      5. צנטריפוגה ב-400 x גרם למשך 20 דקות ב-20 מעלות צלזיוס ללא הפסקות (תאוצה 0, האטה 0). לאחר הצנטריפוגה, קצרו בעדינות את שכבת הממשק של תאים חד-גרעיניים באמצעות פיפטת העברה סטרילית. העבירו את התאים לצינור חרוטי חדש נוסף של 50 מ"ל.
      6. שטפו את התאים פעמיים עם מאגר (PBS בתוספת נוגד קרישה). לכביסה הראשונה, מלאו את הצינור המכיל את התאים במאגר עד 50 מ"ל. צנטריפוגה ב-300 x גרם למשך 10 דקות ב-20 מעלות צלזיוס לתאי גלולה (תאוצה 9, האטה 0). יש להסיר בעדינות את כל ה-supernatant בזהירות.
      7. בצע את השטיפה השנייה להסרת טסיות דם. השעו מחדש את הגלולה לנפח של 50 מ"ל עם מאגר. צנטריפוגה ב-200-300 x גרם למשך 10 דקות ב-20 מעלות צלזיוס (תאוצה 9, האטה 0).
      8. להרכיב מחדש את התאים לנפח סופי של 5 מ"ל, תאים אלה צריכים להיות בעלי משקל סגולי הדומה ל-MNC בצפיפות נמוכה <1.073. מדוד את הצפיפות הספציפית של השיפוע באמצעות מד צפיפות.
      9. השעו מחדש את הגלולה לנפח סופי של 100 מ"ל עם 95 מ"ל של מדיום שיפוע בצפיפות גבוהה (1.083 גרם/מ"ל) בשקית העברה. יש להשתמש במוצר זה לטיהור באמצעות מפריד תאים. הנפח הסופי של 100 מ"ל מכיל תאים ומדיום שיפוע בצפיפות גבוהה של 1.083.
        הערה: ניתן לאחסן את מעיל הבאפי במקרר למשך הלילה ב-PBS המכיל 0.5% BSA או פלזמה אוטולוגית. ניתן לכבס גם את מעיל האפי.
  8. טען למעלה את השיפועים המוכנים מראש עם מקסימום של 30 מ"ל של MNC מבודד ממעיל האפי התלוי ב-100 מ"ל של מדיום שימור מרוכז באמצעות משאבה פריסטלטית ב-25 מ"ל לדקה. שמור על השיפוע ב-+4 מעלות צלזיוס.
  9. מדוד ברציפות את הטמפרטורה בתוך מעבד התאים באמצעות תרמו-בדיקה מכוילת מראש. באמצעות צמד תרמי דיגיטלי המחובר לבדיקה תרמית סטרילית, עקוב אחר טמפרטורת השיפועים והתאים במהלך התהליך.

4. אופטימיזציה של שלבים שונים של טעינת שיפוע

  1. הכנס את ערכת המעבד הסלולרי מקוררת מראש ב-+4 מעלות צלזיוס. בתום העמסת השיפוע, הגדר את הצנטריפוגה במהירות נמוכה יחסית (537 x גרם) על מנת למזער את החום שנוצר על ידי הרוטור.
  2. כבה את מעבד התאים כדי לאפשר למערכת ההידראולית לחזור לרמות שלפני הריצה ולשחרר אוויר.
  3. הפעל מחדש את מעבד התא ב-537 x g והוסף את שיפועי הצפיפות הכבדים (130 מ"ל) והנמוכים (140 מ"ל) כדי ליצור שיפוע צפיפות רציף ב-+4.3 מעלות צלזיוס וקצב זרימה של 50 מ"ל/דקה.
  4. טען את מעיל הבאפי (30 מ"ל) עם 100 מ"ל של אמצעי אחסון קר ב-+6 מעלות צלזיוס וקצב זרימה של 25 מ"ל לדקה. הוסף 50 מ"ל (25 מ"ל x 2) של תמיסת כביסה.
  5. לאחר 5 דקות ב-+5 מעלות צלזיוס, אסוף שיפוע מסתובב ב-12 בקבוקים בקצב זרימה של 100 מ"ל/דקה.
  6. יש למלא את הצינורות בחומר שטיפה (M199 + 20% אלבומין אנושי + 10% סטרפטומיצין פניצילין). מלאו את צינור 1 ב-100 מ"ל של חומרי כביסה ו-150 מ"ל של תאים וצינורות 2-12 עם 225 מ"ל של חומרי כביסה ו-25 מ"ל של תאים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ההשפעה של מעבד התאים המקוררים על החדר הנקי של GMP כומתה לראשונה. שיטות סטנדרטיות השתמשו במונה חלקיקים המודד את זיהום החלקיקים הנישאים באוויר בסביבת חדר נקי בדרגת GMP Class C ו-Class B בנקודות קריטיות בקרבת מעבד התא ומערכת קירור אוויר בלחץ. התוצאות הראו כי לא התפתחה מערבולת סביב הציוד. נתונים מתועדים הראו כי לא היה עודף של 0.5 מיקרומטר ו-5 מיקרומטר חלקיקים הנישאים באוויר לפי תקני GMP דרגה C לחדר נקי, דרגה B ו-BSL III (<מחלקה חזקה = "xfig">איור 4).

כל הניסויים בוצעו עם שיפ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מתקני בידוד איים ברחבי העולם אימצו במשך עשרות שנים טיהור איים אנושיים במעבד תאים ייעודי מחדש. למרות שחלק ממתקני הייצור של האיים ממשיכים לעבד איים במעבד תאים לא מקורר, רוב המרכזים משתמשים בגרסה מקוררת של מעבד התאים 10,11,15. מרכזים ממקמים את מעבד התאים בחדר קירור שיש לו את החיסרון העיקרי של חשיפה ללחות ועיבוי, או מבצעים שינויים גדולים מבחינה טכנית במעבד התא עצמו, כולל הציר, שיש לו השלכות מיידיות על אחריות המכונה ותחזוקה מונעת שלה...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין ניגוד עניינים.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מבקשים להודות למכון הגנומי האירופי לסוכרת (ANR-10- LABEX-0046 עד FP) ולמכון המטבולי של קטאר - תאגיד רפואי חמד, קטאר. המחברים מודים גם למרכז המחקר הרפואי בתאגיד הרפואי חמד על התמיכה בדמי עיבוד המאמרים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
<חזק>ציוד
אוויר נגד חלקיקי אווירLasair III 
אייר ג'ט XR40 SP ScientificFTS system XR40
Biosafety CabinetThermo ScientificEQ-1301
Circulating Cooling ChillerJulaboCF30
COBE 2991 Terumo BCT
BiorepCCT-01
יצרנית שיפוע עם מעיל כפול מותאם אישית בבית
KJT-מדחום צמד תרמיחנה מכשיריםHI93551Nלמדידת טמפרטורת נוזלים
מערבל מגנטי Thermo Scientific88880014
משאבה פריסטלטית מדחום MasterFlexMK-77921-79
 Extech InstrumentsRMS 430לטמפרטורת COBE
חרוזים ללא מיםCole-Parmer10122-00
<חזק>חומרים וריאגנטים
BD ערכת ספירת תאי גזעBD Biosciences 
ערכת צינורות 344563 COBE 2911Terumo BCT90819
צינורות חרוטיים 250 מ"לקורנינג430776
צפיפות שיפוע 1.1ביוכרום L6155
בקבוקים חד פעמיים מדורגיםתרמו פישר382019-1000
אלבומין אנושי 20% קדריון ביופארמה 8091600
M199 תמיסת כביסה קורנינג 99-784-ס"מ 
צינורות מאסטרפלקסMasterflex96400-6
רפואי יבש אווירלינדה בריאותMedi On 22
Pencillin-streptomycin גיבקו 
ThermoprobeBiorepTC-02חיישן תרמי
טריפן כחול סיגמא אולדריץ'15250061
אוניברסיטת ויסקונסין בלזר (UW) גשר החיים RM/N 4055מדיום שימור
מגש קירור חרוטי אמבט 15140122

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Shapiro, A. M., et al. Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen. The New England Journal of Medicine. 343 (4), 230-238 (2000).
  2. Vesilind, G. W., Simpson, M. B., Colman, R. E., Kao, K. J. Evaluation of a centrifugal blood cell processor for washing platelet concentrates. Transfusion. 28 (1), 46-51 (1988).
  3. Lake, S. P., et al. Large-scale purification of human islets utilizing discontinuous albumin gradient on IBM 2991 cell separator. Diabetes. 38, 143-145 (1989).
  4. Ricordi, C., et al. Human islet isolation and allotransplantation in 22 consecutive cases. Transplantation. 53 (2), 407-414 (1992).
  5. Friberg, A. S., Stahle, M., Brandhorst, H., Korsgren, O., Brandhorst, D. Human islet separation utilizing a closed automated purification system. Cell transplantation. 17 (12), 1305-1313 (2008).
  6. Bampton, T. J., et al. Australian experience with total pancreatectomy with islet autotransplantation to treat chronic pancreatitis. ANZ Journal of Surgery. 91 (12), 2663-2668 (2021).
  7. Doppenberg, J. B., Engelse, M., de Koning, E. J. P. PRISM: A Novel Human Islet Isolation Technique. Transplantation. 106 (6), 1271-1278 (2021).
  8. Shimoda, M., et al. Islet purification method using large bottles effectively achieves high islet yield from pig pancreas. Cell Transplantation. 21 (2-3), 501-508 (2012).
  9. Noguchi, H. Pancreatic Islet Purification from Large Mammals and Humans Using a COBE 2991 Cell Processor versus Large Plastic Bottles. Journal of Clinical Medicine. 10 (1), 10(2021).
  10. Shapiro, A. M., et al. International trial of the Edmonton protocol for islet transplantation. The New England Journal of Medicine. 355 (13), 1318-1330 (2006).
  11. Ricordi, C. National Institutes of Health-Sponsored Clinical Islet Transplantation Consortium Phase 3 Trial: Manufacture of a Complex Cellular Product at Eight Processing Facilities. Diabetes. 65 (11), 3418-3428 (2016).
  12. Swift, S., Kin, T., Mirbolooki, M., Wilson, R., Lakey, J. R. T. Comparison of cooling systems during islet purification. Cell Transplantation. 15 (2), 175-180 (2006).
  13. Rilo, H. L. R., et al. Comparison of islet number and viability obtained during purification on Euro-Collins-Ficoll gradients processed on a refrigerated or nonrefrigerated COBE 2991 cell separator. Transplantation Proceedings. 26 (6), 3430(1994).
  14. Chadwick, D. R., et al. Pancreatic islet purification using bovine serum albumin: The importance of density gradient temperature and osmolality. Cell Transplantation. 2 (4), 355(1993).
  15. Nano, R., et al. Heterogeneity of human pancreatic islet isolation around Europe: results of a survey study. Transplantation. 104 (1), 190-196 (2020).
  16. Chadwick, D. R., et al. Storage of pancreatic digest before islet purification. Transplantation. 58 (1), 99-104 (1994).
  17. Amrani, M., et al. Detrimental effects of temperature on the efficacy of the University of Wisconsin solution when used for cardioplegia at moderate hypothermia. Comparison with the St. Thomas Hospital solution at 4 degrees C and 20 degrees C. Circulation. 86, 280-288 (1992).
  18. Fremes, S. E., Li, R. K., Weisel, R. D., Mickle, D. A., Tumiati, L. C. Prolonged hypothermic cardiac storage with University of Wisconsin solution. An assessment with human cell cultures. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 102 (5), 666-672 (1991).
  19. Adewola, A., et al. Comparing cooling systems for the COBE 2991 cell separator used in the purification of human pancreatic islets of Langerhans. Cryo Letters. 31 (4), 310-317 (2010).
  20. Keymeulen, B., et al. Implantation of standardized beta-cell grafts in a liver segment of IDDM patients: graft and recipients characteristics in two cases of insulin-independence under maintenance immunosuppression for prior kidney graft. Diabetologia. 41 (4), 452-459 (1998).
  21. de Kort, H., de Koning, E. J., Rabelink, T. J., Bruijn, J. A., Bajema, I. M. Islet transplantation in type 1 diabetes. BMJ. 342, (2011).
  22. Barbaro, B., et al. Improved human pancreatic islet purification with the refined UIC-UB density gradient. Transplantation. 84 (9), 1200-1203 (2007).
  23. Lemarie, C., et al. A new single-platform method for the enumeration of CD34+ cells. Cytotherapy. 11 (6), 804-806 (2009).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Islet Cell IsolationCooled Cell ProcessorDensity Gradient PurificationHuman Islet ViabilityCell Therapy EquipmentCleanroom GMP StandardsMononuclear Cell FractionCentrifugation StepAirborne Particle AssessmentCell Viability Measurement

Related Articles