הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

הערכת ההשפעה של מערכת מעבד תאי קירור חדשה על מתקן בידוד תאי האי

782 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/65321

⸱

11 באוגוסט 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Qatar Metabolic Institute, Hamad Medical Corporation, 2Univ-Lille, Inserm, CHU Lille, Institute Pasteur Lille, U1190 - EGID F-59000 Lille, 3Department of Nephrology, Leiden University Medical Center (LUMC)

במאמר זה

סיכום

הפרוטוקול כאן מתאר מערכת מעבד תאי קירור מותאמת אישית התואמת לחדר נקי של שיטות ייצור טובות (GMP) כדי לשפר את כדאיות התאים לאחר העיבוד.

תקציר

ציוד סטנדרטי לטיפול תאי, כולל מעבד תאים סטנדרטי זהב לטיהור איים אנושיים להשתלה קלינית, כמעט ולא נשמר בקירור, מה שעלול לחשוף תאים לטמפרטורות גבוהות במהלך שלב הצנטריפוגה. למערכות קירור מותאמות אישית יש יתרון ישיר על הכדאיות והתפקוד של האי האנושי. המחקר הנוכחי נועד לבחון את יעילותה של מערכת מעבד תאים מקוררים שפותחה לאחרונה וזמינה ודורשת שינויים מינימליים ולהעריך את השפעתה על כדאיות התאים האנושיים וסביבת החדר הנקי GMP. מערכת הקירור, מחליף חום מקורר מכני המוגדר ב-30 מעלות צלזיוס, שימשה להעברת אוויר יבש מקורר בדרגה רפואית לקערת מעבד התאים דרך חור שנקדח במכסה הצנטריפוגה. עם הזמינות המוגבלת של תורמי לבלב בקטאר, אימות המערכת נעשה עם טיהור שיפוע צפיפות רציף של פרוות באפי מח עצם אנושי. סטריליות, מערבולות וספירת חלקיקים נמדדו בסביבות חדרים נקיים מסוג C ו-B. לא התפתחה מערבולת סביב מעבד התא המקורר, ולא נוצרו חלקיקים מוטסים עודפים של 0.5 מיקרומטר ו-5 מיקרומטר בהתאם לתקני GMP לחדר נקי. בתחילת ובסוף שלבי האיסוף, הטמפרטורה עלתה בהתאמה ל-21.50 מעלות צלזיוס ±-0.34 מעלות צלזיוס ו-21.93 מעלות צלזיוס ±-0.20 מעלות צלזיוס במעבד התא הלא-מקורר ול-10.9 מעלות צלזיוס בלבד ±-0.17 מעלות צלזיוס ו-11.16 מעלות צלזיוס ±-0.35 מעלות צלזיוס במעבד התא המקורר (p <0.05). מעבד התא המקורר הוביל הן לשיפור ההתאוששות (98%) של חלק התא החד-גרעיני והן ליכולת הקיום (100% ± 2%) לאחר העיבוד. מערכת הקירור החדשה מפחיתה ביעילות את החום המיוצר על ידי מעבד התא תוך היעדר השפעה חלקיקית על סביבת החדר הנקי GMP. מעבד התאים המקוררים המתואר כאן הוא שיטה זולה (16,000 דולר ללא מיסים, שחרור ממכס והובלה) וזעיר פולשנית לספק קירור חזק. נכון לעכשיו, טכנולוגיה זו במתקן הטיפול בתאי GMP מיושמת לבידוד והשתלת תאי איים אנושיים עבור התוכנית הקלינית.

מבוא

השתלת איים לסוכרת מסוג 1 חמורה יכולה להחזיר את הפרשת האינסולין האנדוגנית והפכה לסטנדרט הטיפול במספר מדינות1. בידוד איים הוא הליך רב-שלבי הכולל עיכול אנזימטי ומכני חם של הלבלב, ואחריו שלבים מקוררים לשחזור רקמה מעוכלת וטיהור איים עם שיפועי צפיפות רציפים או לא רציפים במעבד תאים. קירור מהיר מאט את שלב העיכול האנזימטי ומגן על האיים מפני אנזימי עיכול המשתחררים על ידי זיהום תאים אצינאריים. מעבד התאים תוכנן במקור להפריד רכיבי דם תאיים בטמפרטורת הסביבה2. הוא הוסב לטיהור איי הלבלב האנושיים של לנגרהנס ב-19893. במשך שלושה עשורים, איים אנושיים טוהרו לניסויים קליניים, ולאחרונה, לטיפול סטנדרטי, במעבד תאים עם שיפועים לא רציפים4 או שיפועי צפיפות רציפים1 שנוצרו עם gradient maker1 או שווה ערך המופעל על ידי מחשב mixer5,6,7. קבוצות אחרות דיווחו על טיהור איים מיונקים גדולים ובני אדם באמצעות בקבוקי פלסטיק גליליים גדולים8,7,9, מה ששיפר באופן משמעותי את יעילות הטיהור ואיכות האי.

ואכן, בהתחשב בתקן הזהב לטיהור איים אנושיים להשתלה קלינית10,11, מעבד התאים המיוצר היה ללא קירור. כתוצאה ישירה מהיעדר קירור, האיים נחשפו לטמפרטורות עולות במהלך שלב הטיהור. במהלך הצנטריפוגה מתרחשת עלייה בלתי מבוקרת בטמפרטורה עקב החיכוך המכני של הרוטור12,13. מעבדי התאים הותאמו למערכת קירור במרכזי בידוד איים שהגדילה סטטיסטית את הפרשת האינסולין המושרה על ידי גלוקוז ואת כדאיות התאים, מה שאישר את היתרון של שמירה על איי הלבלב בטמפרטורות נמוכות במהלך הליך הטיהור14,15.

יש לציין כי בסוף שנות ה-80 נבנו 10 אבות טיפוס מקוררים כדי להפחית את נזקי האי במהלך טיהור שיפוע הצפיפות, אך לא זכו לתשומת לב נוספת. אבות הטיפוס של מעבד התאים התבססו על קירור ציר וקערה עם פוליאתילן גליקול צונן. בפרט, פתרונות לטיהור איים, כולל פתרונות לשימור איברים ושיפועי צפיפות פוליסכרידים, עלולים להזיק לכדאיות האי כאשר משתמשים בהם בטמפרטורת החדר או מעל טמפרטורת החדר16,17,18. השוואה בין אסטרטגיות קירור שונות של מעבד התאים לטיהור תאי איים לעומת מעבד התאים המקורי שאינו מקורר הוערכה כדי להילחם בעלייה הבלתי מבוקרת של הטמפרטורה המתרחשת עקב חיכוך הרוטור. נעשו מספר ניסיונות לקרר את מעבד התאים במהלך טיהור האיים האנושיים. ניתן למקם את מעבד התא באופן זמני או קבוע בחדר קירור שתוכנן במיוחד כדי לשמור על טמפרטורה של 0-8 מעלות צלזיוס19 במהלך צנטריפוגת השיפוע המשמשת כיום במרכזי בידוד האיים באוניברסיטת אילינוי שיקגו19, אוניברסיטת מיאמי14, אוניברסיטת אוקספורד facilities15ואוניברסיטת סן פרנסיסקו (יחידת הקירור המותאמת אישית עוטפת את המעבד הסלולרי)., שינוי נוסף כולל קירור ליבה של ציר מעבד התא עם מערכת קירור המשתמשת בקירור חנקן נוזלי מבוקר אלקטרונית בז'נבה, שוודיה וצ'כיה15,19. חלופה נוספת באמצע שנת 2000 הייתה קירור הליבה של מעבד התא עם יחידת מיזוג אוויר12 או על ידי קירור נוזלי של הפיר באוניברסיטת ליל.

שינויי קירור של מעבד התא אינם זמינים ומגיעים עם סיכונים (לחות, הצטברות עיבוי) בתוך סביבות חדר נקי GMP, כולל אובדן אחריות וסירוב של הקונסטרוקטור לטפל במכונה. כתוצאה מכך, חלק ממרכזי האיים, כולל מילאנו, איטליה, אוסלו, נורבגיה ואדינבורו, סקוטלנד, אינם משתמשים במערכת קירור למעבדי תאים במהלך תהליך טיהור האיים15.

המחקר הנוכחי תוכנן לבחון את היעילות של מצנן זמין שפותח לאחרונה בשילוב עם מערכת מעבד תאים שהשתנתה באופן מינימלי. בקצרה, המצנן מבוסס האוויר המתואר כאן הוא מחליף חום בקירור מכני השולט בטמפרטורה של 1 רגל מעוקב סטנדרטי לדקה (SCFM) של גז יבש בין -40 מעלות צלזיוס ל-100 מעלות צלזיוס. מערכת קירור זו דורשת אספקת אוויר רפואי יבש. האוויר יזרום דרך הקו ומחליף החום והחוצה דרך הזרבובית (7.9 מ"מ). תנור חימום הממוקם בתוך הזרבובית מספק חום כדי לשלוט בטמפרטורת זרם האוויר. נרכש כיסוי צנטריפוגה מפלסטיק מוצק רזרבי, ובוצעו שינויים מינימליים. בכיסוי נקדח חור בקוטר 13.3 מ"מ, ואוויר מקורר הועבר מפיית הקירור למעבד התא דרך החור במכסה הצנטריפוגה. האוויר הרפואי המקורר הוזרק בתוך קערת הצנטריפוגה של מעבד התא עם שליטה מתמדת על טמפרטורת הנוזלים או שיפועי הצפיפות.

הערכנו את הביצועים הטכניים של מעבד התא המקורר ואת ההשפעה של גוף הקירור על סביבת החדר הנקי GMP. המוקד העיקרי היה להשיג טמפרטורה נמוכה מאוד (<10 מעלות צלזיוס) במהלך טיהור האיים האנושיים כדי לשמר את הכדאיות. באמצעות הפרדת צפיפות מעיל באפי כפרוקסי לבידוד איים, קבענו את היעילות של פרוטוקול קירור זה על כדאיות התא.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

פרוטוקול זה השתמש בדם שלם שנשלח להשמדה כיוון שלא היה מתאים לשימוש בהתאם להנחיות ההשמדה של המוסד. אישור IRB והסכמה מדעת אינם רלוונטיים.

1. הגדרת מעבד תאים מקורר

הערה: יש לבצע את כל ההליכים בסביבת חדר נקי, ועל הצוות להקפיד על נהלי הלבוש של החדר הנקי.

  1. רכישת ציוד
    1. רכשו מכסה פלסטיק (plexiglass) רזרבי. רכשו את מערכת ציוד הקירור, קירור עם בקר טמפרטורה של זרם גז בקירור מכני, מייבש אוויר, ווסת לחץ וספיקה, ואת האחריות (אופציונלי). ראו טבלת חומרים לעיון.
      הערה: העלות הכוללת היא $16,133 ללא דמי שילוח או מכס.
    2. הזמינו אוויר רפואי יבש, גז רפואי דחוס העומד בתקן (European pharmacopoeia reference 1238) מספק גזים רפואיים מקומי. רכשו 2 בלוני גז של 6.8 m3 (47 L: 23 cm x 153 cm; קוטר x אורך).
  2. התקנת הציוד (איור 1 ו-איור 2)
    1. הכניסו את הציוד לחדר נקי בתקן GMP (חטאו את הציוד לפני הכניסה לחדר הנקי בהתאם לנהלי GMP).
    2. עבור האוויר הדחוס בדרגה רפואית, התקינו קו גז במקום להציב את בלוני הגז ישירות בחדר הנקי.
  3. הסבת מעבד התאים לצורך קירור
    1. ראשית, הסירו את מכסה הפלסטיק. שמרו את מכסה הפלסטיק המקורי למקרה שתהיה בעיה עם האחריות. קדחו חור במכסה הרזרבי של מעבד התאים בקוטר התואם למספר הקוטר החיצוני של פיית התקן של התקן הקירור כדי למנוע סדקים במכסה הצנטריפוגה (מומלץ 13.3 mm).
    2. חברו תומכים יחד עם חתיכה עגולה של ספוג. הדבר נעשה כדי למנוע שבירה ו/או שריטות של המכסה, כדי להחזיק את פיית הקירור במקומה מעל מעבד התאים, כדי להגן על המכסה מפני כיפוף מוגזם עקב הלחץ הגבוה של האוויר המוזרק, כדי לתמוך במשקל הפיה, ולבסוף כדי להבטיח את הבטיחות המקסימלית למפעיל באמצעות גישה חופשית ובטוחה לכל פונקציות מעבד התאים הנדרשות במהלך הפרוצדורה הניסוית.
    3. חברו את מערכת הקירור למעבד התאים על ידי הצמדת פיית הקירור לחור בפלסטיק. הדקו אותה באמצעות תומכים וכריות ספוג.
    4. מקמו את מארז הקירור במרחק של עד 8 feet (2.44 m) מהפיה. מקמו את בקר הטמפרטורה בארון נפרד ובמרחק של עד 6 feet (1.83 m) ממארז הקירור.
    5. הגדירו את נקודת היעד של הקירור ל-40 °C- לקירור זרם האוויר במקרר. טמפרטורת האוויר ביציאה מוצגת ברציפות במחוון הדיגיטלי ברזולוציה של 0.1 °C. הגדירו את טמפרטורת היציאה באופן דיגיטלי ל-0.1 °C באמצעות בקר הטמפרטורה.
    6. שמרו על הלחץ ועל קצב הספיקה של אספקת האוויר במודול ווסת הלחץ והספיקה (איור 2) לפני ההזנה למקרר. הגדירו אותם ל-55 psi ולקצבי ספיקה של 4 SCFM, בהתאמה, כדי להגיע לתנאים אופטימליים בזרם אוויר מקורר ל-30 °C ± 2 °C-.
    7. וודאו שאספקת הגז הרפואי מווסתת בלחץ יציאה של 5 bar ויכולה להספיק ללפחות 90 min, שכן הדבר נדרש כדי שהאוויר הדחוס יגיע ל-30 °C-.
      ​הערה: אוויר רפואי יבש הוא גז רפואי דחוס, ואוויר יבש בלחץ מלא עומד בתקן.
    8. ספקו 5 bar מפיית קירור המחוברת למכסה מעבד התאים דרך חור שנקדח במכסה הצנטריפוגה. הזריקו את האוויר הרפואי המקורר לתוך כלי הצנטריפוגציה של מעבד התאים (איור 2). בחרו את מיקום הזרקת האוויר באופן שבו האוויר המקורר יופנה בניצב לשפת האלומיניום של רוטור הצנטריפוגה.
    9. בעת הכנת מעבד התאים, וודאו שהרוטור נמצא בטמפרטורת החדר (18 °C). הגדירו את התרמו-רגולטור האוטומטי של מערכת הקירור ל-30 °C- והפנו הזרקות אוויר קר לרוטור.
      הערה: נבחנו תנאי ניסוי שונים כדי להגיע למדרג טמפרטורה אופטימלי של +4 °C, הדרוש כדי להתגבר על ההתנגדות התרמית של מערכת מפריד התאים של מעבד התאים ועל חימום הרוטור במהלך הצנטריפוגציה. התרמו-רגולטור המתוכנת ישמור על טמפרטורת היעד האופטימלית בתוך מכונת עיבוד התאים במהלך הפרוצדורה, ובמיוחד במהלך הצנטריפוגציה, בטמפרטורת חדר נקי של +18 °C.
      1. הגדירו את מעבד התאים עם שלב קירור מקדים ראשון כדי לקרר את המעבד (ללא ערכת מעבד התאים) ל- +3 °C למשך 30 עד 45 min, ושלב קירור מקדים שני של הפעלת מעבד התאים עם הערכה שקוררה מראש ל- +4 °C ב-134 x g, למשך 5 min.

2. ספירת חלקיקים נישאים באוויר

  1. העריכו את תאימות מכשיר הקירור לסביבת החדר הנקי של GMP בהתאם לתקן ISO 14644-1 כדי להעריך את השפעת מכשירי החום במהלך שלב התפעול.
  2. השתמשו בניטור ספירת חלקיקים כדי לספק ראיות לכך שהושגה רמת הנקיות הנדרשת בנקודות בקרה קריטיות במצב מנוחה ובמהלך תפעול.
    1. מספר מיקומי הדגימה המינימלי תלוי בשטח הנמדד. חשבו זאת באמצעות המשוואה
      figure-protocol-1
      ​כאשר A הוא שטח החדר הנקי או החלל המבוקר באוויר נקי ב-m2, ו-NL הוא מספר מיקומי הדגימה מעוגל כלפי מעלה למספר שלם.
    2. נפח דגימת האוויר הוא הנפח המינימלי בכל מיקום. ודאו שנפח האוויר גדול מספיק כדי לספור 20 חלקיקים בגודל החלקיק הגדול ביותר שצוין. חשבו את נפח דגימת האוויר באמצעות המשוואה
      V= 20/C x 1000
      כאשר V הוא נפח הדגימה הבודד המינימלי למיקום, מבוטא ב-L, ו-C הוא גבול המחלקה (מספר חלקיקים/m3).
    3. עבור כל מיקום, בהתאם לשטח, השתמשו בדגימה אחת או יותר. ודאו שהנפח המינימלי שנדגם בכל מיקום הוא 2 L וזמן הדגימה המינימלי הוא לפחות 1 min.
  3. לפני הדגימה, נקו את מכשיר ספירת החלקיקים באמצעות מסנן ניקוי. הסירו את המסנן והניחו אותו עם הגשוש האיזוקינטי לדגימה.
  4. הניחו את מכשיר ספירת החלקיקים במיקום הדגימה שזוהה. התחילו את איסוף הדגימות מהמסך הראשי של מכשיר ספירת החלקיקים.
  5. בסיום הדגימה, העבירו את מכשיר ספירת החלקיקים למיקום הבא. כאשר כל מיקומי הדגימה הושלמו, סקרו את הנתונים והדפיסו דוח.
  6. כאשר ריכוז החלקיקים הממוצע לכל נקודות הדגימה באזור יורד מתחת לגבול המחלקה המצוין ב-טבלה 1, החשיבו את החדר כעומד בתקן עבור ריכוז החלקיקים המותר.

3. הכנת מדרג ועיבוד הפרדת תאים

  1. לפני הניסוי, קררו מראש את מדרגי הצפיפות הקלים והכבדים ואת ערכות מעבד התאים למשך לילה במקרר בטמפרטורה של +4 °C.
  2. קררו מראש את מעבד התאים למשך 45 דקות במצב המתנה (כלומר, הפעילו את מעבד התאים לפני השימוש). שמרו על טמפרטורה שבין +2 °C ל-+5 °C. הכניסו את ערכת מעבד התאים שקורה מראש ב-+4 °C.
  3. עבור יצירה סטנדרטית של מדרג בצורה של מעטפת כפולה המקוררת באתנול (אופציונלי; איור 3), חברו את שתי התאים הזכוכיתיים והניחו אותם על בוחש מגנטי. הדקו את הצינורות בין שני התאים. קררו את יצרן המדרג באמצעות צ'ילר קירור עם סירקולציית אתנול ב-0 °C.
  4. ראשית, הכינו להעמסה של השכבה הכבדה בתחתית השקית על ידי מילוי התא ב-130 mL של מדרג צפיפות כבד (HD; 1.087 g/mL). העמיסו במהירות משאבה של 150 mL/min.
  5. לאחר שהמדרג הכבד נמצא בשקית, הוסיפו 130 mL של צפיפות גבוהה (HD) לכלי השיקוף הקדמי ו-140 mL של מדרגי צפיפות נמוכה (LD; 1.063 g/mL) לאחורי (כאשר התסבך סגור).
  6. שחררו את התסבך/התפס בין שני התאים וצרו מדרג רציף במהירות משאבה של 50 mL/min.
  7. הכינו מראש תאי Buffy coat מונונוקליאריים אנושיים לניקוי ממספר Buffy coats אנונימיים מאוחדים שנאספו מתוצרי פספיי של דם מלא (40 mL עד 60 mL של דם מלא נוספו ל-10 שקיות Buffy coat), בהתאם לזמינות מבנק הדם.
    1. הפרדת MNC
      1. השתמשו בצנטריפוגציה של מדרג צפיפות לבידוד תאים מונונוקליאריים אנושיים בעלי צפיפות נמוכה. לשם כך, בצעו את השלבים המתוארים להלן.
      2. להכנת התאים, חשבו את נפח הדם (דם מלא עם נוגדי קרישה או Buffy coat תלוי). דללו את הדם עם תמיסת באפר בריכוז 2x-4x על ידי ערבוב בהפיכה. ככל שהדם דלול יותר, כך תהיה טובה יותר טהרת התאים המונונוקליאריים.
      3. הכינו באפר על ידי ערבוב באפר פוספט עם נוגד קרישה. חשבו את מספר המבחנות הדרושות על ידי חילוק נפח הדם ב-35 mL ושפכו 15 mL של תמיסת מדרג צפיפות 1.073 לכל מבחנה.
      4. שכבו בהדרגה 35 mL של תמיסת הדם המדוללת מעל מדרג הצפיפות על ידי הרצה עדינה על פני השטח של מדרג הצפיפות באמצעות מזרק 60 mL המחובר למחט; עבור נפחים קטנים, השתמשו בפיפטה. השתדלו לא להפריע לממשק, שכן הדבר יוביל לשכבה מונונוקליארית דלה.
      5. צנטריפוגו ב-400 x g למשך 20 דקות ב-20 °C ללא הפסקות (האצה 0, האטה 0). לאחר הצנטריפוגה, אספו בעדינות את שכבת הממשק של התאים המונונוקליאריים באמצעות פיפטת העברה סטרילית. העבירו את התאים למבחנה קונית חדשה של 50 mL.
      6. שטפו את התאים פעמיים עם באפר (PBS בתוספת נוגד קרישה). בשטיפה הראשונה, מלאו את המבחנה המכילה את התאים בבאפר עד לנפח של 50 mL. צנטריפוגו ב-300 x g למשך 10 דקות ב-20 °C כדי לשקע את התאים (האצה 9, האטה 0). הסירו בעדינות ובזהירות את כל העל-מינוס.
      7. בצעו שטיפה שנייה להסרת טסיות דם. השביו את השקיעה לנפח של 50 mL עם באפר. צנטריפוגו ב-200-300 x g למשך 10 דקות ב-20 °C (האצה 9, האטה 0).
      8. שחזרו את התאים לנפח סופי של 5 mL, תאים אלו צריכים להיות בעלי משקל סגולי הדמה MNC בעלי צפיפות נמוכה <1.073. מדדו את הצפיפות הסגולית של המדרג באמצעות דנסיומטר.
      9. השביו את השקיעה לנפח סופי של 100 mL עם 95 mL של מדיום מדרג צפיפות גבוה (1.083 g/mL) בשקית העברה. השתמשו במוצר זה לניקוי באמצעות מפריד תאים. הנפח הסופי של 100 mL מכיל תאים ומדיום מדרג צפיפות גבוה 1.083.
        הערה: ניתן לשמור את ה-Buffy coat במקרר למשך לילה ב-PBS המכיל 0.5% BSA או פלזמה אוטולוגית. ניתן גם לשטוף את ה-Buffy coat.
  8. העמיסו מלמעלה על המדרגים שהוכנו מראש מקסימום 30 mL של MNC שבודדו מה-Buffy coat ותלוים ב-100 mL של מדיום שימור רכז, באמצעות משאבה פריסטלטית ב-25 mL/min. שמרו את המדרג ב-+4 °C.
  9. מדדו באופן רציף את הטמפרטורה בתוך מעבד התאים באמצעות תרמו-פרוב מכולל. השתמשו בתרמוקופל דיגיטלי המחובר לתרמו-פרוב סטרילי כדי לנטר את טמפרטורת המדרגים והתאים במהלך התהליך.

4. אופטימיזציה של שלבים שונים בהטענה במדרג (gradient loading)

  1. הכנס את ערכת מעבד התאים שקוללה מראש ל-+4 °C. טען את הגרדיאנט הכבד (130 mL) ב-+4.5 °C. בסיום טעינת הגרדיאנט, הגדר את הצנטריפוגה למהירות נמוכה יחסית (537 x g) כדי למזער את החום הנוצר על ידי הרוטור.
  2. כבה את מעבד התאים כדי לאפשר למערכת ההידראולית לחזור לרמות שלפני ההרצה ולשחרר אוויר.
  3. הפעל מחדש את מעבד התאים ב-537 x g והוסף את הגרדיאנטים בצפיפות גבוהה (130 mL) ובצפיפות נמוכה (140 mL) כדי ליצור גרדיאנט צפיפות רציף ב-+4.3 °C ובקצב זרימה של 50 mL/min.
  4. טען את שכבת ה-buffy coat (30 mL) עם 100 mL של תווך אחסון קר ב-+6 °C ובקצב זרימה של 25 mL/min. הוסף 50 mL (25 mL x 2) של תמיסת שטיפה.
  5. לאחר 5 דקות ב-+5 °C, אסוף את הגרדיאנט שסובב לתוך 12 בקבוקים בקצב זרימה של 100 mL/min.
  6. מלא מבחנות בתווך שטיפה (M199 + 20% human albumin + 10% Penicillin streptomycin). מלא את מבחנה 1 ב-100 mL של תווך שטיפה וב-150 mL של תאים, ואת מבחנות 2-12 ב-225 mL של תווך שטיפה וב-25 mL של תאים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

ראשית, נמדדה באופן כמותי ההשפעה של מעבד התאים המקוממר על החדר הנקי בתנאי GMP. בשיטות סטנדרטיות נעשה שימוש במונה חלקיקים למדידת זיהום חלקיקים באוויר בסביבת חדר נקי בדרגת GMP class C ו-class B בנקודות קריטיות בסמיכות למעבד התאים ולמערכת קירור האוויר בלחץ. התוצאות הדגימו כי לא התפתחה טורבולנציה סביב הציוד. הנתונים שנרשמו הראו כי לא הייתה חריגה של חלקיקים נישאים באוויר בגודל 0.5 µm ו-5 µm, בהתאם לתקני חדר נקי GMP grade C, grade B ו-BSL III (איור 4).

כ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

מתקני בידוד איים ברחבי העולם אימצו במשך עשרות שנים טיהור איים אנושיים במעבד תאים ייעודי מחדש. למרות שחלק ממתקני הייצור של האיים ממשיכים לעבד איים במעבד תאים לא מקורר, רוב המרכזים משתמשים בגרסה מקוררת של מעבד התאים 10,11,15. מרכזים ממקמים את מעבד התאים בחדר קירור שיש לו את החיסרון העיקרי של חשיפה ללחות ועיבוי, או מבצעים שינויים גדולים מבחינה טכנית במעבד התא עצמו, כולל הציר, שיש לו השלכות מיידיות על אחריות המכונה ותחזוקה מונעת שלה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים שאין ניגוד עניינים.

תודות

המחברים מבקשים להודות למכון הגנומי האירופי לסוכרת (ANR-10- LABEX-0046 עד FP) ולמכון המטבולי של קטאר - תאגיד רפואי חמד, קטאר. המחברים מודים גם למרכז המחקר הרפואי בתאגיד הרפואי חמד על התמיכה בדמי עיבוד המאמרים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>ציוד
אוויר נגד חלקיקי אווירLasair III 
אייר ג'ט XR40 SP ScientificFTS system XR40
Biosafety CabinetThermo ScientificEQ-1301
Circulating Cooling ChillerJulaboCF30
COBE 2991 Terumo BCT
BiorepCCT-01
יצרנית שיפוע עם מעיל כפול מותאם אישית בבית
KJT-מדחום צמד תרמיחנה מכשיריםHI93551Nלמדידת טמפרטורת נוזלים
מערבל מגנטי Thermo Scientific88880014
משאבה פריסטלטית מדחום MasterFlexMK-77921-79
 Extech InstrumentsRMS 430לטמפרטורת COBE
חרוזים ללא מיםCole-Parmer10122-00
<חזק>חומרים וריאגנטים
BD ערכת ספירת תאי גזעBD Biosciences 
ערכת צינורות 344563 COBE 2911Terumo BCT90819
צינורות חרוטיים 250 מ"לקורנינג430776
צפיפות שיפוע 1.1ביוכרום L6155
בקבוקים חד פעמיים מדורגיםתרמו פישר382019-1000
אלבומין אנושי 20% קדריון ביופארמה 8091600
M199 תמיסת כביסה קורנינג 99-784-ס"מ 
צינורות מאסטרפלקסMasterflex96400-6
רפואי יבש אווירלינדה בריאותMedi On 22
Pencillin-streptomycin גיבקו 
ThermoprobeBiorepTC-02חיישן תרמי
טריפן כחול סיגמא אולדריץ'15250061
אוניברסיטת ויסקונסין בלזר (UW) גשר החיים RM/N 4055מדיום שימור
מגש קירור חרוטי אמבט 15140122

מקורות

  1. Shapiro, A. M., et al. Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen. The New England Journal of Medicine. 343 (4), 230-238 (2000).
  2. Vesilind, G. W., Simpson, M. B., Colman, R. E., Kao, K. J. Evaluation of a centrifugal blood cell processor for washing platelet concentrates. Transfusion. 28 (1), 46-51 (1988).
  3. Lake, S. P., et al. Large-scale purification of human islets utilizing discontinuous albumin gradient on IBM 2991 cell separator. Diabetes. 38, 143-145 (1989).
  4. Ricordi, C., et al. Human islet isolation and allotransplantation in 22 consecutive cases. Transplantation. 53 (2), 407-414 (1992).
  5. Friberg, A. S., Stahle, M., Brandhorst, H., Korsgren, O., Brandhorst, D. Human islet separation utilizing a closed automated purification system. Cell transplantation. 17 (12), 1305-1313 (2008).
  6. Bampton, T. J., et al. Australian experience with total pancreatectomy with islet autotransplantation to treat chronic pancreatitis. ANZ Journal of Surgery. 91 (12), 2663-2668 (2021).
  7. Doppenberg, J. B., Engelse, M., de Koning, E. J. P. PRISM: A Novel Human Islet Isolation Technique. Transplantation. 106 (6), 1271-1278 (2021).
  8. Shimoda, M., et al. Islet purification method using large bottles effectively achieves high islet yield from pig pancreas. Cell Transplantation. 21 (2-3), 501-508 (2012).
  9. Noguchi, H. Pancreatic Islet Purification from Large Mammals and Humans Using a COBE 2991 Cell Processor versus Large Plastic Bottles. Journal of Clinical Medicine. 10 (1), 10(2021).
  10. Shapiro, A. M., et al. International trial of the Edmonton protocol for islet transplantation. The New England Journal of Medicine. 355 (13), 1318-1330 (2006).
  11. Ricordi, C. National Institutes of Health-Sponsored Clinical Islet Transplantation Consortium Phase 3 Trial: Manufacture of a Complex Cellular Product at Eight Processing Facilities. Diabetes. 65 (11), 3418-3428 (2016).
  12. Swift, S., Kin, T., Mirbolooki, M., Wilson, R., Lakey, J. R. T. Comparison of cooling systems during islet purification. Cell Transplantation. 15 (2), 175-180 (2006).
  13. Rilo, H. L. R., et al. Comparison of islet number and viability obtained during purification on Euro-Collins-Ficoll gradients processed on a refrigerated or nonrefrigerated COBE 2991 cell separator. Transplantation Proceedings. 26 (6), 3430(1994).
  14. Chadwick, D. R., et al. Pancreatic islet purification using bovine serum albumin: The importance of density gradient temperature and osmolality. Cell Transplantation. 2 (4), 355(1993).
  15. Nano, R., et al. Heterogeneity of human pancreatic islet isolation around Europe: results of a survey study. Transplantation. 104 (1), 190-196 (2020).
  16. Chadwick, D. R., et al. Storage of pancreatic digest before islet purification. Transplantation. 58 (1), 99-104 (1994).
  17. Amrani, M., et al. Detrimental effects of temperature on the efficacy of the University of Wisconsin solution when used for cardioplegia at moderate hypothermia. Comparison with the St. Thomas Hospital solution at 4 degrees C and 20 degrees C. Circulation. 86, 280-288 (1992).
  18. Fremes, S. E., Li, R. K., Weisel, R. D., Mickle, D. A., Tumiati, L. C. Prolonged hypothermic cardiac storage with University of Wisconsin solution. An assessment with human cell cultures. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 102 (5), 666-672 (1991).
  19. Adewola, A., et al. Comparing cooling systems for the COBE 2991 cell separator used in the purification of human pancreatic islets of Langerhans. Cryo Letters. 31 (4), 310-317 (2010).
  20. Keymeulen, B., et al. Implantation of standardized beta-cell grafts in a liver segment of IDDM patients: graft and recipients characteristics in two cases of insulin-independence under maintenance immunosuppression for prior kidney graft. Diabetologia. 41 (4), 452-459 (1998).
  21. de Kort, H., de Koning, E. J., Rabelink, T. J., Bruijn, J. A., Bajema, I. M. Islet transplantation in type 1 diabetes. BMJ. 342, (2011).
  22. Barbaro, B., et al. Improved human pancreatic islet purification with the refined UIC-UB density gradient. Transplantation. 84 (9), 1200-1203 (2007).
  23. Lemarie, C., et al. A new single-platform method for the enumeration of CD34+ cells. Cytotherapy. 11 (6), 804-806 (2009).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

מעבד תאים מקוררטיהור במדרג צפיפותחיוניות איים בלבלב אנושייםציוד לטיפול תאיתקני GMP לחדרים נקייםפראקציית תאים מונונוקלארייםשלב סבב (צנטריפוגציה)הערכת חלקיקים נישאים באווירמדידת חיוניות תאים
הערכת ההשפעה של מערכת מעבד תאי קירור חדשה על מתקן בידוד תאי האי
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.