כאן מתוארת גישה פשוטה ומהירה לביצוע הזרקות תוך-מוחיות בעכברים בגישה של יד חופשית (כלומר, ללא מכשיר סטריאוטקסי).
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
סיכום
תקציר
חקירת מערכות נוירואנדוקריניות דורשת לעתים קרובות העברה של תרופות, וירוסים או חומרים ניסיוניים אחרים ישירות למוחם של עכברים. הזרקה תוך-מוחית (ICV) מאפשרת העברה נרחבת של חומר הניסוי ברחבי המוח (במיוחד במבנים הסמוכים לחדרים). כאן מתוארות שיטות לביצוע זריקות ICV ביד חופשית בעכברים בוגרים. על ידי שימוש בציוני דרך חזותיים ומישושיים על ראשי עכברים, זריקות לחדרים הרוחביים יכולות להתבצע במהירות ובאמינות. ההזרקות נעשות באמצעות מזרק זכוכית המוחזק בידו של הנסיין ומונח במרחקים משוערים מציוני הדרך. לפיכך, טכניקה זו אינה דורשת מסגרת סטריאוטקסית. יתר על כן, טכניקה זו דורשת רק הרדמה איזופלורנית קצרה, המאפשרת הערכה עוקבת של התנהגות עכבר ו / או פיזיולוגיה בעכברים ערים המתנהגים בחופשיות. הזרקת ICV ביד חופשית היא כלי רב עוצמה להעברה יעילה של חומרים ניסיוניים למוחם של עכברים חיים, וניתן לשלב אותה עם טכניקות אחרות כגון דגימת דם תכופה, מניפולציה של מעגלים עצביים או הקלטה in vivo כדי לחקור תהליכים נוירואנדוקריניים.
מבוא
אספקת חומרים ניסיוניים, כגון תרופות1, וירוסים2 או תאים3, למוח נחוצה לעתים קרובות למחקר נוירואנדוקריני. אם הסוכן אינו חוצה בקלות את מחסום הדם-מוח או שמטרת הניסוי היא לבדוק באופן ספציפי את ההשפעות המרכזיות של הסוכן, חשוב שתהיה שיטה אמינה להעברת זריקות למוח. יתר על כן, הזרקה לחלל התוך-מוחי (ICV) מספקת הזדמנות להפיץ את החומר באופן נרחב במוח ומספקת אזור מטרה גדול, ובכך מגדילה את הסיכוי להזרקה מוצלחת2.
שיטה נפוצה לביצוע זריקות ICV כוללת מיקום של צינורית מגורים קבועה. בגישה זו, יש צורך במסגרת סטריאוטקסית כדי למקם את הצינורית הזמינה מסחרית או בהתאמה אישית, שכן הצינורית מודבקת או מלטת במקומה. לעתים קרובות, עם ההתאוששות, מינון supraphysiological של אנגיוטנסין II מנוהל דרך הצינורית, ואם התנהגות השתייה נצפתה מיד, אז הצינורית נחשבת ממוקמת כראוי4. לגישה זו יתרונות רבים, ביניהם היכולת לבצע עירוי ארוך טווח והיכולת להזריק לאותו בעל חיים מספר פעמים; בנוסף, אם אנגיוטנסין II מועסק, מיקום נכון ניתן לאשר לפני הממשל של תרכובות ניסיוניות. עם זאת, ישנן כמה מגבלות להצבת צינורית קבועה, כולל הדרישה לציוד יקר (מסגרת סטריאוטקסית), האפשרות לנזק לצינורית לאחר הנחתה (למשל, עכברים יכולים ללעוס צינורית של חבר לכלוב), והאפשרות של זיהומים סביב הצינורית הקבועה. זריקות ICV בודדות יכולות להתבצע באמצעות מסגרת סטריאוטקסית3, אשר, למרות יעילותה, דורשת חשיפה משמעותית להרדמה, ולכן עשויה לטשטש כמה השפעות פיזיולוגיות והתנהגותיות חריפות של הטיפול. בנוסף, מיקום עכברים במסגרת סטריאוטקסית דורש אימון משמעותי להשגת מיקום יציב ומניעת קריעה של תעלות האוזן.
כאן מתוארת שיטה מבוססת לביצוע זריקות ביד חופשית בעכברים. שיטה זו מבוססת על דוחות קודמים 5,6. היתרונות של טכניקה זו הם שהיא פשוטה, מהירה, ואינה דורשת ציוד מיוחד כגון מסגרת סטריאוטקסית. כפי שיתואר להלן, הליך זה כרוך מניפולציה מזרק זכוכית ביחס ציוני דרך על ראש העכבר כדי לבצע את הזריקות, אשר ניתן לעשות במהירות, ולכן, דורש רק כמה דקות של הרדמה גז ביום הניסוי.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל ההליכים אושרו על ידי אוניברסיטת מדינת קולורדו (#3960) ואוניברסיטת קליפורניה סן דייגו מוסדיים טיפול ושימוש בבעלי חיים, שם נאספו הנתונים המייצגים (S13235, PI Kellie Breen Church). נתונים מחמש נקבות בוגרות ושני עכברים זכרים בוגרים C57/BL6 (בני 9-16 שבועות) מתוארים בסעיף הנתונים המייצגים. נקבות עכברות עברו כריתת שחלות 3-4 שבועות לפני הזרקת ICV ואיסוף דם כמתואר לעיל7. לפני הניסויים, עכברים אלה שוכנו עם מחזור אור כהה של 12 שעות / 12 שעות והייתה להם גישה חופשית להאכלה ומים בהתאם למדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה.
1. ביצוע craniotomy
הערה: קרניוטומיה יכולה להתבצע יום אחד או יותר לפני ההזרקה בפועל, מה שהופך את תהליך ההזרקה למהיר יותר ביום הניסוי.
- הכינו את החומרים לקרניוטומיה כמתואר להלן.
- הניחו משטח ספסל נקי או חומר וילונות על משטח העבודה. הדביקו את חרוט האף של מאדה איזופלורן למשטח העבודה (קרוב לנסיין, אך פונה אליו; ראו איור 1A).
- מניחים צינור סילסטי על קצה מחט סטרילית חדה 18 גרם כך ~ 1 מ"מ של קצה המחט בולט. מניחים צינור סילסטי על קצה מחט קהה סטרילית כך ~ 1 מ"מ של קצה המחט בולט.
הערה: יש להשתמש במחטים ארוזות מראש נפרדות וסטריליות (חדות וקהות) עבור כל עכבר. - אספו מכונת גילוח חשמלית, פילינג יוד, גזה סטרילית ופדים אלכוהוליים להכנת אתר ההזרקה.
- תרגול הזזת מחט 2 מ"מ לרוחב ו 1 מ"מ קאודלי כמתואר להלן.
- השתמשו בסרגל ובעט כדי לסמן דף נייר עם נקודת התחלה (זו תהיה ברגמה), סימן 2 מ"מ משמאל או מימין, וסימן נוסף 1 מ"מ מעל האחרון (זה יהיה אתר ההזרקה; ראו איור 1B).
- תרגלו הזזת המחט מנקודת ההתחלה לנקודה 1 לסימון נקודה 2 (ברגמה לאתר ההזרקה) עד שתהיו בטוחים שניתן לחזור על התנועה ללא קווי עזר.
הערה: הקואורדינטות המתוארות כאן יעילות בעכברי C57/BL6 בוגרים, אך זנים אחרים או קבוצות גיל אחרות עשויים לדרוש הסתגלות.
- הכן את העכבר עבור craniotomy כמתואר להלן.
- הכניסו את העכבר לתא אינדוקציה והרדימו את העכבר עם איזופלורן 3%-4% בחמצן ברמה רפואית. עם תרגול והיכרות עם ההליך, להפחית את משך החשיפה הכולל isoflurane פחות מ 10 דקות עבור הליך craniotomy.
אזהרה: חשיפה לאיזופלורן מסוכנת לבריאות האדם; יש להשתמש במכשיר אידוי איזופלורן מאושר ונבדק באזור מאוורר היטב עם אמצעים לסילוק גזי פסולת. - ברגע שרפלקס הבוהן נעדר, יש לגלח את ראש החיה. יש למרוח חומר סיכה לעיניים.
- הניחו את העכבר על משטח העבודה כשהראש בתוך חרוט האף כדי לשמור על הרדמה.
- לנהל סוכן משכך כאבים, כגון buprenorphine (0.6-0.8 מ"ג / ק"ג משקל גוף עכבר, תת עורית), על פי הוראות הספק.
- נקו את מקום ההזרקה על ידי ניגוב הראש בגזה סטרילית טבולה בתמיסת יוד (בצעו שלושה קרצוף), ולאחר מכן נגבו עם כרית קרצוף אלכוהול (בצעו שלוש פעמים).
הערה: יש להסיר את הפרווה ולנקות את העור סביב אתר ההזרקה ולהשתמש במכשירים ומחטים סטריליים, בהתאם להמלצת האגודה האמריקאית לרפואה וטרינרית למניעת זיהומים.
- הכניסו את העכבר לתא אינדוקציה והרדימו את העכבר עם איזופלורן 3%-4% בחמצן ברמה רפואית. עם תרגול והיכרות עם ההליך, להפחית את משך החשיפה הכולל isoflurane פחות מ 10 דקות עבור הליך craniotomy.
- החזק בחוזקה את ראש העכבר ביד הלא דומיננטית. מקמו את הראש שטוח ככל האפשר על משטח העבודה.
- אתר את מקום ההזרקה.
- השתמש מחט חדה מוכן 18 G כדי לזהות תחילה bregma; לשם כך, גרור את המחט על פני העור של הראש לאורך קו האמצע, נע במישור rostral-caudal. דמיינו משולש שווה צלעות שבו שני הקודקודים הם העיניים והקודקוד השלישי הוא המיקום המשוער של ברגמה (ראו איור 1C).
- מ bregma, להעביר את המחט 2 מ"מ לרוחב ו 1 מ"מ caudal לאתר ההזרקה.
- תוך כדי החזקת המחט אנכית, דוחפים בחוזקה את המחט דרך העור והעצם עד שהצינור סומק עם העור.
- משכו את המחט, סובבו את המחט ולחצו שוב דרך העור והעצם. חזור על התהליך עד שנוצר חור קטן בעצם.
- השתמש במחט הקהה כדי לבדוק שנוצר חור מספיק בעצם. המטרה היא ליצור פתח בעצם גדול מספיק כדי שהמחט הקהה תעבור דרכו.
- הסר את העכבר מחרוט האף, נקה כל דם מאתר ההזרקה עם גזה סטרילית, והנח את העכבר בכלוב על כלוב חם יותר עד ער. מכיוון שהפתח שנעשה על ידי הקרניוטומיה הוא קטן (מחט 18 גרם), אין צורך לסגור את האתר בתפר או קליפסים לפצע.
הערה: הפתח המיוצר כאן הוא קטן (18 גרם), ולכן מוסדות רבים רואים הליך זה זריקה בניגוד לניתוח. יתר על כן, למרות שנוצר פתח דרך העור והעצם למוח, החזקת העור מתוח גורמת לכך שהחורים אינם מיושרים, מה שככל הנראה מסייע במניעת מגע של המוח עם פלורת העור או מצעי הכלוב.
2. ביצוע הזריקה
- הכינו את החומרים להזרקה כמתואר להלן.
- הניחו משטח ספסל נקי או חומר וילונות על משטח העבודה. הדביקו את חרוט האף של מאדה איזופלורן למשטח העבודה (קרוב לנסיין, אך פונה אליו; ראו איור 1A).
- חבר מחט 27 G באורך 10 מ"מ עם שיפוע 45° למזרק זכוכית 5 μL. מניחים צינור סילסטי על המחט כך 3.5 מ"מ של קצה המחט בולט; השתמשו בסרט מעבדה כדי להצמיד את הצינורית לגוף המזרק (ראו איור 1D).
- הכינו את אמצעי ההזרקה (תרופה, וירוס או נוזל אחר להזרקה) בצינור. לקבלת התוצאות המייצגות במחקר זה, הוזרק מי מלח איזוטוניים סטריליים.
הערה: בחר צינור המאפשר גישה באמצעות מזרק הזכוכית ומחט, כגון צינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 2 מ"ל. - ציירו 3 מיקרוליטר של אמצעי הזרקה לתוך מזרק הזכוכית. ראשית, לצייר יותר מהנפח הרצוי, ולהוציא עד 3 μL נשאר מזרק.
- אספו פילינג יוד, גזה סטרילית ורפידות אלכוהול להכנת אתר ההזרקה.
- הפעל טיימר מעבדה במצב ספירה לאחור ומקם את הטיימר כך שיהיה גלוי לנסיין בעת ביצוע הזרקות.
- תרגול הזזת מחט 2 מ"מ לרוחב ו 1 מ"מ קאודלי כפי שבוצע ביום הקודם.
- הכן את העכבר להזרקה כמתואר להלן.
- מניחים את העכבר בתא האינדוקציה ומרדים את העכבר עם איזופלורן. ברגע שרפלקס הבוהן נעדר, מרחו חומר סיכה לעיניים, והניחו את העכבר על משטח העבודה כשהראש בקונוס האף.
- נקו את מקום ההזרקה עם שלושה מגבונים של יוד ואלכוהול כל אחד. זהה את אתר ההזרקה באמצעות מחט 18 גרם (או מחט קהה) כמתואר בשלב 1.8. החור שנוצר במהלך craniotomy צריך להיות לזיהוי.
הערה: אם הקרניוטומיה לא בוצעה מראש, או אם החור בגולגולת אינו ניתן לזיהוי, ניתן לבצע את הקרניוטומיה כאן.
- בצע את ההזרקה עם מזרק זכוכית כמתואר להלן.
- החזק בחוזקה את ראש העכבר ביד הלא דומיננטית. מקמו את הראש שטוח ככל האפשר על משטח העבודה.
- מניחים את המחט של מזרק הזכוכית דרך החור בגולגולת עד שהצינור המונח מעל המחט שהוכן בשלב 2.1.2 מונח על עור העכבר.
- החזק את המזרק אנכית ככל האפשר, תוך שימת לב הן למישור העטרה והן למישור הסגיטלי. הזריקו באיטיות את המדיה במשך דקה.
- החזיקו את המזרק והמחט במקומם למשך דקה נוספת לאחר סיום ההזרקה כדי למזער את הזרימה חזרה. לאט לאט למשוך את המחט מראשו של העכבר.
- הסר את העכבר מחרוט האף, נקה כל דם מאתר ההזרקה עם גזה סטרילית (אם יש קיים), והנח את העכבר בכלוב על כלוב חם יותר עד ער.
3. אישור מיקום ההזרקה
- מרדימים עמוק ומחוררים את העכבר במי מלח ו-4% פרפורמלדהיד במי מלח חוצצי פוספט (PBS) כפי שתואר קודם לכן8. אחסנו את המוח ב-30% סוכרוז ב-PBS בטמפרטורה של 4°C עד שהמוח שוקע (בדרך כלל יומיים).
- חתכו 20-50 מיקרומטר קטעי קורונל על קריוסטט כפי שתואר קודם9. בזמן החיתוך, התבוננו בדרכי ההזרקה בבלוק הרקמות. רשום אם מערכת ההזרקה חותכת בבירור את החדר הצידי.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
כאשר מבוצעת בהצלחה, טכניקה זו מאפשרת משלוח מהיר של סוכן ניסיוני לתוך מערכת החדרים. פרופיל דופק של הורמון מחלמן (LH) מעכבר שעבר כריתת שחלות שקיבל זריקת ICV של 3 μL של מי מלח איזוטוניים סטריליים, הכלי לתרכובות פרמקולוגיות רבות, מוצג באיור 2A. דוגמה זו מדגימה כי חשיפה קצרה להרדמת גזים והזרקת 3 מיקרוליטר נוזל למערכת החדרים בלבד לא שינו את הפרשת LH הפועמת. בשעה 3 שעות לאחר הזרקת ICV, החיה הומתה ורקמה עצבית טרייה קפואה נאספה ונחתכה בהקפאה; דרכי ההזרקה הצטלבו בבירור עם החדר הצידי. דרכי ההזרקה נראו ...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
כאן מתואר אמצעי פשוט ויעיל לביצוע זריקות ICV בעכברים. מכיוון שטכניקה זו אינה דורשת מסגרת סטריאוטקסית, גישה זו להעברה מרכזית של תרופות וסוכני ניסוי נגישה לחוקרים נוספים. בנוסף, גישה זו היא תפוקה גבוהה יחסית שכן הליך ההכנה וההזרקה יכול להתבצע במהירות.
מכיוון שהליך זה דורש מניפולציה של מחטים ומזרק זכוכית ביד תוך שימוש במרחקים משוערים, מומלץ שהמתרגל החדש יקדיש זמן מה לתרגול התנועות לפני עבודה עם בעלי חיים חיים. בנוסף, גופות עכבר יכול להיות שימושי לתרגול זיהוי ברגמה עם המחט. ברגע שקצת ביטחון בתנועה...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין מה לחשוף.
תודות
ברצוננו להודות לד"ר קלי ברין צ'רץ', למר מייקל קרייסמן ולגב' ג'סיקה ג'אנג על תרומתם לאיסוף הנתונים המוצגים בתוצאות המייצגות. עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) R00 HD104994 (R.B.M).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| מחטים קהות 18 מד | SAI עירוי | B18-150 | |
| מחטים 18 מד | BD | 305195 | |
| רפידות אלכוהול | פישר סיינטיפיק | 22-363-750 | |
| כרית ספסל | פישר סיינטיפיק | 14-206-62AC22 | |
| תמיסת בטדין | פישר סיינטיפיק | NC1696484 | |
| בופרנורפין | Patterson Vet Supply | 07-892-5235 | חומר מבוקר |
| Eyelube | Fisher Scientific | 50-218-8442 | |
| מזרק זכוכית | המילטון | 7634-01 | |
| מחט הזרקה | המילטון | 7803-01 | 27 מד, מחט RN רכזת קטנה, סגנון נקודה: 4, אורך מחט: 10 ס"מ, זווית: 45 |
| Isoflurane | Patterson Vet Supply | 07-893-8441 | |
| Isoflurane | Vaporizer Vet Equip | V-10 | |
| קלטת מעבדה | VWR | 89098-128 | |
| חמצן בדרגה | רפואית Airgas | OX USPEA | |
| Paraformaldehyde | Millipore-Sigma | 8.18715.1000 | |
| פוספט חוצץ | מלח פישר מדעי | J67802. K2 | |
| PulsaR Software | קוד פתוח, אוניברסיטת אוטגו | ראה אסמכתא 9 | |
| Ruler | Fisher Scientific | 12-00-152 | |
| צינורות סילסטיים (0.040 אינץ' ID) | DOW | 508-005 | |
| צינורות סילסטיים (0.078 אינץ' ID) | DOW | 508-009 | |
| תמיסת מלח סטרילית | VWR | 101320-574 | |
| סוכרוז | פישר סיינטיפיק | S5-500 |
מקורות
- Roseweir, A. K., et al. Discovery of potent kisspeptin antagonists delineate physiological mechanisms of gonadotropin regulation. Journal of Neuroscience. 29 (12), 3920-3929 (2009).
- Kim, J. Y., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. Intracerebroventricular viral injection of the neonatal mouse brain for persistent and widespread neuronal transduction. Journal of Visualized Experiments. (91), e51863(2014).
- Taylor, Z. V., Khand, B., Porgador, A., Monsonego, A., Eremenko, E. An optimized intracerebroventricular injection of CD4(+) T cells into mice. STAR Protocols. 2 (3), 100725(2021).
- Russo, K. A., et al. Circadian control of the female reproductive axis through gated responsiveness of the RFRP-3 system to VIP signaling. Endocrinology. 156 (7), 2608-2618 (2015).
- Laursen, S. E., Belknap, J. K. Intracerebroventricular injections in mice. Some methodological refinements. Journal of Pharmacological Methods. 16 (4), 355-357 (1986).
- Haley, T. J., McCormick, W. G. Pharmacological effects produced by intracerebral injection of drugs in the conscious mouse. British Journal of Pharmacology and Chemotherapy. 12 (1), 12-15 (1957).
- McCosh, R. B., et al. Insulin-induced hypoglycaemia suppresses pulsatile luteinising hormone secretion and arcuate Kiss1 cell activation in female mice. Journal of Neuroendocrinology. 31 (12), e12813(2019).
- Wu, J., et al. Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation. Bio-Protocol. 11 (5), e3988(2021).
- Comba, A., et al. Laser capture microdissection of glioma subregions for spatial and molecular characterization of intratumoral heterogeneity, oncostreams, and invasion. Journal of Visual Experiments. (158), e60939(2020).
- Porteous, R., et al. Reformulation of PULSAR for analysis of pulsatile LH secretion and a revised model of estrogen-negative feedback in mice. Endocrinology. 162 (11), (2021).
- Hohmann, J. G., et al. Differential role of melanocortins in mediating leptin's central effects on feeding and reproduction. American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative, and Comparative Physiology. 278 (1), R50-R59 (2000).
- Gottsch, M. L., et al. A role for kisspeptins in the regulation of gonadotropin secretion in the mouse. Endocrinology. 145 (9), 4073-4077 (2004).
- Krasnow, S. M., et al. A role for galanin-like peptide in the integration of feeding, body weight regulation, and reproduction in the mouse. Endocrinology. 144 (3), 813-822 (2003).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
