בידוד גרעינים מתאי אב לבביים של עכברים עבור אפיגנום ופרופיל ביטוי גנים ברזולוציה של תא בודד

בקרב מומים מולדים, מומי לב מולדים (CHDs) הם הנפוצים ביותר, המתרחשים בכ -1% מלידות החי בכל שנה ^1,2. מוטציות גנטיות מזוהות רק במיעוט מהמקרים, מה שמרמז על כך שגורמים אחרים, כגון חריגות בבקרת גנים, מעורבים באטיולוגיה של CHD ^2,3. התפתחות הלב היא תהליך מורכב של סוגי תאים מגוונים ומקיימים אינטראקציה, מה שהופך את זיהוי מוטציות סיבתיות לא מקודדות והשפעותיהן על בקרת גנים למאתגר. אורגנוגנזה של הלב מתחילה באבות תאיים שיוצרים תת-סוגים שונים של תאי לב, כולל תאי מיוקרדיאל, פיברובלסט, אפיקרדיאלי ואנדוקרדיאלי ^4,5. גנומיקה של תא בודד מתגלה כשיטת מפתח לחקר התפתחות הלב ולהערכת ההשפעה של הטרוגניות תאית על בריאות ומחלות⁶. פיתוח שיטות מולטי-אומיות למדידה סימולטנית של פרמטרים שונים והרחבת צינורות חישוביים הקל על גילוי סוגי תאים ותת-סוגים בלב תקין וחולה⁶. מאמר זה מתאר פרוטוקול בידוד אמין של גרעין יחיד עבור תאי אב לבביים קפואים המתקבלים מעוברי עכברים, התואם ל- snRNA-seq ו- snATAC-seq במורד הזרם (כמו גם snRNA-seq ו- snATAC-seq בשילוב)^7,8,9.

ATAC-seq היא שיטה חזקה המאפשרת זיהוי של אזורי כרומטין פתוחים רגולטוריים ומיקום של נוקלאוזומים^10,11. מידע זה משמש להסקת מסקנות לגבי המיקום, הזהות והפעילות של גורמי שעתוק. ניתן לנתח את הפעילות של גורמי הכרומטין, כולל משפצים, כמו גם את פעילות השעתוק של RNA פולימראז, מכיוון שהשיטה רגישה מאוד למדידת שינויים כמותיים במבנה הכרומטין ^1,2. לפיכך, ATAC-seq מספק גישה חזקה ונטולת פניות לחשיפת המנגנונים השולטים בוויסות שעתוק בסוג תא מסוים. פרוטוקולי ATAC-seq אומתו גם למדידת נגישות הכרומטין בתאים בודדים, וחשפו שונות בארכיטקטורת הכרומטין בתוך אוכלוסיות תאים^10,12,13.

למרות שבשנים האחרונות חלה התקדמות ניכרת בתחום התאים הבודדים, הקושי העיקרי הוא עיבוד הדגימות הטריות הדרושות לביצוע ניסויים אלה¹⁴. כדי לעקוף קושי זה, בדיקות שונות בוצעו במטרה לבצע ניתוחים כגון snRNA-seq ו snATAC-seq עם רקמת לב קפואה או תאים^15,16.

מספר פלטפורמות שימשו לניתוח נתוני גנומיקה של תא בודד¹⁷. הפלטפורמות הנפוצות לביטוי גנים של תא בודד ופרופיל ATAC הן פלטפורמות לאנקפסולציה של טיפות מיקרופלואידיות מרובות¹⁷. מכיוון שפלטפורמות אלה משתמשות בתאים מיקרופלואידים, פסולת או אגרגטים יכולים לסתום את המערכת, וכתוצאה מכך נתונים שאינם שמישים. לפיכך, הצלחתם של מחקרים חד-תאיים תלויה בבידוד מדויק של תאים/גרעינים בודדים.

הפרוטוקול המוצג כאן משתמש בגישה דומה למחקרים אחרונים המשתמשים ב- snRNA-seq ו- snATAC-seq כדי להבין מומי לב מולדים 18,19,20,21,22,23. הליך זה משתמש בדיסוציאציה אנזימטית של רקמת לב טרייה שנותחה במיקרודיסקציה ואחריה שימור בהקפאה של תאי אב לבביים של עכברים. לאחר ההפשרה, התאים בני קיימא מטוהרים ומעובדים לבידוד גרעיני. בעבודה זו, פרוטוקול זה שימש בהצלחה להשגת נתוני snRNA-seq ו- snATAC-seq מאותה הכנה גרעינית של תאי אב לבביים של עכברים.

נוהל בעלי החיים שאומץ במחקר זה אושר על ידי ועדות האתיקה של בעלי החיים באוניברסיטת אקס-מרסיי (C2EA-14) ובוצע על פי פרוטוקולים שאושרו על ידי הוועדה האתית הלאומית שמונתה לניסויים בבעלי חיים (Ministère de l'Education Nationale, de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche; אישור Apafis N°33927-20211111715507212).

1. הגדרת ההזדווגות המתוזמנת לפני הנתיחה

1. כדי ליצור עוברי עכברים, בצעו הזדווגות מתוזמנת בין עכברים בוגרים 9.5 ימים לפני בידוד אזור הלב. בהליך זה נעשה שימוש בעכברי בר מסוג C57BL/6J בגילאי 2-6 חודשים, והזדווגות מתוזמנת בוצעה במהלך הלילה.
2. למחרת בבוקר, בדוק אם לנקבות העכברים יש פקק בנרתיק. שקול את היום שבו התקע מזוהה כיום עוברי (E) 0.5.

2. הכנת רקמות ובידוד תאים

1. הרדימו נקבה C57BL/6J בת 2-6 חודשים בהריון ביום 9.5 לאחר ההתעברות באמצעות _CO2 עם ריכוז מוגבר ואחריו פריקת צוואר הרחם. נקה את החלק התחתון של הבטן עם 70% אתנול.
   הערה: השימוש בחומרי הרדמה לפני פריקת צוואר הרחם אינו מומלץ מכיוון שהדבר יחשוף את העוברים לשינויים סביבתיים שעלולים להשפיע על מחקרים שעתוק ואפיגנומיים עוקבים.
2. פתח את הבטן ואת הצפק עם מספריים. דמיינו את קרני הרחם, והשתמשו במלקחיים כדי להסיר את שתי הקרניים.
3. מניחים את הקרניים בכלי פטרי המכיל מדיום שלם קר עם 1% FBS. אמנם אין צורך בנפח ספציפי, אך יש להקפיד על כך שהעוברים יהיו שקועים לחלוטין בתווך. נפח משוער של 10 מ"ל לכל צלחת פטרי 10 ס"מ מתאים.
4. תחת הסטריאומיקרוסקופ בהגדלה של פי 5 ובאמצעות מלקחיים, הסירו את רקמת רירית הרחם, השליה ושק החלמון מכל עובר.
5. מניחים את העוברים בצלחת פטרי עם מדיום שלם קר עם 1% FBS. נתחו את אזור הלב העוברי, כפי שמתואר בעובר הסכמטי המתואר באיור 1, בתווך שלם וקר.
6. אגוד אזורי הלב שנותחו מחמישה עוברי עכברים בצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל. צנטריפוגות דלי מתנדנדות מראש ל -4 מעלות צלזיוס.
7. צנטריפוגה ב 300x גרם למשך דקה אחת ב- RT בצנטריפוגת דלי מתנדנדת. הסר את supernatant, ולשטוף את הרקמות על ידי הוספת 1 מ"ל של PBS כיתה תרבית רקמה.
8. צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 1 דקות ב RT. להסיר את supernatant, ולחזור על שלבי הכביסה עבור סך של שתי כביסות. יש לחזור על השטיפה פעמיים, ולהחליף את PBS ב-0.05% טריפסין/EDTA (1x).
9. לעיכול רקמות, יש להוסיף 50 μL של 0.25% טריפסין/EDTA למשך 10 דקות ב-37°C. החל דיסוציאציה מכנית עדינה לאחר 5 דקות על ידי מחוות למעלה ולמטה באמצעות קצה מסנן רחב פתח.
10. להשבית את פעילות העיכול של טריפסין על ידי הוספת 350 μL של תווך מלא לתאים מנותקים. העבירו את התאים המרחפים מחדש דרך מסננת תאים של 40 מיקרומטר.

3. ספירת תאים והערכת כדאיות

הערה: ספירת התאים והכדאיות הם פרמטרים קריטיים להצלחת ניסויים חד-תאיים. גישת snATAC-seq רגישה לשינויים קלים במספר התא. מעט מדי תאים מובילים לעיכול יתר של הכרומטין, מה שגורם למספר גבוה יותר של קריאות ולמיפוי של אזורי כרומטין בלתי נגישים (רעש). באופן דומה, ריבוי תאים יוצר מקטעים בעלי משקל מולקולרי גבוה שקשה לרצף אותם. לצורך קביעה מדויקת של ריכוזי התא והגרעינים, ספירת התאים ויכולת הקיום שלהם הוערכו בשתי שיטות שונות.

1. בצע בדיקת טריפאן כחול לספירת תאים, כמתואר להלן.
   1. מערבולת 0.4% תמיסת צביעה כחולה טריפאן, מסתובבת במשך 10 שניות בטמפרטורת החדר ב 2,000 x גרם, ומעבירה 10 μL לתוך מיקרו-צינור.
   2. בעזרת פיפטה, מערבבים את תרחיף התא, ומוסיפים 10 μL של תרחיף ל-10 μL של תמיסת טריפאן כחולה. מערבבים בזהירות 10 פעמים עם פיפטה.
   3. העבר 10 μL של התאים המוכתמים לשקופית ספירה. מקם את השקופית בדלפק כדי לחשב באופן אוטומטי את ריכוז התא ואת הכדאיות.
2. לבצע הערכה מבוססת פלואורסצנטיות של התמותה כמתואר להלן.
   הערה: בדיקה זו מבוססת על שימוש בצבעים פלואורסצנטיים (ethidium homodimer-1, EthD-1 ו-calcein AM) כדי להעריך את כדאיות התא. נעשה שימוש בערכה מסחרית, והוראות הספק מולאו לצורך הכנה ושימוש מתאימים.
   1. הכן תמיסת EthD-1 של 10 מיקרומטר על ידי הוספת 5 מיקרוליטר של תמיסת מלאי EthD-1 של 2 mM שסופקה ל- 1 מ"ל של D-PBS סטרילי בדרגת תרבית רקמה, ומערבולת למשך 5 שניות כדי להבטיח ערבוב מלא.
   2. העבר 2.5 μL של פתרון מלאי AM של 4 mM calcein המסופק לפתרון EthD-1 שכבר הוכנה. מערבולת במשך 5 שניות כדי להבטיח ערבוב מלא.
   3. הוסף 10 μL של 10 μM EthD-1 ו 10 μM calcein AM פתרון עבודה ל 10 μL של השעיית התא.
      הערה: קלצאין רגיש מאוד להידרוליזה בתמיסות מימיות, לכן השתמש בתמיסת עבודה זו תוך יום אחד.
   4. העבר 10 μL של התאים המוכתמים לשקופית ספירה. הכנס את השקופית למונה התאים הפלואורסצנטיים האוטומטי. ספור את התאים החיים באמצעות מסנן GFP ואת התאים המתים באמצעות מסנן RFP.
      הערה: שתי שיטות הספירה נתנו ספירת תאים דומה וכדאיות, והמספר הכולל של תאים מנותקים טריים הוערך בממוצע בסביבות 20,000 תאים לכל אזור לב עוברי (0.06 מ"מ³).

4. הקפאת תאים

1. צנטריפוגה את מתלה התא ב 500 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. בזהירות להסיר את supernatant מבלי לגעת בתחתית הצינור, ו resuspend את הגלולה ב 1 מ"ל של מדיום הקפאה צונן.
2. מעבירים את תרחיף התא לקריובל מקורר מראש, ומניחים את הקריוביאל במיכל הקפאה מקורר מראש.
3. מניחים את המיכל על −80 ^◦C במשך 4 שעות עד 8 שעות. העבר את הקריוביאל לחנקן נוזלי עבור ניסויי RNA של גרעין יחיד במורד הזרם וריצוף ATAC.
   הערה: יש להעביר את ההקפאה על קרח יבש לפני השימוש. מניסיוננו, התאים עשויים להיות מאוחסנים בחנקן נוזלי למשך 6 חודשים לפחות ללא אובדן יכולת הקיום של התא. טמפרטורת האחסון צריכה להישמר מתחת ל -150 מעלות צלזיוס כל הזמן כדי למנוע היווצרות גבישי קרח.

5. הפשרת תאים וסילוקם של תאים מתים

1. הכניסו את הקריובלים לאמבט מים בטמפרטורה של 37°C למשך 1-2 דקות. הסר אותו כאשר גביש זעיר נשאר בהקפאה.
2. יש להוסיף 1 מ"ל של מדיום שלם שחומם מראש (37°C). מערבבים עם פיפטה שלוש פעמים. מעבירים את המתלה לצינור חרוטי 15 מ"ל המכיל 10 מ"ל של מדיום שלם חם.
3. מעבירים את כל מתלה התא מעל מסננת של 30 מיקרומטר. שוטפים את המסננת עם 1-2 מ"ל של מדיום שלם חם, ואוספים את הזרימה באותו צינור חרוט.
4. צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 5 דקות, ולהסיר supernatant. שטפו פעם אחת עם PBS, והעבירו את תרחיף התא למיקרו-צינור בנפח 1.5 מ"ל.
5. צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 5 דקות, ולהסיר את supernatant מבלי להפריע את כדור התא.
6. הוסף 100 μL של מיקרו-כדוריות מגנטיות שסופקו לתאים הכדוריים, והומוגניזציה חמש פעמים באמצעות קצה פיפטה רחב. דגירה במשך 15 דקות ב- RT.
7. בינתיים, שטפו את עמוד ההפרדה המגנטי (קיבולת: 1 x 10⁷ עד 2 x 10⁸ תאים) עם 500 μL של 1x מאגר קשירה.
8. לאחר השלמת הדגירה, לדלל את תרחיף התא המכיל את microbeads עם 500 μL של 1x חיץ קשירה.
9. החל את תרחיף התא (0.6 μL) על עמודת ההפרדה המגנטית המוכנה. הזרימה היא מקטע התא החי שנבחר באופן שלילי, והמקטע השמור מגנטית הוא התאים המתים שנבחרו באופן חיובי.
10. לאסוף את שפכי התא החי בצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל. שטפו את המיקרו-צינור בנפח 1.5 מ"ל שהכיל את תרחיף התא ואת העמוד ב-2 מ"ל של חיץ מחייב 1x, ואספו את השפכים באותו צינור של 15 מ"ל.
11. צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 5 דקות. הסר את supernatant מבלי להפריע גלולה התא.
12. הוסף 1 מ"ל של תמיסת PBS-BSA, וערבב בעדינות על ידי פיפטציה חמש פעמים באמצעות קצה פיפטה רחב פתח. העבר את תרחיף התא לתוך microtube 1.5 מ"ל.
13. צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 5 דקות. הסר את supernatant מבלי להפריע גלולה התא.
14. הוסף 1 מ"ל של PBS-BSA כדי להשעות מחדש את הכדורית, וחזור על שלב הכביסה בסך הכל שתי כביסות.
15. להשעות מחדש את התאים ב 100 μL של תמיסת PBS-BSA. מערבבים בעדינות על ידי פיפטינג 10 פעמים.
16. לקבוע את הריכוז ואת הכדאיות של התאים באמצעות השיטות שתוארו לעיל (שלב 3.1 ושלב 3.2). כדי להמשיך לשלב הבא, ודא ספירת תאים של ≥100,000 תאים. ראו איור 2 לקבלת תוצאות מייצגות.
    הערה: שימור בהקפאה גורם לאובדן של כ-40% מחומר המוצא הראשוני של תאים חיים. בהתאם למספר התאים ההתחלתי, הפרדת חרוזים על עמוד מגנטי גורמת לכדאיות גבוהה של התא, אך מחלקת את מספר התאים הכולל פי שניים עד פי חמישה. מומלץ להשתמש בערכה מגנטית מבוססת עמוד כדי להסיר את התאים המתים רק כאשר יש מספיק חומר מוצא זמין.

6. בידוד גרעינים

הערה: snATAC ו- snRNA-seq משולבים מבוצעים עם תרחיף של גרעינים נקיים ושלמים. מומלץ לבצע אופטימיזציה של תנאי הליזיס (זמן ליזה וריכוז NP40) עבור סוג התא המשומש. נקודת הזמן האופטימלית של הליזה וריכוז הדטרגנטים הם אלה שמביאים למספר המרבי של תאים להיות lysed מבלי לשבש את המורפולוגיה הגרעינית. ניתן להפחית את אובדן התאים / גרעינים באמצעות צנטריפוגת דלי מתנדנדת במקום צנטריפוגה בעלת זווית קבועה. כדי למזער את שימור הגרעינים על פלסטיק, מומלץ להשתמש בקצוות פיפטה בעלי שימור נמוך ובצינורות צנטריפוגה. זה יכול להגביר את התאוששות הגרעינים. ציפוי קצות הפיפטה ושפופרות הצנטריפוגות ב-5% BSA הוא חלופה זולה יותר אך גוזלת יותר זמן.

1. נקו את מקום העבודה והחומרים עם 70% אתנול ותמיסת הסרת RNase.
2. צנטריפוגות דלי מתנדנדות מראש ל -4 מעלות צלזיוס. הכינו טרייה של חיץ ליזיס, חיץ דילול ליזיס, חיץ ליזיס 0.1x ומאגר כביסה (ראו טבלה 1). שמור את החוצצים על קרח.
3. צנטריפוגה את מתלה התא ב 500 x גרם למשך 5 דקות ב 4 ° C בצנטריפוגת דלי מתנדנדת. הסר בעדינות את כל הסופרנאטנט מבלי לגעת בתחתית הצינור כדי למנוע תזוזה של גלולת התא.
4. הוסף 100 μL של חיץ ליזיס 0.1x מקורר. מערבבים בעדינות על ידי פיפטינג 10 פעמים. דוגרים במשך 5 דקות על קרח.
5. מוסיפים 1 מ"ל של חיץ כביסה צונן, ומערבבים בעדינות על ידי פיפטינג חמש פעמים. צנטריפוגה ב 500 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. מוציאים את הסופרנאטנט מבלי להפריע לכדורית הגרעינים.
6. חזרו על השטיפות עם חיץ כביסה צונן במשך שלוש כביסות בסך הכל. הכינו את מאגר הגרעינים המדולל. לאחר ההשעיה, שמור את תמיסת מלאי הגרעינים על קרח.

7. הערכות איכות וכמות של הגרעינים המבודדים

הערה: בהתבסס על ספירת התאים הראשונית והערכת אובדן גרעינים של כ-50% במהלך ליזה של התא, יש להשהות מחדש את מספר התאים המתאים במאגר גרעינים מדוללים קרים. חישוב נפח המתלה עם חיץ גרעינים מדוללים מקורר מבוסס על שחזור גרעינים ממוקד וריכוזי מלאי הגרעינים המתאימים המומלצים על ידי מדריך המשתמש של היצרן. ראה דוגמה לחישוב זה בפרוטוקול משלים 1.

1. בהתבסס על ספירת התאים הראשונית ואומדן אובדן גרעינים של כ-50% במהלך ליזה של התא, יש להשהות מחדש את מספר התאים המתאים במאגר גרעינים מדוללים קרים.
2. לקבוע את ריכוז הגרעינים בפועל. ערבבו 2 μL של תמיסת מלאי גרעינים עם 8 μL של מאגר גרעינים מדולל והוסיפו את התערובת לתמיסת העבודה 10 μL של טריפאן כחול או EthD-1/calceinAM. ספור את הגרעינים באמצעות מונה תאים אוטומטי. פחות מ -5% מהתאים צריכים להיות בני קיימא. ראו איור 3 לקבלת תוצאות מייצגות.
3. חשב את נפח מלאי הגרעינים ואת נפח מאגר הגרעינים המדולל כדי לקבל נפח כולל של 5 μL בריכוז המומלץ לתגובת הטרנספוזיציה (עיין במדריך למשתמש של היצרן). המשך מיד לתגובת הטרנספוזיציה על פי המדריך למשתמש¹⁷.
   הערה: כל השלבים מתגובת הטרנספוזיציה לבניית ספריות ATAC ו- GEX בוצעו בהתאם למדריך למשתמש של הערכה המשמשת עבור snRNA-seq ו- snATAC-seq בשילוב¹⁷.

8. ניתוח איכות של ספריות snRNA-seq ו- snATAC-seq

1. לפני שתמשיך לריצוף הדור הבא, אמת את התפלגות האיכות והגודל של ספריות ה- GEX הסופיות של snATAC-seq וביטוי גנים. להעריך את האיכות והכמות של רצפים שזוהו בספריות באמצעות מערכות ניתוח מקטעים. ראה איור 4 לקבלת תוצאות הערכת איכות מייצגות.
   הערה: העקבות הסופיות של ספריות snATAC-seq צריכות להראות את המחזוריות של פיתול נוקלאוזומים, והגדלים צריכים לנוע בין 200 bp למספר Kbp, בעוד שהגדלים בספריית ביטוי הגנים צריכים לנוע בין 300 bp ל- 600 bp.

בהשוואה להכנת מתלים חד-תאיים לגישות חד-תאיות, הכנת מתלים חד-גרעיניים מאתגרת הרבה יותר ודורשת רמה גבוהה יותר של רזולוציה ועיבוד. גורם המפתח לשילוב מוצלח של snRNA-seq ו-snATAC-seq הוא מתלה גרעינים נקי ושלם. יש להתאים את הפרוטוקול לבידוד גרעינים יעיל לכל סוג ומצב רקמה (טרי או קפוא). כאן מתואר פרוטוקול אופטימלי לבידוד גרעינים מתאי לב עובריים קפואים של עכברים. כל השלבים מדיסקציה של אזור הלב העוברי ודיסוציאציה של תאי לב לבידוד גרעינים מסוכמים באיור 1. עבור חומר המוצא, ספירת תאים של 1 x 105-1 x 106 תאים וקיום התא >70% מומלצים לבידוד גרעינים יעיל. כפי שניתן לראות באיור 2, השלב הנוסף שבוצע בפרוטוקול זה למיון והסרה של התאים המתים לאחר ההפשרה איפשר קבלת תרחיף תאים נקי יותר עם כדאיות תאים גבוהה משמעותית ולשיפור איכות הדגימה ההתחלתית. בנוסף לבידוד גרעינים, פרוטוקול זה מספק מידע מפורט על האופן שבו ניתן להעריך את האיכות והכמות של הגרעינים המבודדים (איור 3). איכות הגרעינים המבודדים משפיעה מאוד על איכות הנתונים המשולבים של snRNA-seq ו-snATAC-seq; כאן, איכות הגרעינים המבודדים הוערכה על ידי הערכת המורפולוגיה של קרום הגרעין. הגרעינים המבודדים נראו חלקים ועגולים באופן אחיד, כפי שניתן לראות באיור 3C, תחת מיקרוסקופ שדה בהיר, מה שמצביע על תהליך בידוד יעיל. ליתר דיוק, נעשה שימוש בשתי שיטות ספירה שונות, כולל כחול טריפאן וערכה להערכה מבוססת פלואורסצנטיות של כדאיות, כדי לכמת את התאים והגרעינים. בדיקת הפלואורסצנטיות שימשה לקביעת כדאיות התא בהתבסס על שלמות התא ופעילות אסטראז תוך תאית. תמיסת צבע זו מאפשרת להבחין בין תאים חיים לתאים מתים על ידי הדמיה בו זמנית של קלצאין פלואורסצנטי ירוק AM, המציין את פעילות האסטראז התוך-תאי, ואתידיום הומודימר פלואורסצנטי אדום 1, המשקף את אובדן שלמות התא. שימוש בצבע פלואורסצנטי לספירה מסייע להבחין בין גרעינים לבין גושי תאים ופסולת. באמצעות פרוטוקול זה, כדאיות התא עברה מ-80%-90% לפני בידוד גרעינים ל-<5% לאחר בידוד גרעינים, כפי שמוצג באיור 3A,B.

ההליך שלנו הושווה לשיטה הקיימת, הכוללת הקפאת רקמה טרייה ישירות בחנקן נוזלי וביצוע שלב הליסינג ללא דיסוציאציה אנזימטית מוקדמת (פרוטוקול משלים 2 ואיור משלים 1). שתי הגישות נבדקו כדי לקבוע איזו שיטה נותנת תרחיף גרעינים באיכות טובה יותר. הקפאת רקמת לב עוברית שלמה בזק הולידה אחוז גבוה של תאים לא ליזה שזוהו כחיים, מה שמצביע על ליזה לא מתאימה של תאים (איור משלים 1A). נצפו אגרגטים ותאים לא בודדים למרות סינון דרך מסננים (איור משלים 1A,B).

הגרעינים המבודדים שימשו ליצירת ספריות עבור snATAC-seq ו-snRNA-seq משותפים. איור 4 מדגים את תוצאות בקרת האיכות של cDNA המשמש לבניית ספריית ביטוי גנים (GEX) וספריית ATAC. בקרת האיכות בוצעה באמצעות אלקטרופורזה אוטומטית (איור 5A). ה-cDNA שמקורו ב-mRNA כומת, והתשואה הספיקה לשימוש עתידי בבניית ספריות GEX. התקבלו ספריית GEX באיכות גבוהה הנעה בין ~ 300 bp ל 600 bp וספריית ATAC באיכות גבוהה עם פיתול נוקלאוזומים תקופתי הנע בין 200 bp ל 7 kbp. ספריות אלה רוצפו באמצעות ריצוף בתפוקה גבוהה ויצרו בהצלחה ביטוי גנים של גרעין יחיד ונגישות כרומטין (איור 5A). נתונים גולמיים אלה היו מוכנים לפירוק וניתוח ביואינפורמטי כדי ליצור פרופיל שעתוק ואפיגנטי של תאי אב לבביים E9.5 של עכבר. SnRNA-seq ו-snATAC-seq קובצו, זוהו ותויגו על בסיס גנים ידועים של סמנים באמצעות אשכולות ללא פיקוח עם ערכת הכלים של Seurat עבור גנומיקה יחידה24 . ניתוח ראשוני זה אישר את נוכחותם של כל סוגי תאי הלב הצפויים ב-E9.5 (איור 5B).

כל התוצאות הנ"ל תומכות בהצלחה של פרוטוקול זה בבידוד גרעינים המתאימים לגישות של גרעינים בודדים במורד הזרם מתאי לב עובריים מוקפאים.

איור 1: ייצוג השלבים העיקריים בהכנת הדגימה לפרופיל משולב של snRNA-seq ו-snATAC-seq. תרשים זרימה זה משחזר את כל השלבים, כולל דיסקציה של רקמת הלב ודיסוציאציה של תאי לב, הקפאה והפשרה של תאים, טיהור תאים חיים על ידי הסרת תאים מתים, ובידוד גרעינים, המתבצעים לזיהוי סימולטני של נגישות mRNA וכרומטין מאותו תא. קיצורים: PBS = מלח חוצץ פוספט; BSA = אלבומין בסרום בקר; RT = טמפרטורת החדר. נוצר באמצעות BioRender.com לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: הכדאיות של התאים המופשרים הממוטבים לאחר מיון תאים מתים. תמונות המציגות את ספירת התאים ואת יכולת הקיום באמצעות מונה תאים אוטומטי לפני (למעלה) ואחרי (למטה) הסרת תאים מתים באמצעות צבע ההרחקה הכחול טריפאן. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: בקרת איכות של הכנת הגרעינים. (A,B) תמונות המציגות את ספירת התאים ואת יכולת הקיום שלהם באמצעות מונה תאים אוטומטי לפני בידוד גרעינים (עליון) ואחרי (תחתון). נעשה שימוש בשתי שיטות ספירה: (A) בדיקת התמותה הפלואורסצנטית ו-(B) בדיקת הטריפאן הכחול. (C) תמונות המציגות את איכות בידוד הגרעינים. התמונות צולמו במהירות של 20x (סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר) באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר ופלואורסצנטי. תמונת השדה הבהיר (משמאל) מציגה מורפולוגיה גרעינית; RFP (באמצע) מראה תאים שאיבדו את שלמות הממברנה שלהם, במילים אחרות, גרעינים מבודדים; וה-GFP (מימין) שבדרך כלל מצביע על פעילות אסטראז של תאים חיים כאן מאשר את היעדרם של תאים חיים בתרחיף הגרעינים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: בקרת איכות של ביטוי גנים חד-תאיים וספריות ATAC. ניתוח DNA עם אלקטרופורזה אוטומטית המראה את התפלגות האיכות והגודל של cDNA (למעלה), ספריית GEX (באמצע) וספריית ATAC (למטה). לצורך כימות cDNA נבחר האזור שנע בין 200 bp ל-8,900 bp, והביואנלייזר העריך את ריכוז cDNA (ב-pg/μL; עיגול אדום). תפוקת cDNA מספקת התקבלה כדי להמשיך בבניית ספריית GEX. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 5: ביצועים לדוגמה שהוערכו באמצעות תוכנת Cell Ranger25. (A) תרשים רגישות צולבת המציג את אירועי הטרנספוזיציה בשיאים לברקוד על ציר ה-x ומזהים מולקולריים ייחודיים של RNA (UMIs) לכל ברקוד על ציר ה-y. כצפוי, התאים ממוקמים בעיקר בפינה הימנית העליונה, עם נתוני RNA ו-ATAC גבוהים. נצפתה הפרדה ברורה בין התאים ללא-תאים (GEMs ריקים, אות רקע). (B) תרשים מייצג של סעפת אחידה והיטל (UMAP) של כל התאים שנלכדו ב-scRNA-seq (משמאל) וב-scATAC-seq (מימין) הצבועים לפי זהות אשכול ומקובצים לפי סוגי תאים. נצפתה הפרדה טובה בין אשכולות. נתונים גולמיים משותפים של GEX ו-ATAC התקבלו מריצוף של 7,000 גרעינים מאזור הלב העוברי של עכבר E9.5 שנותח. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

תרשים משלים 1: בקרת איכות של בידוד גרעינים מהשיטה הקיימת של הקפאת רקמה טרייה ישירות בחנקן נוזלי. (A) תמונות המציגות את ספירת הגרעינים המבודדים באמצעות מונה תאים אוטומטי וכחול טריפאן כצבע ההרחקה לפני סינון (למעלה) ואחרי (למטה) דרך מסננת של 40 מיקרומטר. אחוז גבוה של תאים שאינם ליזה זוהו כחיים. זיהוי של 20% תאים חיים מצביע על ליזה תאים בלתי הולמת. החצים השחורים מציינים אגרגטים. (B) תמונות המציגות את איכות הגרעינים המבודדים. התמונות צולמו במהירות של 20x (למעלה ובאמצע עם סרגל קנה מידה של 50 מיקרומטר) ו-40x (למטה עם סרגל קנה מידה של 25 מיקרומטר) באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר ופלואורסצנטי. תמונת השדה הבהיר (משמאל) מציגה את המורפולוגיה הגרעינית; RFP (מימין) מראה תאים שאיבדו את שלמות הממברנה שלהם, במילים אחרות, גרעינים מבודדים. החיצים השחורים מציינים מכפלות של גרעינים המחוברים על ידי פסולת. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

טבלה 1: טבלת מאגרים ופתרונות המשמשים בהליך. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

פרוטוקול משלים 1: הערכת כמות הגרעינים המבודדים. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

פרוטוקול משלים 2: בידוד גרעינים מרקמה קפואה בזק. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

למחברים אין מה לחשוף.