כאן, אנו מציגים פרוטוקול חזותי מפורט לביצוע מודל קשירת פרוזדורים שמאלית (LAL) בעובר העופות. מודל LAL משנה את הזרימה התוך-לבבית, אשר משנה את העמסת הלחץ של גזירת הקיר, ומחקה תסמונת לב שמאל היפופלסטית. מוצגת גישה להתגבר על האתגרים של מודל מיקרוכירורגיה קשה זה.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
קשירת פרוזדורים שמאלית בעובר העופות כמודל לשינוי עומס המודינמי במהלך התפתחות כלי הדם המוקדמת
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
בשל תצורת החדר הבוגר בעל ארבעת החדרים, קלות התרבית, הגישה להדמיה והיעילות, עובר העופות הוא מודל מועדף של בעלי חוליות לחקר התפתחות הלב וכלי הדם. מחקרים שמטרתם להבין את ההתפתחות התקינה ואת הפרוגנוזה של מומי לב מולדים מאמצים באופן נרחב מודל זה. טכניקות כירורגיות מיקרוסקופיות מוצגות כדי לשנות את דפוסי ההעמסה המכנית הרגילים בנקודת זמן עוברית ספציפית ולעקוב אחר המפל המולקולרי והגנטי במורד הזרם. ההתערבויות המכניות הנפוצות ביותר הן קשירת ורידים ויטלין שמאלי, פסים קונוטרונליים וקשירת פרוזדורים שמאלית (LAL), המווסתים את לחץ כלי הדם התוך-גווארי ואת לחץ הגזירה בקיר עקב זרימת הדם. LAL, במיוחד אם היא מבוצעת באובו, היא ההתערבות המאתגרת ביותר, עם תפוקת דגימות קטנה מאוד בשל הפעולות המיקרוכירורגיות הרציפות העדינות ביותר. למרות הסיכון הגבוה שלה, ב ovo LAL הוא בעל ערך מדעי רב כפי שהוא מחקה hypoplastic תסמונת הלב השמאלי (HLHS) פתוגנזה. HLHS היא מחלת לב מולדת מורכבת ורלוונטית מבחינה קלינית שנצפתה ביילודים אנושיים. פרוטוקול מפורט עבור in ovo LAL מתועד במאמר זה. בקצרה, עוברי עופות מופרים הודגרו בטמפרטורה של 37.5 מעלות צלזיוס ולחות קבועה של 60%, בדרך כלל עד שהגיעו לשלבי המבורגר-המילטון (HH) 20 עד 21. קליפות הביצים נסדקו והקרומים החיצוניים והפנימיים הוסרו. העובר סובב בעדינות כדי לחשוף את פקעת הפרוזדורים השמאלית של האטריום המשותף. מיקרו-קשרים שהורכבו מראש מתפרי ניילון 10-0 מוקמו בעדינות ונקשרו סביב ניצן הפרוזדורים השמאלי. לבסוף, העובר הוחזר למקומו המקורי, ו-LAL הושלם. חדרים תקינים ו-LAL הדגימו הבדלים מובהקים סטטיסטית בדחיסת הרקמות. צינור ייצור יעיל של מודל LAL יתרום למחקרים המתמקדים במניפולציה מכנית וגנטית מסונכרנת במהלך ההתפתחות העוברית של רכיבים קרדיווסקולריים. כמו כן, מודל זה יספק מקור תאים מוטרד למחקר תרביות רקמות וביולוגיה של כלי הדם.
מבוא
מומי לב מולדים (CHDs) הם הפרעות מבניות המתרחשות עקב התפתחות עוברית לא תקינה1. בנוסף לתנאים גנטיים, הפתוגנזה מושפעת מעומס מכני משתנה 2,3. תסמונת לב שמאל היפופלסטית (HLHS), מחלת לב מולדת, גורמת לחדר / אבי העורקים לא מפותח בלידה4 עם שיעור תמותה גבוה 5,6. למרות ההתקדמות האחרונה בניהול הקליני שלה, צמיחת כלי הדם ודינמיקת ההתפתחות של HLHS עדיין לא ברורים7. בהתפתחות עוברית תקינה, אנדוקרדיום החדר השמאלי (LV) ושריר הלב מקורם באבות הלב עם התקדמות היווצרות צינור הלב העוברי המוקדם. נוכחות הדרגת....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
ביצי לגהורן לבנות פוריות מתקבלות מספקים מהימנים ומודגרות על פי הנחיות שאושרו על ידי האוניברסיטה. עוברי אפרוחים, שלבים 18 (יום 3) עד 24 (יום 4) (השלבים המוצגים במאמר זה) אינם נחשבים לבעלי חוליות חיים על פי הנחיית האיחוד האירופי (EU) 2010/63/EU והנחיות הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) בארה"ב. עוברי אפרוחים נחשבים ל"בעלי חיים חיים" לאחר היום ה-19 של הדגירה על פי חוקי ארה"ב, אך לא עבור האיחוד האירופי. כל ביצה מסומנת בתאריך תחילת הבקיעה ומתוכננת לבקוע לא יאוחר מהיוםהעשירי לדגירה. לאחר בקיעת הביצים מוציאים את האפרוחים מהאינקובטור. הפרוטוקול מבוצע בשתי תחנות הפעלה (תחנה 1 ותחנה 2), תוך התמקדות בשלבי ייצור דגמים מיוחדים.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
ניתן להשתמש בטכניקות הדמיה מתקדמות שנפתרו בזמן כדי לבחון את השינויים המבניים והמורפולוגיים עקב התערבות LAL10. יתר על כן, דגימות LAL מקובלות גם על שיטות מולקולריות וביולוגיות19,28. בטבלה 1 מובאים מחקרים מדגמיים שהשתמשו בתוצאות מודל LAN. בהקשר זה, התערבות LAL בוצעה בעוברי אפרוחים שהגיעו ל- HH20-21. גם לבבות הבקרה (בריאים) וגם לבבות LAL הוצאו מהעובר ב- HH25-26. לאחר מכן, הדגימות היו קבועות 4% paraformaldehyde (PFA) ב 4 ° C
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
ב- HLHS, זרימת הדם משתנה עקב פגמים מבניים, מה שמוביל למורפולוגיה לא תקינה בצד שמאל 4,6. המודל הנוכחי מספק מערכת ניסויית מעשית כדי להבין טוב יותר את ההתקדמות של HLHS ואולי אפילו לחקות את הפתוגנזה שלו8. עם זאת, הקמת מודל בעלי חיים HLHS שווה ערך לחלוטין מבחינה קלינית היא משימה מאתגרת. בנוסף למודל LAL העופות המוצג כאן, מחקרים אחרונים בעכברים, כבשים עובריות וצפרדעים ניסו לשכפל את התכונות המורפולוגיות, המודינמיות והפתופיזיולוגיות של פרוגנוזת HLH.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין מה לחשוף.
תודות
אנו מכירים בפרס החוקר הראשי של Tubitak 2247A 120C139 המספק מימון. המחברים רוצים גם להודות לפאקטבוק גידה. A. S., איסטנבול, טורקיה, על אספקת ביציות פוריות ותמיכה במחקר הלב וכלי הדם.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 10-0 תפר כירורגי ניילון | Ethicon | ||
| Elastica van Gieson ערכת צביעה | Sigma-Aldrich | 115974 | לצביעה של רקמות חיבור בחתכים היסטולוגיים |
| אתנול מוחלט | Interlab | 64-17-5 | לשלב העיקור הושג 70% אתנול על ידי דילול אתנול מוחלט במים מזוקקים. |
| חממה | KUHL, פלמינגטון, ניו ג'רזי-ארה"ב | AZYSS600-110 | |
| Kimwipes | Interlab | 080.65.002 | |
| Microscissors | World Precision Instruments (WPI), Sarasota FL | 555640S | Vannas STR 82 מ"מ |
| Parafilm M | Sigma-Aldrich | P7793-1EA | שלב איטום לדגירה מחדש של ביצים |
| Paraplast בתפזורת | Leica Biosystems | 39602012 | שיבוץ רקמות בינוני |
| מיקרוסקופ סטריאו | Zeiss Stemi 508 | Stemi 508 | בשימוש בתחנה 1 |
| מיקרוסקופ סטריאו | Zeiss Stemi 2000-C | Stemi 2000-C | בשימוש בתחנה 2 |
| פינצטה (Dumont 4 INOX #F4) | Adumont & פילס, שוויץ | נהג להחזיר את העובר | |
| פינצטה (Super Fine Dumont #5SF) | World Precision Instruments (WPI), Sarasota FL | 501985 | משמש להסרת הממברנות על העובר |
מקורות
- Wang, T., et al. Congenital heart disease and risk of cardiovascular disease: A meta-analysis of cohort studies. Journal of the American Heart Association. 8 (10), e012030(2019).
- Chaudhry, B., et al.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
