פרוטוקול זה מדגים מודל שבץ עכבר ייחודי עם אוטם בגודל בינוני ושיעור הישרדות מצוין. מודל זה מאפשר לחוקרי שבץ פרה-קליניים להאריך את משך האיסכמיה, להשתמש בעכברים מזדקנים ולהעריך תוצאות תפקודיות ארוכות טווח.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
מודל שונה של חסימת עורק מוחי אמצעי טרנס-גולגולתי לחקר תוצאות שבץ מוחי בעכברים מזדקנים
במאמר זה
סיכום
תקציר
במחקר שבץ ניסיוני, חסימת עורק מוחי אמצעי (MCAO) עם חוט להט intraluminal נמצא בשימוש נרחב כדי למדל שבץ איסכמי בעכברים. מודל MCAO נימה מציג בדרך כלל אוטם מוחי מסיבי בעכברי C57Bl/6 הכולל לעיתים רקמת מוח בשטח המסופק על ידי עורק המוח האחורי, אשר נובע בעיקר משכיחות גבוהה של אטרזיה עורקית תקשורת אחורית. תופעה זו נחשבת לתורמת מרכזית לשיעור התמותה הגבוה שנצפה בעכברי C57Bl/6 במהלך התאוששות ארוכת טווח משבץ מוחי לאחר MCAO נימה. לפיכך, מחקרי שבץ כרוני רבים מנצלים מודלים דיסטליים של MCAO. עם זאת, מודלים אלה בדרך כלל מייצרים אוטם רק באזור קליפת המוח, וכתוצאה מכך, הערכת ליקויים נוירולוגיים לאחר שבץ יכולה להיות מאתגרת. מחקר זה ביסס מודל MCAO טרנס-גולגולתי שונה שבו ה-MCA בתא המטען מוסתר חלקית באופן קבוע או ארעי דרך חלון גולגולת קטן. מאחר שמיקום החסימה קרוב יחסית למקור ה-MCA, מודל זה יוצר נזק מוחי הן בקליפת המוח והן בסטריאטום. אפיון נרחב של מודל זה הוכיח שיעור הישרדות מצוין לטווח ארוך, אפילו בעכברים זקנים, כמו גם ליקויים נוירולוגיים הניתנים לגילוי בקלות. לכן, מודל העכבר MCAO המתואר כאן מייצג כלי רב ערך לחקר שבץ ניסיוני.
מבוא
כמעט 800,000 אנשים סובלים משבץ מוחי בארה"ב מדי שנה, ורוב השבץ הזה הוא איסכמי באופיו1. שחזור בזמן של זרימת הדם במוח עם מפעיל פלסמינוגן רקמות (tPA) ו / או thrombectomy הוא כיום הטיפול היעיל ביותר עבור חולי שבץ; עם זאת, התאוששות מלאה של תפקודים נוירולוגיים בטווח הארוך היא נדירה 2,3. לפיכך, חיפוש אחר טיפול חדשני בשבץ המתמקד בשיפור תפקודי הוא תחום מחקר אינטנסיבי הדורש מודלים רלוונטיים מבחינה קלינית של שבץ מוחי.
מודל השבץ האיסכמי הנפוץ ביותר במכרסמים משתמש בחסימת עורק מוחי אמצעי תוך לומינלי (MCAO) כדי לגרום לשבץ. במודל זה, שפותח לראשונה על ידי זאה לונגה בשנת 1989, חוט ניילון מוכנס לעורק התרדמה הפנימי (ICA) כדי לחסום את זרימת הדם לעורק המוח האמצעי (MCA)4. עם זאת, מודל זה יש מגבלות. ראשית, כאשר חוט הלהט מוכנס לאגודה למלחמה בסרטן, זרימת הדם לעורק המוח האחורי (PCA) עלולה להיחסם חלקית גם כן, במיוחד בעכברים. באופן קריטי, עורק התקשורת האחורי (PcomA), עורק קטן המחבר בין מחזור הדם המוחי הקדמי והאחורי, אינו מפותח לעתים קרובות בזני עכברים מסוימים, כגון C57Bl/6, הזן המשמש בעיקר במחקר שבץ ניסיוני. פטנט זה של PcomA הוא האמין לתרום לשונות בגודל הנגע בעכברים לאחר שבץ5. ואכן, כאשר זרימת הדם ל- PCA יורדת באופן תלול במהלך MCAO, וה- PcomA אינו מסוגל לספק זרימת דם בטחונית מספקת, אוטם השבץ יכול להתרחב לשטח ה- PCA. יתר על כן, במודל זה, משך זמן ארוך של איסכמיה מוביל לסיכוי גבוה יותר לתמותה בעכברים. כתוצאה מכך, משך MCAO קצר של 30-60 דקות משמש בדרך כלל בעכברים. עם זאת, רוב חולי שבץ חווים כמה שעות של איסכמיה לפני טיפול רפרפוזיה. לפיכך, מודל שבץ עכבר עם משך ממושך של איסכמיה הוא בעל רלוונטיות קלינית גבוהה.
המטרה הכוללת של הליך זה היא למדל שבץ איסכמי בעכברים שיש להם אוטם בגודל בינוני ושיעור הישרדות מצוין. מודל MCAO טרנס-גולגולתי זה מתייחס לתכונות קריטיות של שבץ קליני, שכן ניתן לבצע איסכמיה ממושכת, ועכברים מזדקנים סובלים מודל זה היטב, ומאפשרים הערכה ארוכת טווח של התאוששות תפקודית.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל ההליכים המתוארים בעבודה זו נערכים בהתאם להנחיות NIH לטיפול ושימוש בבעלי חיים במחקר, והפרוטוקול אושר על ידי הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים של מכון דיוק (IACUC). במחקר הנוכחי נעשה שימוש בעכברי C57Bl/6 זכרים צעירים (בני 8-10 שבועות) ובגיל 22 חודשים. סקירה כללית של פרוטוקול זה מודגמת באיור 1.
1. הכנה כירורגית
- בדוק את העכבר עבור חריגות גסות וליקויים התנהגותיים.
הערה: לפני הניתוח, חשוב שהמנתחים ילבשו ציוד הגנה אישי מתאים, כולל מסכה כירורגית, כובע, כפפות וחלוק. - לשקול את העכבר; תכננו את מכונת ההנשמה (ראו טבלת חומרים) בהתאם למשקל הגוף.
- הניחו את העכבר בקופסת אינדוקציה להרדמה בגודל 4 x 4 אינץ' x 7. הפעל את מד זרימת החמצן (ראה טבלת חומרים), המוגדר על 30, ואת מד זרימת תחמוצת החנקן, המוגדר על 70. הפעל את הוופורייזר עם איזופלורן 5%.
- הכנס את החוט המנחה לצנתר 20 G תוך ורידי (IV).
- הוציאו את העכבר מקופסת האינדוקציה כאשר קצב הנשימה שלו מופחת ל 30-40 נשימות לדקה.
- הניחו את העכבר על ספסל הניתוחים במצב שכיבה. משוך את לשון העכבר החוצה והחזק אותה באצבעות יד שמאל. הכנס לרינגוסקופ (ראה טבלת חומרים) לפיו של בעל החיים כדי להמחיש את מיתרי הקול.
- ייצב את סנטר העכבר על הלרינגוסקופ באמצעות האצבע האמצעית הימנית. שחררו את יד שמאל כדי להחזיק את הצנתר 20 G IV.
- הכנס את חוט ההנחיה מעט לתוך מיתרי הקול, ולאחר מכן דחוף באיטיות את צנתר 20 G IV לתוך קנה הנשימה עד שחלק הכנף של הצנתר הופך אחיד עם קצה האף.
הערה: אם העכבר זז, אל תכניס את החוט. זה עלול לגרום טראומה בקנה הנשימה ודימום. - הפעל את מכונת ההנשמה (ראה טבלת חומרים), וחבר אותה לצנתר 20 G IV המוחדר בעכבר. הפחיתו את האיזופלורן ל-1.5%, וודאו ששתי הריאות מאווררות מכנית.
הערה: אל תשכח להפחית את ריכוז isoflurane. אחרת, העכבר יקבל מנת יתר של הרדמה. - יש למרוח משחת עיניים על שתי העיניים ולהזריק 5 מ"ג/ק"ג קרפרופן תת עורית.
- השאר את העכבר במצב רוחבי כאשר האזור הרקתי הימני פונה כלפי מעלה. שמור על טמפרטורת פי הטבעת ב 37 ° C באמצעות כרית חימום (35 ° C) ומנורת חום נשלטת על ידי וסת טמפרטורה (ראה טבלה של חומרים).
- יש לגלח את שטח הפנים שבין עין ימין לאוזן ולחטא את אזור הניתוח לפחות שלוש פעמים באמצעות מקלוני יוד ואלכוהול.
2. ניתוח MCAO
- פתח את חבילת המכשירים הסטריליים לניתוח MCAO. יש ללבוש כפפות סטריליות ולבצע חתך עור של 1 ס"מ בין עין ימין לאוזן ימין באמצעות מספריים כירורגיים.
הערה: יש לעקוב אחר צבע העור, טמפרטורת הגוף והתגובה לצביטה בבוהן כל 15 דקות. - נתחו את הפאשיה הבסיסית בעזרת מלקחיים כדי לחשוף את שרירי הרקתי והמסה.
הערה: היזהר לא לפגוע בלוטת הפרוטיד. - השתמש במלקחיים כדי לגעת בחלק התחתון של השריר הרקתי ולזהות את מיקום הקשת הזיגומטית. בזהירות למשוך הצידה את הענפים של עצב הפנים.
- השתמש בקצה של לולאת צריבה בטמפרטורה גבוהה (ראה טבלת חומרים) כדי לחתוך חתך רוחבי של 5 מ"מ בשריר הרקתי.
- השתמש בשתי מלקחיים כדי לנתח את הקשת הזיגומטית שמתחתיה ולחשוף את המפרק בין העצמות המקסילה והזיגומטיות.
- השתמש במספריים כדי לחתוך חלק 3 מ"מ של הקשת הזיגומטית ולהסיר אותו. להפריד את שריר המסה מבסיס הגולגולת.
הערה: יש להיזהר שלא לשבור את הסינוס הרטרו-אורביטלי ואת הווריד הרקתי השטחי. - החל ארבעה retractors קטן ממוקם בכיוונים שונים כדי לחשוף את בסיס הגולגולת, עם ענפי עצב trigeminal נמשך לרוחב על ידי retractor אחד.
הערה: חריץ על פני השטח החיצוניים של בסיס הגולגולת מסמן את מיקום הסדק הצידי בין האונות הקדמיות והרקתיות. ה-MCA נמצא כאן (איור 2A), והגזע והענפים שלו נראים דרך הגולגולת הדקה והשקופה (איור 2B). הקשר של העורק הזה לעורקי מוח ראשיים אחרים מוצג באיור 2A. - יש למרוח טיפה של 0.9% מי מלח רגילים על הגולגולת שמעל תא המטען MCA ופרוקסימלי על ענף קליפת המוח הרינלית. השתמש במטחנה חשמלית כדי לדלל את הגולגולת עד שנראה שבר קטן.
הערה: אין לדחוף את המטחנה כנגד הגולגולת, מכיוון שהיא עלולה לחדור לגולגולת ולפצוע את העורק שמתחתיה. - השתמש בקצה המלקחיים כדי להרים את הגולגולת הדקה ולהסיר אותה. עבור עכברים דמה, לעצור כאן, ולא לשקר את העורק.
הערה: נוצר חלון מלבני קטן לרוחב תא המטען של MCA. - הניחו לולאה חד-גדילית של משי קלוע שחור על גבי ה-MCA (איור 2C). הוספת 8-0 מחט מיקרוכירורגית כדי להרים את תא המטען של MCA, ולקשור את התפר (ראו טבלת חומרים) מתחת למחט, תוך השארת שני קצוות המחט בחלק העליון של קשר לולאת חוט המשי (איור 2D).
- עבור MCAO חולף, הדקו מעט את קשר חוט המשי מתחת למחט כדי לחסום את זרימת הדם העורקית (איור 2E), מה שמייצג את הופעת ה-MCAO.
- השתמש במלקחיים כדי להחזיק את התפר, והסר לאט את המחט בקצה האיסכמיה (למשל, 60 דקות או יותר).
הערה: כאשר המחט מוסרת, קשר חוט המשי מחליק מה-MCA, והמוח עובר פרפורציה מחדש (איור 2F). - עבור MCAO קבוע, הדקו היטב את לולאת חוט המשי סביב העורק, והוציאו את המחט. חותכים ומסירים את עודפי חומרי התפרים.
- יש למרוח טיפה של 0.25% bupivacaine על חתך העור, ולתפור את השריר והעור בנפרד באמצעות 6-0 תפרי ניילון לסירוגין (ראה טבלת חומרים). יש למרוח משחה אנטיביוטית על פני השטח של חתך העור.
הערה: ניתן לסגור את חתך העור גם עם סיכות סטריליות או דבק.
3. טיפול לאחר ניתוח
- כבה את האיזופלורן כדי להעיר את העכבר. נתק את מכונת ההנשמה כאשר הנשימה הספונטנית משוחזרת.
- העבר את העכבר לתא התאוששות (ראה טבלת חומרים) עם טמפרטורה מבוקרת.
- Extubate העכבר כאשר רפלקס ימין שלה משוחזר, או שהוא מתחיל לנוע.
- עקוב מקרוב אחר העכבר בתא מבוקר טמפרטורה ולחות. להחזיר את העכבר לכלוב הביתי לאחר שהוא מקבל הכרה מלאה (תקופת החלמה ~ 2 שעות). יש לתת 5 מ"ג/ק"ג קרפרופן תת עורית מדי יום במשך 3 ימים.
4. הדמיית ניגודיות כתמי לייזר (LSCI)
- שש ו-24 שעות לאחר MCAO, הרכיבו את העכבר המרדים על המסגרת הסטריאוטקסית. לגלח את החלק העליון של הראש, ולנקות אותו עם שלושה מקלונים לסירוגין של יוד ואלכוהול.
הערה: ההרדמה בוצעה כאמור בשלב 1.3. LSCI מבוצע גם לפני MCAO. - בצע חתך עור בקו האמצע של 3 ס"מ ונתח את העור מהגולגולת. יש למרוח ארבעה מחזירי מחטים קטנים כדי לחשוף את החלק העליון של הגולגולת.
- הזז את מצלמת כתמי הלייזר (ראה רשימת חומרים) מעל הראש וכוונן את מיקוד המצלמה. דמיינו את זרימת הדם במוח.
5. צביעת 2,3,5-triphenyltetrazolium כלוריד (TTC)
- יש להרדים את העכבר עם איזופלורן 5% בסוף הניסוי, בדרך כלל ביום הראשון, השלישי או ה-28 לאחר שבץ. צבטו את הזנב כדי לוודא שאין תגובה לכאב.
- ערפו את ראשו של העכבר באמצעות מספריים כירורגיים וקצרו את המוח. לדגור על המוח במי מלח קרים כקרח למשך 20 דקות.
- הכניסו את המוח למטריצת כלי פריסה במוח על קרח והטילו מי מלח קרים על המוח. חתכו את המוח לפרוסות של 1 מ"מ באמצעות סכיני גילוח דקים.
- טבלו את פרוסות המוח באותו כיוון לתוך צלחת של תמיסת TTC 2% (ראו טבלת חומרים). שומרים את המנה בחושך בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.
הערה: רקמת מוח רגילה הופכת לאדומה ורקמה איסכמית נשארת לבנה. - מעבירים את פרוסות המוח ל-10% פורמלין למשך 24 שעות של קיבוע. דמיינו את פרוסות המוח ומדדו את אזור האוטם.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
עם מבט ישיר תחת מיקרוסקופ כירורגי, ניתן לאשר חזותית כי זרימת הדם MCA חסומה במהלך איסכמיה. המחקר הקודם שלנו הראה ירידה של >80% בזרימת הדם באזור האיסכמי באמצעות לייזר דופלרמוניטור 6. כדי לקבוע שינויים בזרימת הדם שלאחר MCAO, LSCI יכול לשמש כדי לאשר עוד יותר את העלבון האיסכמי ואת הרפרפוזיה (איור 1). ואכן, באיור 3A ניתן לראות כי אספקת הדם הופחתה בשטח של MCA הימני. עבור MCAO חולף, לאחר הסרת התפר, ניכרה רפרפוזיה של זרימת הדם במוח (איור
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
מודל חסימת MCA הטרנס-גולגולתי הראשון הוקם בחולדות בשנת 1981 11,12, והוחלף על ידי מודל MCAO ללא גולגולת בשנת1989 4. חסימת MCA טרנס-גולגולתית ראשונית הייתה בעלת שדה ניתוחי רחב, כך שכל הקשת הזיגומטית הוסרה והשרירים נמשכו לרוחב. רקמות מקומיות נפוחות לאחר הניתוח, מה שגרם ללחץ ולירידה בצריכת המזון של בעלי החיים. במודל MCAO הטרנס-גולגולתי המותאם שלנו, החתך פחות פולשני, ורק קטע קטן מהקשת הזיגומטית מוסר. שדה הניתוח נחשף באמצעות ארבעה מחזירי מחטים ק...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
לכל המחברים אין ניגוד אינטרסים.
תודות
המחברים מודים לקתי גייג' על תמיכתה בעריכה. דמויות התוכנית נוצרו עם BioRender.com. מחקר זה נתמך על ידי כספים מהמחלקה להרדמה (המרכז הרפואי של אוניברסיטת דיוק) ומענקים של NIH (NS099590, HL157354, NS117973 ו-NS127163).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 0.25% בופיבקאין | Hospira | NDC 0409-1159-18 | |
| 0.9% נתרן כלורי | טיפול נמרץ NDC רפואי | 0990-7983-03 | |
| 2,3,5-טריפנילטרזוליום כלוריד (TTC) | סיגמא או כל ספק | ||
| 20 G IV קטטר | BD | 381534 | 20 GA 1.6 ב |
| 30 גרם מחט | BD | 305106 | |
| 4-0 תפר משי | מראה | SP116 | משי קלוע |
| שחור 8-0 תפר עם מחט | Ethilon | 2822G | |
| ספוגיות אלכוהול | BD | 326895 | |
| הרדמה תיבת אינדוקציה | כל ספק | Pexiglass make | |
| מטחנה חשמלית | JSDA | JD 700 | |
| קצה לולאת צריבה בטמפרטורה גבוהה | Bovie | AA03 | |
| Isoflurane | Covetrus | NDC 11695-6777-2 | |
| צג זילוף דופלר לייזר | Moor Instruments | moorVMS-LDF1 | |
| משחת עיניים חומר סיכה | Bausch + Lomb | 339081 | |
| בדיקה | רקטלית של עכברPhysitemp | RET-3 | |
| תחמוצת החנקן | איירגז | UN1070 | |
| אוטוסקופ | Welchallyn | 728 | 2.5 מ"מ אוטוסקופ ספקולום שימש כגרון להדמיית מיתרי קול בעכברים |
| חמצן | Airgas | UN1072 | |
| פובידון-יוד | CVS | ||
| ברינסי | TLC eco | ||
| Rimadyl (קרפרופן) | Zoetis | 6100701 | הזרקה 50 מ"ג/מ"ל |
| מכונת הנשמה מכרסמים | קנט סיינטיפיק | מכרסם ג'וניור | |
| בקר טמפרטורה | Physitemp | TCAT-2DF | |
| וופורייזר משולש ושיכוך כאבים | CVS | NDC 59770-823-56 | |
| וופורייזר | RWD | R583S |
מקורות
- Tsao, C. W., et al. Heart disease and stroke statistics-2022 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 145 (8), e153(2022).
- Nogueira, R. G., et al. Thrombectomy 6 to 24 hours after stroke with a mismatch between deficit and infarct. The New England Journal of Medicine. 378 (1), 11-21 (2018).
- Fisher, M., Savitz, S. I. Pharmacological brain cytoprotection in acute ischaemic stroke-renewed hope in the reperfusion era. Nature Reviews Neurology. 18 (4), 193-202 (2022).
- Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).
- Knauss, S., et al. A semiquantitative non-invasive measurement of PcomA patency in C57BL/6 mice explains variance in ischemic brain damage in filament MCAo. Frontiers in Neuroscience. 14, 576741(2020).
- Yang, Z., et al. Post-ischemia common carotid artery occlusion worsens memory loss, but not sensorimotor deficits, in long-term survived stroke mice. Brain Research Bulletin. 183, 153-161 (2022).
- Wang, Z., et al. Increasing O-GlcNAcylation is neuroprotective in young and aged brains after ischemic stroke. Experimental Neurology. 339, 113646(2021).
- Jiang, M., et al. XBP1 (X-box-binding protein-1)-dependent O-GlcNAcylation Is neuroprotective in ischemic stroke in young mice and its impairment in aged mice is rescued by thiamet-G. Stroke. 48 (6), 1646-1654 (2017).
- Li, X., et al. Single-cell transcriptomic analysis of the immune cell landscape in the aged mouse brain after ischemic stroke. Journal of Neuroinflammation. 19 (1), 83(2022).
- Li, X., et al. Beneficial effects of neuronal ATF6 activation in permanent ischemic stroke. Frontiers in Cellular Neuroscience. 16, 1016391(2022).
- Tamura, A., Graham, D. I., McCulloch, J., Teasdale, G. M. Focal cerebral ischaemia in the rat: 2. Regional cerebral blood flow determined by [14C]iodoantipyrine autoradiography following middle cerebral artery occlusion. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 1 (1), 61-69 (1981).
- Tamura, A., Graham, D. I., McCulloch, J., Teasdale, G. M. Focal cerebral ischaemia in the rat: 1. Description of technique and early neuropathological consequences following middle cerebral artery occlusion. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 1 (1), 53-60 (1981).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
