יצירת פודוציטים שמקורם במטופל מביופסיות עור

פודוציטים הם תאי אפיתל כליות מיוחדים, פוסט-מיטוטיים, היוצרים את מחסום הסינון הגלומרולרי של הכליה יחד עם קרום המרתף הגלומרולרי (GBM), תאי אנדותל גלומרולריים וגליקוקליקס. באופן פנוטיפי, פודוציטים מורכבים מגוף תא ושלוחות קרום ראשוניות מונעות מיקרוטובול, כמו גם שלוחות משניות הנקראות תהליכי כף רגל ^1,2. מחסום הסינון הגלומרולרי המסנן שתן מהדם בנוי מאנדותל פנסטרציה, GBM, וסוג מיוחד של צומת בין-תאי המחבר בין תהליכים רגליים פודוציטים שכנים, הנקרא דיאפרגמת החריץ של פודוקטיאס³. בתנאים בריאים, חלבונים גדולים יותר מאלבומין נשמרים ממחסום הסינון בשל גודלם ומטענם⁴.

מוטציות בגנים ספציפיים לשלד או פודוציטים, כמו גם גורמים במחזור הדם המשפיעים על מסלולי איתות פודוציטים, ידועים כגורמים להתפוגגות פודוציטים, ניתוק או אפופטוזיס, וכתוצאה מכך פרוטאינוריה וטרשת גלומרולרית. בפרט, סידור מחדש של שלד ציטוס, שינויים בקוטביות פודוציטים או נזק של תהליכים ברגל עם אובדן הקשור של צמתים חריצים הם מרכזיים⁵. בשל מעמדם המובחן הסופני, פודוציטים בקושי ניתן להחליף לאחר ניתוק של GBM. עם זאת, אם פודוציטים מחוברים לגליובלסטומה, הם עדיין יכולים להתאושש מהתפוגגות ולתקן תהליכי רגל בין-ספרתיים ^6,7,8. הבנה נוספת של האירועים המובילים לנזקי פודוציטים בהפרעות גלומרולריות שונות עשויה לספק מטרות טיפוליות חדשות שיסייעו בפיתוח טיפולים למחלות אלה. נזק לפודוציטים הוא סימן היכר של מחלות גלומרולריות שונות, כולל גלומרולוסקלרוזיס סגמנטאלי מוקדי (FSGS), נפרופתיה סוכרתית, מחלת שינוי מינימלי וגלומרולונפרופתיה קרומית, הדורשת מודלים אמינים של פודוציטים ex vivo כדי לחקור את המנגנונים הפתולוגיים וגישות הטיפול האפשריות במחלות אלה ^9,10. פודוציטים ניתן לחקור ex vivo על ידי תרבית תאים ראשונית קלאסית המבוססת על בידוד של glomeruli על ידי מסננת דיפרנציאלית¹¹. עם זאת, בשל המצב הממוין הסופני עם יכולת התפשטות מוגבלת, רוב החוקרים משתמשים בקווי תאי ציפודוציטים עכבריים או אנושיים המבטאים גרסאות רגישות לטמפרטורה של אנטיגן T גדול SV40. לחלופין, ciPodocytes מבודדים מעכברים טרנסגניים הנושאים את הגן SV40 Tag immortalizing gene ^1,12.

CiPodocytes להתרבות ב 33 ° C, אבל להיכנס לעצור צמיחה ולהתחיל להתמיין ב 37 ° C^13,14. יש לזכור כי נתונים ניסיוניים המתקבלים עם תאים אלה יש לפרש בזהירות מסוימת, כמו התאים נוצרים באמצעות החדרת גן לא טבעי¹⁵. מכיוון שלתאים אלה יש גן בן אלמוות, הפיזיולוגיה התאית משתנה בגלל התרבות מתמשכת¹². קווי תאי פודוציטים שנוצרו על ידי גישה זו נחקרו לאחרונה, שכן ציפודוציטים של עכברים, בני אדם וחולדות מבטאים פחות מ-5% מהסינפטודין והנפרין ברמת החלבון, כמו גם NPHS1 ו-NPHS2 ברמת ה-mRNA בהשוואה לביטוי גלומרולרי¹⁶. יתר על כן, רוב קווי תאי פודוציטים אינם מבטאים נפרין^17,18. Chittiprol et al. תיארו גם הבדל משמעותי בתנועתיות התאים ובתגובות לפורומיצין ודוקסורוביצין בציפודוציטים¹⁶. פודוציטים ניתן למצוא בשתן לאחר ניתוק מהגליובלסטומה במחלות גלומרולריות שונות 19,20,21,22. פודוציטים ברי קיימא בשתן ניתן לטפח ex vivo עד 2-3 שבועות, אבל רוב התאים עוברים אפופטוזיס^23,24. באופן מעניין, פודוציטים נמצאים לא רק בשתן של חולים עם מחלה גלומרולרית אלא גם בשתן של נבדקים בריאים, ככל הנראה כאשר הם מזדקנים שוב עם פוטנציאל מוגבל של שכפול בתרבית²⁴. יתר על כן, מספר הפודוציטים שמקורם בשתן מוגבל, והתאים מתמיינים בתרבית, מראים פחות תהליכים ברגל, משנים מורפולוגיה, והכי חשוב יש להם יכולת התפשטות מוגבלת. הביטוי של גנים ספציפיים לפודוציטים נעדר, נעלם תוך מספר שבועות, או משתנה בין שיבוטים אלה של תאים. חלק מהתאים החיוביים לסמן הספציפי לפודוציטים ביטאו יחד את הסמן של תאי אפיתל צינוריים או מיופיברובלסטים ותאים מזנגיאליים, מה שמרמז על דה-דיפרנציאציה ו/או התמיינות של פודוציטים בתרבית בשתן^24,25.

לאחרונה, הדור של שורות תאי ciPodocyte שמקורם בשתן של חולים ומתנדבים בריאים על ידי התמרה עם אנטיגן SV40 גדול T רגיש לחום ו- hTERT תואר²⁶. זוהה ביטוי mRNA עבור סינפטודין, נסטין וחלבון הקשור ל-CD2, אך פודוצין mRNA נעדר בכל השיבוטים. בנוסף לבעיות עם פודוציטים בשתן, תאים אלה מכילים גם את הגן אימורטליזציה החדר, וכתוצאה מכך את החסרונות שנדונו לעיל.

לעומת זאת, לתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (hiPSCs) יש יכולת עצומה לחדש את עצמם ולהתמיין למספר סוגי תאים בתנאים מתאימים. הוכח בעבר כי hiPSCs יכולים לשמש כמקור כמעט בלתי מוגבל של פודוציטים^27,28.

כאן, מתואר פרוטוקול דו-שלבי ליצירת פודוציטים ספציפיים למטופל מפיברובלסטים עוריים של ביופסיות ניקוב עור, עם תכנות אפיזומלי מחדש לאחר מכן ל-hiPSCs והתמיינות סופית לפודוציטים שמקורם ב-hiPSC (איור 1).

איור 1: פרוטוקול ליצירת פודוציטים שמקורם ב-hiPSC ספציפיים למטופל. סקירה גרפית של הפרוטוקול ליצירת פודוציטים ספציפיים למטופל מפיברובלסטים עוריים של ביופסיית עור על ידי תכנות מחדש ל- hiPSCs והתמיינות לפודוציטים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

כצעד ראשון, פיברובלסטים עוריים סומטיים גדלו מביופסיה של ניקוב העור ותוכנתו מחדש ל-hiPSCs בשיטה נטולת אינטגרציה על ידי אלקטרופורציה עם פלסמידים המבטאים את גורמי השעתוק OCT3/4, KLF4, SOX2 ו-c-MYC 29,30,31. מושבות hiPSC שקמו נבחרו לאחר מכן והורחבו. ההתמיינות החלה עם השראת השושלת המזודרמלית על ידי הפעלת מסלול האיתות WNT, ואחריה יצירת תאי אב של נפרון שעדיין היו מסוגלים להתרבות. לבסוף, התאים התמינו לפודוציטים. בהליך זה, שינינו ושילבנו פרוטוקולים שפורסמו בעבר לתכנות מחדש אפיזומלי ליצירת hiPSCs על ידי Bang et al.32 ו- Okita et al.33, כמו גם פרוטוקול להבחנה של hiPSCs לפודוציטים על ידי Musah et al.28,34,35.

ואכן, לפודוציטים שנוצרו על ידי הפרוטוקול שלנו היה פנוטיפ קרוב יותר לפודוציטים in vivo, לגבי התפתחות רשת מובחנת של תהליכים ראשוניים ומשניים ברגל וביטוי של סמנים ספציפיים לפודוציטים, כמו סינפטודין, פודוצין ונפרין. עם השימוש בפודוציטים שמקורם ב- hiPSC, הרקע הגנטי של המטופל נשמר במהלך תכנות מחדש והתמיינות. זה מאפשר מידול מחלת פודוציטים ספציפית למטופל וגילוי של חומרים טיפוליים פוטנציאליים ex vivo במספר תאים כמעט בלתי מוגבל. יתר על כן, פרוטוקול זה הוא זעיר פולשני, חסכוני, מקובל מבחינה אתית ועשוי להקל על אפיקים חדשים לפיתוח תרופות.

הפרוטוקול אושר על ידי ועדת האתיקה של אוניברסיטת פרידריך-אלכסנדר ארלנגן-נירנברג (251_18B), וכל המטופלים והנבדקים נתנו הסכמה בכתב. כל הניסויים בוצעו בהתאם להנחיות ולתקנות הרלוונטיות. להרכב כל המדיות והפתרונות המשמשים כאן ראו טבלה 1.

1. צמיחה של פיברובלסטים עוריים מביופסיה של ניקוב העור

1. מעבירים את ביופסיית ניקוב העור לצינור חרוטי סטרילי של 15 מ"ל עם 10 מ"ל של תווך פיברובלסט שחומם מראש.
2. הסר את המדיום ושטוף את ביופסיית ניקוב העור שלוש פעמים עם 5 מ"ל של מלח סטרילי, שחומם מראש 1x פוספט חוצץ (PBS). מעבירים את ביופסיית ניקוב העור במלקחיים סטריליים לצלחת תרבית תאים בקוטר 10 ס"מ וחותכים אותה לרוחב לשלוש או ארבע חתיכות בעזרת אזמל סטרילי, ומשאירים את האפידרמיס והדרמיס.
3. מעבירים כל חתיכה לצלחת סטרילית של תרבית תאי פלסטיק בקוטר 35 מ"מ ולוחצים אותה בעדינות לצלחת התרבית. הסר את עודפי המדיום סביב חתיכות הביופסיה. מניחים להתייבש 5-10 דקות עד שהנוזל מתאדה והביופסיה מחוברת לפלסטיק של תרבית התא.
4. יש להוסיף 1 מ"ל של פיברובלסט בינוני עם פיפטה של 1,000 מיקרוליטר סביב הביופסיה ולמלא בזהירות עד לנפח סופי של 3 מ"ל. לטפח ב 37 ° C, 5% CO₂ במשך 7 ימים ללא האכלה ולהזיז את המנה. החליפו בזהירות את המדיום למדיום פיברובלסט טרי שחומם מראש. לאחר 7 ימים, ניתן לעקוב אחר פיברובלסטים דמויי ציר שגדלו סביב ביופסיית העור באמצעות מיקרוסקופ ניגודיות פאזה³⁶.
   הערה: כאשר פיברובלסטים שגדלו מגיעים לשפת המנה, המשך שוב משלב 1.3 כדי ליצור קבוצה נוספת של פיברובלסטים.
5. להרחבת הפיברובלסטים שגדלו, יש לשטוף עם 2 מ"ל של PBS 1x שחומם מראש, לנתק את הפיברובלסטים עם 1 מ"ל של 1x חומצה טריפסין-אתילאנדיאמיןטטראצטית (EDTA) ולדגור במשך 5 דקות ב 37 ° C, 5% CO₂. מעבירים את התאים המנותקים לצינור חרוטי של 15 מ"ל ושוטפים את צלחת תרבית התאים עם 2 מ"ל של מדיום פיברובלסט טרי שחומם מראש.
6. אגרו את מצע הכביסה בצינור כדי לנטרל את חומר הדיסוציאציה והצנטריפוגה ב 200 x גרם למשך 5 דקות ב 20 ° C. שאפו את הסופרנאטנט והשעו מחדש את גלולת התא עם 1 מ"ל של מדיום פיברובלסט טרי שחומם מראש. ספרו את התאים עם תא נויבאואר או מונה תאים אוטומטי באמצעות טריפאן כחול וזרעים 2.5 x 10 3 עד 5 x 10³ פיברובלסטים לס"מ² בצלוחיות תרבית תאים טריות.
7. מחזירים את הצלוחיות לאינקובטור ומפזרות את התאים באופן שווה על ידי הזזת הצלוחיות שלוש פעמים לכל כיוון. למחרת, החליפו את המדיום במדיום פיברובלסט טרי שחומם מראש. החליפו את המדיום פעמיים בשבוע והתפצלו כאשר הפיברובלסטים מגיעים לכ-80% מפגש.

2. הקפאת פיברובלסטים עוריים

1. כדי להקפיא את fibroblasts, לשטוף אותם עם 5 מ"ל של שחומם מראש 1x PBS. שאפו את PBS ונתקו את הפיברובלסטים עם 4 מ"ל של טריפסין-EDTA 1x. מחזירים את הבקבוק לאינקובטור ודגרים במשך 5-7 דקות בטמפרטורה של 37°C ב-5% CO₂. נטרו את הניתוק באמצעות מיקרוסקופ ניגודיות פאזה וטפחו על צד הבקבוק כדי לנתק את התאים.
2. מעבירים את התאים המנותקים לצינור חרוטי של 15 מ"ל. לשטוף את בקבוק תרבית התא עם 5 מ"ל של מדיום פיברובלסט טרי, שחומם מראש. אגרו את מצע הכביסה בצינור החרוטי ובצנטריפוגה ב 200 x גרם למשך 5 דקות ב 20 °C.
3. שאפו את הסופרנאטנט והשהו מחדש את גלולת התא עם 2 מ"ל של תווך פיברובלסט טרי שחומם מראש. ספרו את התאים והעבירו 1 x 10⁶ תאים לצינור חרוטי חדש. צנטריפוגה ב 200 x גרם במשך 5 דקות ב 20 ° C.
4. שאפו את הסופרנאטנט והשעו מחדש את גלולת התא עם 1 מ"ל של מדיום הקפאה פיברובלסט קר המורכב מ-90% נסיוב עגל עוברי ו-10% דימתיל סולפוקסיד (DMSO). מעבירים לקריביאל, מניחים במיכל הקפאה ומקפיאים למשך הלילה בטמפרטורה של -80°C. לאחסון לטווח ארוך, הניחו את הקריוביאל במיכל חנקן נוזלי למחרת.

3. תכנות מחדש אפיזומלי של פיברובלסטים ליצירת hiPSCs

1. לתכנות מחדש אפיזומלי, השתמש 1.5 x 10⁶ פיברובלסטים ממעבר 4 עד 8. כדי להגיע למספר תא זה, השתמש בשתיים עד שלוש צלוחיות של 250 מ"ל עם מפגש של כ -70%.
2. יום לפני תכנות מחדש, לפצל את הפיברובלסטים ביחס של 1:2 כדי להבטיח את מצב ההתרבות שלהם. לכן, לשאוף את המדיום ולשטוף את צלוחיות עם 5 מ"ל של שחומם מראש 1x PBS לכל בקבוק. שאפו את PBS ונתקו את הפיברובלסטים עם 4 מ"ל של טריפסין-EDTA 1x. מחזירים את הצלוחיות לאינקובטור ודגרים למשך 5-7 דקות בטמפרטורה של 37°C ו-5% CO₂. נטרו את הניתוק באמצעות מיקרוסקופ ניגודיות פאזה וטפחו על צד הבקבוק כדי לנתק את התאים משטח הפלסטיק.
3. מעבירים את התאים המנותקים לצינור חרוטי של 50 מ"ל ושוטפים את צלוחיות תרבית התאים עם 5 מ"ל של תווך פיברובלסט טרי שחומם מראש. אגרו את מצע הכביסה בצינור החרוטי ובצנטריפוגה ב 200 x גרם למשך 5 דקות ב 20 °C. שאפו את הסופרנאטנט והשהו מחדש את גלולת התא ב-6 מ"ל של תווך פיברובלסט טרי שחומם מראש.
4. הכינו שש צלוחיות חדשות של תרביות תאים על ידי הוספת 5 מ"ל של תווך פיברובלסט טרי שחומם מראש לכל בקבוק. הוסף 1 מ"ל של תרחיף תאי פיברובלסט לכל בקבוק. מחזירים את הצלוחיות לאינקובטור ומפזרות את התאים באופן שווה על ידי הזזת הצלוחיות שלוש פעמים לכל כיוון.
5. לתכנות מחדש אפיזומלי, צפו שתי צלחות תרבית תאים בקוטר 10 ס"מ המתאימות לתרבית hiPSC בתמיסת ציפוי קר בקוטר 4 מ"ל לכל צלחת. לדגור את הצלחות במשך 1 שעה ב 37 ° C.
   הערה: לתרבית hiPSCs נדרשים פלסטיק שונה של תרביות תאים וציפוי מטריצה חוץ-תאי נוסף (ראה טבלת חומרים).
6. הסר את המדיה מהפיברובלסטים ושטוף עם 10 מ"ל של 1x PBS שחומם מראש לכל בקבוק. לשאוף את PBS ולנתק את הפיברובלסטים עם 4 מ"ל של 1x טריפסין-EDTA לכל בקבוק על ידי דגירה במשך 5-7 דקות ב 37 ° C. עקוב אחר הניתוק באמצעות מיקרוסקופ ניגודיות פאזה, ובמידת הצורך, הקש על צד הבקבוק כדי לנתק את התאים מפני השטח הפלסטיים.
7. מעבירים את התאים המנותקים לצינור חרוטי של 50 מ"ל. לשטוף את צלוחיות ריקות עם 6 מ"ל של מדיום פיברובלסט שחומם מראש כדי לאסוף את התאים הנותרים ובריכה בצינור החרוט. צנטריפוגה ב 200 x גרם במשך 5 דקות ב 20 ° C. שאפו את הסופרנאטנט והשהו מחדש את כדורית התא ב-3 מ"ל של PBS 1x טרי שחומם מראש.
8. לספור את התאים ולהעביר 1.5 x 10⁶ פיברובלסטים בצינור חרוטי חדש. צנטריפוגה ב 200 x גרם במשך 5 דקות ב 20 ° C. השליכו את הסופרנאטנט והשהו מחדש את גלולת התא ב-5 מ"ל של מדיום אלקטרופורציה וצנטריפוגה שוב. בינתיים, שאפו את תמיסת הציפוי מלוחות תרבית התאים המצופים בקוטר 10 ס"מ והוסיפו 7 מ"ל של מדיום פיברובלסט שחומם מראש.
9. לאחר הצנטריפוגה, יש להשליך את הסופרנאטנט ולהשהות מחדש את כדורית התא בתווך אלקטרופורציה בריכוז של 1.5 x 10⁶ תאים ב-250 מיקרוליטר. מעבירים את תרחיף התא 250 μL לקובט אלקטרופורציה עם מרחק רווח של 4 מ"מ (ראה טבלת חומרים).
10. הכינו תערובת טרנספקציה פלסמיד על ידי הוספת 4 מיקרוגרם מכל פלסמיד (pCXLE-hOCT3/4, pCXLE-hSK, pCXLE-hMLN) לנפח כולל של 50 מיקרוליטר של מדיום אלקטרופורציה. מעבירים לקובט ומערבבים בעדינות. אלקטרופורטים בפעימה אחת ב 280 V.
11. חותכים קצה פיפטה באמצעות מספריים סטריליים ומעבירים 125 מיקרוליטר של הפיברובלסטים המחושמלים לכל אחת מלוחות תרבית התאים המוכנים בקוטר 10 ס"מ. מפזרים את התאים על ידי התסיסה של הצלחות שלוש פעמים לכל הכיוונים ומחזירים אותם לאינקובטור. יש לדגור למשך הלילה ב-37°C עם 5%_CO2 ללא הפרעה.
12. כדי להסיר תאים מתים, להחליף את המדיום למחרת עם 7 מ"ל של תווך פיברובלסט טרי שחומם מראש. שנה את המדיום למדיום תרבית hiPSC יומיים לאחר אלקטרופורציה והחלף אותו כל יומיים במשך 20 הימים הבאים.

4. בחירה, הרחבה ובקרת איכות של hiPSCs שנוצרו

1. עקוב אחר התאים מדי יום במשך 20 יום לפחות באמצעות מיקרוסקופ ניגודיות פאזה עם מטרה של 10x או 20x כדי לצפות בהיווצרות מושבות hiPSC לאחר התחשמלות. אם קוטרן של מושבות hiPSC הוא כ-300 מיקרומטר עם גבולות ברורים, ומושבות hiPSC מראות יחס גרעינים-גוף גבוה, מושבות hiPSC מוכנות לבחירה על-ידי קטיף (איור 2B,C ואיור 3).
2. לפני הקטיף, מצפים צלחת 96 בארות המתאימה לתרבית hiPSC עם 100 μL של תמיסת ציפוי לכל באר ודגרים במשך שעה אחת ב 37 ° C. במהלך הדגירה, לסמן מושבות של עניין בתחתית צלחת תרבית התא עם עט. להכנה סופית של צלחת 96 בארות, הסר את תמיסת הציפוי והוסף 100 μL של מדיום תרבית hiPSC שחומם מראש המכיל 10 μM מעכב ROCK Y27632 לכל באר.
3. שטפו את התאים עם 1x PBS שחומם מראש והוסיפו מדיום תרבית hiPSC טרי שחומם מראש המכיל מעכב ROCK 10 μM Y27632 לפני הקטיף כדי להסיר תאים מתים. כדי לבחור מושבות hiPSC, השתמש במחט מד וחלק את מושבות hiPSC לחתיכות קטנות על ידי ציור רשת לכל מושבה.
4. באמצעות מיקרוסקופ ניגודיות פאזה, לבדוק כי המושבות מחולקות בהצלחה לחתיכות. מעבירים אותם עם פיפטה של 100 μL לצלחת המוכנה של 96 בארות. החזיקו את הפיפטה זקופה מעל המושבה מבלי לגעת בתאים כדי למנוע שריטות ואובדן של המושבה.
5. הניחו את צלחת 96 הקידוחים באינקובטור בטמפרטורה של 37°C עם 5%_CO2 ותנו לתאים להתחבר למשך הלילה ללא הפרעה. שמרו את הכלים עם תערובת פיברובלסט ו-hiPSC, למקרה שהקטיף לא יצליח. לכן, הסר מעכב ROCK Y27632 על ידי שינוי המדיום למדיום תרבית hiPSC והחזיר את הלוחות לאינקובטור.
6. למחרת, החליפו את המדיום של צלחת 96 הקידוחים ל-200 מיקרוליטר של מדיום תרבית hiPSC טרי והחליפו אותו כל יומיים. עקוב אחר צלחת 96 בארות למחרת וסמן את הבארות עם שיבוטים שנבחרו בהצלחה.
   הערה: אם שיבוטים hiPSC שנבחרו לא נבחרו במלואם לאחר הניסיון הראשון וניתן למצוא את הפיברובלסטים בבאר, חזור על קטיף מבאר 96 או גרד את הפיברובלסטים מהצלחת.

5. הרחבה של שיבוטים נבחרים של hiPSC

1. עקוב אחר שיבוטי hiPSC באמצעות מיקרוסקופ ניגודיות פאזה. אם ה-hiPSCs שנבחרו מגיעים למפגש של כ-70%, שיבוטי hiPSC מוכנים להרחבה.
2. מצפים צלחת 48 בארות המתאימה לתרבית hiPSC עם 250 μL של תמיסת ציפוי לכל באר למשך שעה אחת ב 37 ° C. החליפו את תמיסת הציפוי ב-200 μL של תרבית hiPSC טרייה שחוממה מראש ומכילה מעכב ROCK 10 μM Y27632.
3. כדי לנתק את ה-hiPSCs מהצלחת בעלת 96 הקידוחים, גרדו את משטח הפלסטיק עם קצה פיפטה של 1,000 μL. מעבירים את ה-hiPSCs המנותקים מהצלחת בעלת 96 הקידוחים לצלחת בעלת 48 בארות. החליפו את המדיום למחרת למדיום תרבית hiPSC טרי שחומם מראש כדי להסיר תאים מתים ואת מעכב ROCK Y27632.
4. אם שיבוטי hiPSC מגיעים למפגש של כ-70%, העבירו את ה-hiPSCs לצלחת של 24 בארות. לכן, מצפים צלחת 24 באר המתאימה לתרבית hiPSC עם 400 μL של תמיסת ציפוי לכל באר למשך שעה אחת ב 37 ° C. החליפו את תמיסת הציפוי ב-400 μL של תרבית hiPSC טרייה שחוממה מראש ומכילה מעכב ROCK 10 μM Y27632. שאפו את המדיום מ-48 הבארות ושטפו עם 500 מיקרוליטר של PBS 1x שחומם מראש.
5. החלף את PBS ב- 100 μL של תמיסת ניתוק תאים אנזימטית המכילה מעכב ROCK 10 μM Y27632 ודגור ב- 37 ° C למשך 4 דקות. שטפו את ה-hiPSCs מהצלחת באמצעות פיפטה של 1,000 μL. מעבירים את התאים המנותקים לצינור חרוטי של 15 מ"ל. שטפו את הצלחת הריקה בת 48 הבארות במדיום תרבית hiPSC המכיל מעכב סלע 10 מיקרומטר Y27632 ואגרו בצינור החרוט.
6. צנטריפוגה ב 200 x גרם במשך 5 דקות ב 20 ° C. שאפו את הסופרנאטנט והשעו מחדש את hiPSCs ב-1 מ"ל של מדיום תרבית hiPSC המכיל מעכב ROCK 10 מיקרומטר Y27632 והעבירו לצלחת של 24 בארות. מניחים את הצלחת באינקובטור ב 37 ° C ב 5% CO₂ ולהפיץ את התאים על ידי תסיסה הצלחת שלוש פעמים לכל הכיוונים. תנו לתאים להתחבר למשך הלילה ללא הפרעה.
7. למחרת, החליפו את המדיום למדיום תרבית hiPSC ללא מעכב ROCK Y27632.
   הערה: אם שיבוטים של hiPSC מגיעים למפגש של כ-70%, העבר את hiPSCs לצלחת של 12 בארות על ידי חזרה על שלבים 5.4 עד 5.7 עם נפחים מוגדלים המתאימים לפורמט של 12 בארות. אם hiPSCs מצלחת 12 בארות להגיע סביב 70% מפגש, להעביר את שיבוטים hiPSC צלחת 6 בארות עם נפחים מוגדלים עבור פורמט 6 בארות.

6. הקפאה של שיבוטים נבחרים של hiPSC

1. כדי להקפיא שיבוטים נבחרים של hiPSC, שאפו את המדיום מצלחת של 6 בארות. לשטוף את הבארות עם 2 מ"ל של 1x PBS. לשאוף ולנתק את hiPSCs עם 1 מ"ל של תמיסת ניתוק תאים אנזימטית המכילה 10 מיקרומטר Y27632. מחזירים את הצלחת לאינקובטור ודגרים במשך 4 דקות בטמפרטורה של 37°C ו-5% CO₂.
2. שטפו את תאי הגזע הגזעיים העמוקים מהצלחת באמצעות פיפטה של 1,000 מיקרוליטר והעבירו את התאים המנותקים לצינורית חרוטית של 15 מ"ל. שטפו את הצלחת עם 2 מ"ל של מדיום תרבית hiPSC טרי שחומם מראש המכיל 10 μM ROCK inhibitor Y27632. בריכה בצינור החרוטי ובצנטריפוגה ב 200 x גרם במשך 5 דקות ב 20 ° C. שאפו את הסופרנאטנט והשעו מחדש את גלולת התא עם 2 מ"ל של תרבית hiPSC טרייה שחוממה מראש המכילה מעכב ROCK 10 מיקרומטר Y27632.
3. ספרו את התאים והעבירו 1 x 10⁶ תאים לצינור חרוטי חדש. צנטריפוגה ב 200 x גרם במשך 5 דקות ב 20 ° C. שאפו את הסופרנטנט, השהו מחדש את גלולת התא ב-1 מ"ל של תווך הקפאה hiPSC קר ללא סרום, והקפיאו בהקפאה באמצעות מיכל הקפאה למשך הלילה בטמפרטורה של -80°C. לאחסון לטווח ארוך, הניחו את הקריוביאל במיכל חנקן נוזלי למחרת.

7. בקרת איכות HiPSC

1. אפיון מורפולוגיית hiPSC
   1. בדוק את המורפולוגיה hiPSC האופיינית באמצעות מיקרוסקופ ניגודיות פאזה עם מטרה של 20x. לאחר תכנות מחדש, המורפולוגיה של התא משתנה מפיברובלסטים ארוכים דמויי ציר ל-hiPSCs קטנים ועגולים, ומציגים יחס גרעינים-לגוף גבוה שגדל במושבות עם גבולות ברורים (איור 2C).
   2. אם מושבות hiPSC גדלות צפופות מדי ומתרחשת התמיינות ספונטנית, גרדו את החלקים המובחנים מהצלחת באמצעות קצה פיפטה (איור 3). מכיוון של-hiPSCs יש קצב התפשטות גבוה, יש להאכיל את תרביות hiPSC מדי יום במדיום הזנה hiPSC טרי ומחומם מראש.
2. אפיון סמני פלוריפוטנציה על ידי צביעת אימונופלואורסנציה
   1. כדי לבדוק את hiPSCs שנוצרו עבור סמן pluripotency באמצעות צביעה immunofluorescence, מניחים את כיסויי הפלסטיק בצלחת 24 בארות וציפוי עם 250 μL של תמיסת ציפוי למשך שעה אחת ב 37 ° C ו 5% CO₂. החלף את תמיסת הציפוי ב- 1 מ"ל של מדיום תרבית hiPSC שחומם מראש המכיל מעכב ROCK 10 μM Y27632.
   2. זרע 1.9 x 10⁴ hiPSCs מנותקים לכל 24-באר. יש לחבר את ה-hiPSCs למשך הלילה בטמפרטורה של 37°C ו-5% CO₂ ללא הפרעה. ראה שלבים 5.4 עד 5.6 עבור דיסוציאציה של hiPSCs. החלף את המדיום למחרת במדיום תרבית hiPSC ללא מעכב ROCK Y27632.
   3. עבור צביעה, לשטוף את התאים עם 1 מ"ל של 1x PBS שחומם מראש ולאחר מכן לתקן hiPSCs עם 4% paraformaldehyde במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. שטפו את ה-hiPSCs הקבועים עם 1x PBS וחסמו אתרי קשירה לא ספציפיים עם 200 μL של תמיסת קדם-דגירה לכל באר למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. נוגדנים ראשוניים מדוללים Ki67 (1:300), OCT3/4 (1:200), SSEA4 (1:100) בדילול נוגדנים.
   4. נקו רדיד פלסטיק עם 70% אתנול והניחו אותו בתא צביעה מלא במיכל מים. מניחים טיפות של 30 μL דילול נוגדנים ראשוני על נייר כסף. מניחים את הדגימות הקבועות הפוכות בדילול ודגרים למשך הלילה ב 4 מעלות צלזיוס.
   5. למחרת, שטפו את הדגימות שלוש פעמים עם PBS 1x למשך 5 דקות והניחו 30 μL טיפות של דילול נוגדנים משני (1:1,000) על נקודות נקיות על נייר הכסף. הניחו את הכיסוי במגלשה הפוכה בדילול. יש לדגור במשך שעה בטמפרטורת החדר בחושך.
   6. לאחר הדגירה, יש לשטוף שלוש פעמים עם 1x PBS למשך 5 דקות. הרכיבו את הדגימות על שקופיות זכוכית באמצעי ההרכבה המכיל DAPI. הניחו להתייבש במשך הלילה בטמפרטורת החדר ובחושך ודמיינו את הדגימות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי (איור 4).
3. הרחקת חיידקים וזיהום מיקופלסמה
   1. כדי למנוע זיהום חיידקים, העבר 500 μL של hiPSCs מנותקים ל -5 מ"ל של תווך לוריא-ברטאני (LB) שחומם מראש. ראה שלבים 5.4 עד 5.6 עבור דיסוציאציה של hiPSCs. לדגור לילה ב 37 °C (77 °F). אם מדיום LB נראה עכור, זיהום חיידקים התרחש ככל הנראה. השליכו את התאים.
   2. כדי למנוע זיהום מיקופלסמה, לאסוף מדיום שלא הוחלף במשך יומיים מ 6 בארות עם סביב 90% hiPSCs confluent. השתמש בתגובת שרשרת פולימראז כמותית (qPCR) כדי לזהות זיהום מיקופלסמה. ערכות זיהוי מיקופלסמה מסחריות רבות זמינות למטרה זו.

8. הבחנה של hiPSCs לתוך פודוציטים

1. הכנה ואחסון של גורמי גדילה
   1. כדי להכין ריכוז מלאי של 10 mM Y27632, יש ליצור מחדש 10 מ"ג של Y27632 (משקל מולקולרי של 320.26 גרם/מול) ב-3.12 מ"ל מים סטריליים. אחסנו 100 μL aliquots בטמפרטורה של -20°C ודללו 1:1,000 בתווך תרבית תאים כדי להגיע לריכוז סופי של 10 מיקרומטר.
   2. כדי להכין ריכוז מלאי של 30 mM CHIR99021, יש ליצור מחדש 5 מ"ג של CHIR99021 (משקל מולקולרי של 465.34 גרם/מול) ב-358.2 מיקרוליטר של DMSO סטרילי. יש לאחסן 50 μL aliquots בטמפרטורה של -20°C ולדלל 1:10,000 בתווך תרבית תאים כדי להגיע לריכוז סופי של 3 מיקרומטר.
   3. כדי להכין ריכוז מלאי של 100 מיקרוגרם / מ"ל activin A, לשחזר 100 מיקרוגרם של activin A ב 1 מ"ל של 1x PBS המכיל 0.1% אלבומין בסרום בקר (BSA). יש לאחסן 100 μL aliquots בטמפרטורה של -20°C ולדלל 1:2,000 בתווך תרבית תאים כדי להגיע לריכוז סופי של 50 ננוגרם/מ"ל.
   4. כדי להכין ריכוז מלאי של 100 מיקרוגרם / מ"ל חלבון מורפוגני עצם 7 (BMP7), לשחזר 100 מיקרוגרם של BMP7 ב 1 מ"ל של מים סטריליים המכילים 0.1% BSA. יש לאחסן 100 μL aliquots בטמפרטורה של -20°C ולדלל 1:2,000 בתווך תרבית תאים כדי להגיע לריכוז סופי של 50 ננוגרם/מ"ל.
   5. כדי להכין ריכוז מלאי של 100 מיקרוגרם / מ"ל גורם גדילה אנדותל כלי דם (VEGF), לשחזר 100 מיקרוגרם של VEGF ב 1 מ"ל של מים סטריליים. יש לאחסן 100 μL aliquots בטמפרטורה של -20°C ולדלל 1:4,000 בתווך תרבית תאים כדי להגיע לריכוז סופי של 25 ננוגרם/מ"ל.
   6. כדי להכין ריכוז מלאי של 10 mM של חומצה רטינואית all-trans, reform 10 mg של all-trans retinoic acid ב 3.33 מ"ל של DMSO סטרילי. יש לאחסן 100 μL aliquots בטמפרטורה של -20°C ולדלל 1:100 בתווך תרבית תאים כדי להגיע לריכוז סופי של 0.5 μM.
2. הפעלת מסלול איתות WNT להשראת שושלת מזודרם
   1. להתמיינות של hiPSCs לפודוציטים שמקורם ב-hiPSC, צלחות תרבית תאי פרווה או צלוחיות המתאימות לתרבית hiPSC עם תמיסת ציפוי למשך שעה אחת ב-37°C ו-5% CO₂. הנפח הכולל של תמיסת ציפוי הוא 1 מ"ל לכל צלחת תרבית 6 בארות או 4 מ"ל לכל צלחת תרבית תאים 10 ס"מ.
   2. שאפו את המדיום ושטפו את hiPSCs עם 1x PBS שחומם מראש. יש לשאוף את PBS ולהוסיף תמיסת ניתוק תאים אנזימטית המכילה 10 מיקרומטר Y27632 בנפח כולל של 1 מ"ל לצלחת תרבית 6 בארות או 4 מ"ל לצלחת תרבית תאים בקוטר 10 ס"מ.
   3. מחזירים את הצלחת לאינקובטור ודגרים במשך 4 דקות בטמפרטורה של 37°C ו-5% CO₂. שטפו את ה-hiPSCs מהצלחת באמצעות פיפטה של 1,000 μL. מעבירים את התאים המנותקים לצינור חרוט.
   4. שטפו את הצלחת בתרבית hiPSC טרייה שחוממה מראש ומכילה מעכב ROCK בגודל 10 מיקרומטר Y27632. אגרו את מדיום הכביסה בצינור החרוטי כדי לנטרל את מגיב הדיסוציאציה. צנטריפוגה ב 200 x גרם במשך 5 דקות ב 20 ° C. שאפו את הסופרנאטנט והשעו מחדש את גלולת התא עם 2 מ"ל של תרבית hiPSC טרייה שחוממה מראש המכילה מעכב ROCK 10 מיקרומטר Y27632.
   5. לספור את התאים ואת הזרע 1 x 10⁴ hiPSCs / ס"מ². פזרו את התאים על ידי תסיסה שלוש פעמים לכל הכיוונים. תן hiPSCs להתחבר במשך הלילה ב 37 ° C עם 5% CO₂ ללא הפרעה.
   6. למחרת, החלף את המדיום ב- 2 מ"ל של מדיום התמיינות מזודרם שחומם מראש המכיל תוספת B27 1x, 1% פניצילין-סטרפטומיצין, 3 מיקרומטר CHIR99021, 50 ng/mL activin A ו- 10 μM ROCK inhibitor Y27632.
3. התמיינות לתאי אב נפרון
   1. לאחר יומיים, שנה את מדיום המזודרם ל -2 מ"ל של מדיום התמיינות אב נפרון שחומם מראש המכיל תוספת B27 1x, 1% פניצילין-סטרפטומיצין, 3 מיקרומטר CHIR99021, 50 ng/mL activin A ו- 50 ng/mL BMP7 לכל צלחת תרבית 6 בארות או 6 מ"ל לכל צלחת תרבית תאים בגודל 10 ס"מ. שנה את המדיום כל יומיים במשך 14 הימים הבאים.
      הערה: תאי אב של נפרון מתרבים וניתן לעבור ולהקפיא אותם לאחר 7 ימים של התמיינות בתווך הרחבת האב של נפרון.
   2. כדי לפצל את תאי האב של נפרון, צפו את הפלסטיק של תרבית התאים המתאים לתרבית hiPSC בתמיסת ציפוי למשך שעה אחת ב-37°C. החלף את תמיסת הציפוי בתווך הרחבת אב נפרון. שאפו את המדיה ושטפו את התאים עם 1x PBS שחומם מראש. הסר את PBS ונתק את התאים עם 1x טריפסין-EDTA.
   3. יש לדגור במשך 5 דקות בטמפרטורה של 37°C ו-5% CO₂. עקוב אחר ניתוק התאים באמצעות מיקרוסקופ ניגודיות פאזה. במידת הצורך, הקש על צד הפלסטיק כדי לנתק את התאים מפני השטח. שוטפים את התאים מהצלחת ומעבירים לצינור חרוט. שטפו את הבקבוק או הצלחת הריקים באותו נפח של מדיום הרחבת אב נפרון שחומם מראש כמו מגיב הדיסוציאציה.
   4. אגרו את אמצעי הכביסה בצינור החרוט. צנטריפוגה ב 200 x גרם במשך 5 דקות ב 20 ° C. שאפו את הסופרנאטנט והשהו מחדש את גלולת התא עם 2 מ"ל של מדיום התפשטות אב נפרון טרי שחומם מראש. ספרו את התאים והזרעים 1.5 x 10⁴ תאי אב נפרון לס"מ² להמשך התמיינות נוספת.
      הערה: כדי להקפיא את תאי האב של נפרון, השהה מחדש 1 x 10⁶ תאים ב 1 מ"ל של מדיום שימור קריוגני ללא סרום קר והעבר לקריוביאל. יש להקפיא במיכל הקפאה בטמפרטורה של -80°C למשך הלילה ולהעביר למיכל חנקן נוזלי לאחסון לטווח ארוך.
   5. מחזירים את הצלחות לאינקובטור ומפזרות את התאים באופן שווה על ידי תסיסה שלוש פעמים לכל הכיוונים. שנה את המדיום למחרת למדיום התמיינות אב נפרון טרי שחומם מראש. החלף את המדיום כל יומיים עד שהתאים מתמיינים במשך 14 יום בתווך התמיינות אב נפרון.
4. התמיינות טרמינלית לפודוציטים שמקורם ב-hiPSC
   1. יש לשאוף את המדיום ולהוסיף 2 מ"ל של מדיום התמיינות פודוציטים שחומם מראש המכיל תוספת B27 1x, 1% פניצילין-סטרפטומיצין, 3 מיקרומטר CHIR99021, 50 ng/mL activin A, 50 ng/mL BMP7, 25 ng/μL VEGF ו-0.5 μM all-trans retinoic acid לכל צלחת תרבית 6 בארות או 6 מ"ל לכל צלחת תרבית תאים בקוטר 10 ס"מ. החזירו את הצלחות לאינקובטור בטמפרטורה של 37°C ו-5% CO₂. שנה את המדיום כל יומיים במשך 4 ימים עם מדיום התמיינות פודוציטים טרי שחומם מראש.
   2. כדי לשמור על hiPSC-podocytes בתרבית לאחר התמיינות, להאכיל את התאים פעמיים בשבוע עם מדיום תחזוקת פודוציטים המכיל 10% סרום עגל עובר, 1% פניצילין-סטרפטומיצין, ו 0.1% אינסולין-transferrin-סלניום.
      הערה: פודוציטים מסוג hiPSC-podocytes מובחנים טרמינליים אינם מתרבים עוד. עם זאת, ניתן לשמור אותם בתרבית תאים עד 4 שבועות.
5. הפשרה והרחבה של תאי אב קפאו של נפרון קפוא
   1. צפו בקבוק פלסטיק חדש בתרבית תאים המתאים לתרבית hiPSC בתמיסת ציפוי למשך שעה אחת ב-37°C ו-5% CO₂. החלף את פתרון הציפוי עם 5 מ"ל של מדיום הרחבת אב נפרון.
   2. הכן צינור חרוטי 15 מ"ל עם 7 מ"ל של מדיום הרחבת אב נפרון שחומם מראש. הפשירו את התאים הקפואים בטמפרטורה של 37°C באמבט מים ללא תזוזה במשך כ-20 שניות. הוציאו את הקריוויאל מאמבט המים כאשר מחצית התאים מופשרים, ונשאר קרח.
   3. רססו את הקריוביאל באתנול 70% והכניסו לארון בטיחות ביולוגית. מעבירים תאים מופשרים לצינור החרוטי עם מדיום הרחבת האב נפרון שחומם מראש. השתמש פיפטה 1,000 μL ולתת לתאים לרוץ במורד הקיר של הצינור לאט מאוד.
   4. לשטוף את cryovial ריק עם 1 מ"ל של מדיום הרחבת אב נפרון כדי לאסוף את התאים הנותרים בריכה בצינור חרוט. צנטריפוגה ב 200 x גרם במשך 5 דקות ב 20 ° C ולהשהות מחדש את גלולת התא בתווך התפשטות אב נפרון טרי שחומם מראש.
   5. מעבירים את התאים המופשרים לבקבוק המצופה ומשנים את התווך למחרת למדיום התפשטות אב נפרון טרי ומחומם מראש. לפני התמיינות נוספת, תן לתאים להתרבות בתווך הרחבת האב נפרון על ידי שינוי המדיום כל יומיים, ולהמשיך משלב 8.3.5.

9. אפיון פודוציטים שמקורם ב-hiPSC על ידי צביעה אימונופלואורסצנטית

1. כדי לבדוק את הפודוציטים המובחנים עבור הסמן הספציפי לפודוציטים באמצעות צביעה אימונופלואורסצנטית, הניחו את כיסויי הפלסטיק בצלחת 24 בארות וצפו בתמיסת ציפוי של 250 מיקרוליטר למשך שעה אחת ב-37°C ו-5% CO2. החלף את תמיסת הציפוי ב- 1 מ"ל של מדיום הרחבת אב נפרון שחומם מראש. זרע 2.5 x 104 תאי אב נפרון מנותקים לכל צלחת 24 באר. ראה שלבים 8.3.2 עד 8.3.4 עבור דיסוציאציה של תאי אב נפרון.
2. תנו לתאים להתחבר למשך הלילה בטמפרטורה של 37°C ו-5% CO2 ללא הפרעה. החלף את המדיום למחרת במדיום התמיינות אב נפרון שחומם מראש.
3. סיים את ההתמיינות על ידי שינוי המדיום כל יומיים עד שהתאים מתמיינים בסך הכל 14 יום בתווך התמיינות האב של נפרון ו -5 ימים נוספים בתווך התמיינות פודוציטים.
4. לאחר ההבחנה הסופית, לשטוף את התאים עם 1 מ"ל של שחומם מראש 1x PBS. תקן את hiPSC-podocytes עם 4% paraformaldehyde במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. שטפו את התאים הקבועים עם PBS 1x וחסמו אתרי קשירה לא ספציפיים עם 200 מיקרוליטר של תמיסת דגירה לכל באר למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
5. מדללים את הנוגדנים הראשוניים סינפטודין (1:200), פודוצין (1:100) ונפרין (1:25) בדילול נוגדנים ומניחים טיפות של דילול נוגדנים ראשוני של 30 מיקרוליטר על רדיד פלסטיק נקי בתא צביעה המכיל מאגר מים.
6. הניחו מגלשות כיסוי עם פודוציטים קבועים hiPSC הפוכים בדילול. לדגור לילה ב 4 °C (75 °F). למחרת, שטפו שלוש פעמים עם 1x PBS במשך 5 דקות. לדלל את הנוגדנים המשניים (1:1,000) ב 1x PBS ולהניח טיפות של 30 μL דילול נוגדנים משני על כתמים נקיים על נייר כסף. הניחו את הכיסוי במגלשה הפוכה בדילול.
7. יש לדגור במשך שעה בטמפרטורת החדר בחושך. לאחר הדגירה, יש לשטוף שלוש פעמים עם 1x PBS למשך 5 דקות. הרכיבו את הדגימות על שקופיות זכוכית באמצעי הרכבה המכילים DAPI. הניחו לייבוש לילה בטמפרטורת החדר ובחושך. דמיינו את הדגימות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי.

בעזרת פרוטוקול שלב אחר שלב זה המשלב תכנות מחדש אפיזומלי והתמיינות, ניתן ליצור פודוציטים הנושאים מוטציה של מטופל בגן רלוונטי לפודוציטים. זה מאפשר ניתוח של שינויים פודוציטים ספציפיים למחלה ex vivo. הרקע הגנטי של המטופל נשמר במהלך הפרוטוקול בכל שלבי התא השונים. בנוסף, ניתן להתגבר על המגבלה של מספר תאים לא מספיק של פודוציטים ממוינים סופניים שאינם מתרבים באמצעות פודוציטים שמקורם ב- hiPSC. אף על פי שלוקח כמה חודשים עד ש-hiPSC-פודוציטים נוצרים מפיברובלסטים עוריים שגדלו באמצעות תכנות מחדש ל-hiPSCs ולאחר מכן התמיינות לפודוציטים, אפשר להקפיא תאים בשלושה שלבים שונים של הפרוטוקול (איור 2). הקפאה אפשרית עבור פיברובלסטים, hiPSCs, ותאי אב נפרון לאחר התמיינות בתווך התמיינות אב נפרון במשך 7 ימים. לכן, הדור של בנק תאים עובדים וניסויים בקנה מידה גדול אפשרי.

איור 2: שלבים בודדים של הפרוטוקול באמצעות מיקרוסקופ ניגודיות פאזה. (A) פיברובלסטים עוריים שגדלו החוצה. (B) היווצרות מושבת hiPSC לאחר תכנות מחדש. (C) תרבות hiPSC נבחרת. (D) תאי מזודרם לאחר יומיים של התמיינות. (E) תאי אב של נפרון לאחר 14 יום של התמיינות בתווך התמיינות אב נפרון. (F) פודוציטים מובחנים סופיים שמקורם ב-hiPSC. פסי קנה מידה מייצגים 300 מיקרומטר (A,B,D-F) ו- 150 מיקרומטר (C). פתית השלג מדגיש שלבי הקפאה אפשריים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

מכיוון שהפודוציטים שמקורם ב-hiPSC חוצים פרוטוקול ארוך עם שינויים דרסטיים לגבי סוג התא והמורפולוגיה, אפיון התא הוא חובה. מורפולוגיה של התא, כמו גודל וצורת התא, כמו גם התנהגות גדילה, ניתנת לניטור באמצעות מיקרוסקופ ניגודיות פאזה. פיברובלסטים מציגים פנוטיפ ארוך דמוי ציר בגודל של 150 מיקרומטר עד 300 מיקרומטר (איור 2A). לאחר תכנות מחדש, מושבות עם hiPSCs קטנים של 50 מיקרומטר מתרחשים. המושבות האלה מציגות גבולות ברורים ו-hiPSCs המובחנים ביחס גבוה בין גרעינים לגוף ובקצב התרבות מוגבר (איור 2C). מאחר שפודוציטים הם תאים ממוינים סופניים, קצב ההתרבות יורד עם התמיינות מתקדמת, והמורפולוגיה של התא משתנה לפודוציטים גדולים בצורת כוכב בגודל 300 מיקרומטר עם תהליכים רגליים בולטים (איור 2F).

מפגש הוא נקודה קריטית בתרבות hiPSC, והתמיינות ספונטנית יכולה להופיע כאשר מושבות גדלות צפופות מדי (איור 3). מושבות אלה יש להסיר לפני המעבר על ידי גירוד החלקים המושפעים של צלחת התרבות.

איור 3: דוגמאות ל-hiPSCs באיכות שונה. תמונות ניגודיות פאזה של (A) מושבות hiPSC שתוכנתו מחדש בהצלחה ו-(B) hiPSC נבחרות, כמו גם (C) התמיינות ספונטנית, (D,E) מושבות שאינן hiPSC, ו-(F) תרבות hiPSC צפופה מדי. פסי קנה מידה מייצגים 300 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

יש לאמת את סוגי התאים השונים של פרוטוקול זה בנוגע לביטוי של סמן מסוים. לאחר תכנות מחדש, hiPSCs מחזירים לעצמם יכולת פלוריפוטנציה ומבטאים סמני ריבוי ופלוריפוטנציה כמו SSEA4, OCT3/4 ו-Ki67 (איור 4)38,39,40. ידוע כי תכנות מחדש, כמו גם התרבות הארוכה של hiPSCs והבחנה, יכולים להוביל לקריוטיפ לא תקין, או ליתר דיוק לגרום למוטציות41. לכן, יש לעקוב אחר הרקע הגנטי של התאים בתרבית לאורך זמן ובמעברים שונים על ידי g-banding וריצוף אקסומי שלם.

איור 4: אפיון של hiPSCs שנוצרו על ידי צביעה אימונופלואורסצנטית. אפיון hiPSCs שנוצרו על ידי צביעה עבור (A) סמן ההתרבות Ki67, כמו גם את סמני פלוריפוטנציה (B) OCT3/4 ו- (C) SSEA4. פסי קנה מידה מייצגים 100 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

מבחינה מורפולוגית, פודוציטים שמקורם ב-hiPSC מופיעים בצורת כוכב ומבטאים רשת מובחנת של תהליכים ארוכים ראשוניים ומשניים ברגל בהשוואה לציפודוציטים (איור 5). פודוציטים שמקורם ב-HiPSC מבטאים חלבוני סמן ספציפיים לפודוציטים כמו סינפטודין, נפרין ופודוצין (איור 6A-C)42.

איור 5: מורפולוגיה של פודוציטים שמקורם ב-hiPSC בהשוואה לציפודוציטים. השוואה של פודוציטים (A,B) שמקורם ב-hiPSC מתורם בריא ל-(C,D) ciPodocytes לגבי מורפולוגיה של תאים ופילופודיה באמצעות מיקרוסקופ ניגודיות פאזה (A,C) ומיקרוסקופ אלקטרונים סורק (B,D). פסי קנה מידה מייצגים 150 מיקרומטר (A,C) ו- 20 מיקרומטר (B,D). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

לכן, ההשוואה של פודוציטים שמקורם ב-hiPSC לא רק מתורמים בריאים, אלא גם מחולים עם מוטציות בגנים ספציפיים לפודוציטים, מאפשרת אפיון פרטני של המוטציה ex vivo של החולה.

איור 6: אפיון סמן ספציפי לפודוציטים בפודוציטים וציפודוציטים שמקורם ב-hiPSC. השוואה של פודוציטים (A-C) שמקורם ב-hiPSC מתורם בריא ל-(D-F) ciPodocytes לגבי חלבוני סמן ספציפיים לפודוציטים סינפטודין (A,D), נפרין (B,E) ופודוצין (C,F). פסי קנה מידה מייצגים 50 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה 1. הרכב כל המדיה והפתרונות של תרביות תאים ששימשו במחקר. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

למחברים אין מה לחשוף.