שרירי השלד מורכבים ממספר סוגי תאים, כולל תאי גזע תושבים, שלכל אחד מהם תרומה מיוחדת להומאוסטזיס והתחדשות שרירים. כאן מתוארת התרבית הדו-ממדית של תאי גזע שריריים ונישת תאי השריר בסביבה ex vivo המשמרת רבים מהמאפיינים הפיזיולוגיים, in vivo וסביבתיים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
תרבית בתפזורת בלתי מופרעת של שרירי שלד עכבר כדי לשחזר נישה ושקט תאי גזע
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
שרירי השלד הם הרקמה הגדולה ביותר בגוף ומבצעים תפקודים רבים, החל מתנועה ועד בקרת טמפרטורת הגוף. תפקודו והחלמתו מפציעות תלויים במספר רב של סוגי תאים ובאותות מולקולריים בין תאי שריר הליבה (מיופייבר, תאי גזע שריריים) לבין הנישה שלהם. רוב סביבות הניסוי אינן משמרות את המיקרו-סביבה הפיזיולוגית המורכבת הזו, והן גם אינן מאפשרות מחקר אקס ויו של תאי גזע שריריים במצב תא, מצב תאי חיוני עבורם. כאן, פרוטוקול מתואר עבור תרבית ex vivo של תאי גזע שריר עם רכיבים תאיים של הנישה שלהם. באמצעות פירוק מכני ואנזימטי של השרירים, מתקבלת תערובת של סוגי תאים, אשר מוכנס לתרבות דו-ממדית. Immunostaining מראה כי בתוך שבוע אחד, תאי נישה מרובים נמצאים בתרבית לצד myofibers, וחשוב מכך, תאים חיוביים Pax7 המציגים את המאפיינים של תאי גזע שריר שקט. תכונות ייחודיות אלה הופכות פרוטוקול זה לכלי רב עוצמה להגברת תאים וליצירת תאי גזע דמויי שקט שניתן להשתמש בהם כדי לענות על שאלות בסיסיות ותרגומיות.
מבוא
תנועה, נשימה, חילוף חומרים, תנוחת הגוף ושמירה על טמפרטורת הגוף תלויים כולם בשרירי השלד, ותקלות בשרירי השלד יכולות, לפיכך, לגרום לפתולוגיות מתישות (כלומר, מיופתיות, ניוון שרירים וכו '). 1. לאור תפקודיו החיוניים ושפעו, שרירי השלד משכו את תשומת ליבן של מעבדות מחקר ברחבי העולם השואפות להבין את ההיבטים המרכזיים התומכים בתפקוד תקין של השרירים ויכולים לשמש כמטרות טיפוליות. בנוסף, שרירי השלד הם מודל בשימוש נרחב לחקר התחדשות ותפקוד תאי גזע, שכן שריר בריא יכול לתקן את עצמו באופן מלא לאחר פציעה וניוון מוחלטים, בעיקר בשל תאי הגזע השוכנים בו2; אלה נקראים גם תאי לוויין והם ממוקמים מתחת ללמינה הבסיסית בפריפריה של ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל הניסויים עמדו בתקנות בעלי החיים של צרפת והאיחוד האירופי במכון Mondor de Recherche Biomédicale (INSERM U955), ובמיוחד ההנחיה 2010/63/UE. בעלי החיים הוחזקו בסביבה מבוקרת ומועשרת במתקני בעלי החיים עם מספרי הסמכה A94 028 379 ו-D94-028-028; הם טופלו רק על ידי חוקרים מוסמכים ומטפלים בבעלי חיים, והם נבדקו חזותית על ידי אנשי דיור לבעלי חיים לסימנים של אי נוחות במהלך חייהם. הם הומתו על ידי פריקת צוואר הרחם לפני הנתיחה. לא בוצעו הליכים התערבותיים במהלך חיי בעלי החיים; לפיכך, לא היה צורך בקבלת אישור להליך מוועדת אתיקה וממשרד ההשכלה הגבוהה, המחקר והחדשנות הצרפתי. אכן, לא נדרש אישור אתי להמתת חסד ולנתיחה לאחר המוות על פי ההנחיה 2010/63/UE. התוצאות המוצגות בכתב יד זה הן מקו C57B....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
פרוטוקול זה מאפשר תרבית תאי שריר תוך שימור תאי הלוויין ורוב התאים מהנישה האנדוגנית שלהם. איור 2 מסכם את השלבים העיקריים של הפרוטוקול, בעוד שחלקים חיוניים של הדיסקציה והעיכול מוצגים באיור 1. מומלץ לבצע דיסקציה של שרירי הגפה האחורית (איור 1A-C), מאחר שקבוצת שרירים זו נחקרת היטב וחולקת מקור התפתחותי והיררכיות מולקולריות14. מומלץ להכין את כל התערובות בתנאים סטריליים. בנוסף, זיהום.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
תפקוד שרירי השלד הבוגרים מבוסס על מערכת מתוזמרת היטב של אינטראקציות תאיות ואותות מולקולריים. כאן, מוצגת שיטה המאפשרת ללמוד פרמטרים אלה בסביבה ex vivo הדומה מאוד microenvironment פיזיולוגי.
מספר קבוצות דיווחו על שיטות במבחנה לתרבית תאים מיוגניים. שיטות אלה נועדו לבודד תאי לוויין כדי לחקור את תכונות האב המיוגניות שלהם. שתי גישות עיקריות משמשות לבידוד תאי לוויין טהורים, או מתרביות של סיבים מבודדים משרירי סולאוס ו/או EDL18או מתאי לוויין מבודדים ב-FACS, משר.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים.
תודות
עבור איור 2 נעשה שימוש בתבניות מ-Servier Medical Art (https://smart.servier.com/). מעבדת FR נתמכת על ידי האגודה הצרפתית contre les Myopathies - AFM באמצעות TRANSLAMUSCLE (מענקים 19507 ו- 22946), Fondation pour la Recherche Médicale - FRM (EQU202003010217, ENV202004011730, ECO201806006793), Agence Nationale pour la Recherche - ANR (ANR-21-CE13-0006-02, ANR-19-CE13-0010, ANR-10-LABX-73), ו- La Ligue Contre le Cancer (IP/SC-17130). למממנים הנ"ל לא היה כל תפקיד בעיצוב, באיסוף, בניתוח, בפרשנות או בדיווח של מחקר זה או בכתיבת כתב יד זה.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| אנטי-CD31 | BD | 550274 | דילול 1:100 |
| אנטי-FOSB | סנטה קרוז | SC-7203 | דילול 1:200 |
| אנטי-GFP | Abcam | ab13970 | דילול 1:1000 |
| אנטי-Ki67 | Abcam | ab16667 | דילול 1:1000 |
| אנטי-MyHC | DSHB | MF20-c | דילול 1:400 |
| אנטי-MYOD | מוטיב פעיל | 39991 | דילול 1:200 |
| אנטי-MYOG | סנטה קרוז | sc-576 | דילול 1:150 |
| אנטי-Pax7 | סנטה קרוז | sc-81648 | דילול 1:100 |
| אנטי-PDGFR&אלפא; | דילול Invitrogen | PA5-16571 | 1:50 |
| b-FGF | Peprotech | 450-33 | ריכוז 4 ננוגרם/מ"ל |
| אלבומין בסרום בקר (BSA) – משמש לעיכול | סיגמא אולדריץ' | A7906-1006 | ריכוז 0.2% |
| BSA ללא IgG, ללא פרוטאז – משמש לצביעה | ג'קסון ImmunoResearch | 001-000-162 | ריכוז 5% |
| מסננת תאים 40 אום | דומיניק דוטשר | 352340 | |
| מסננת תאים 70 אום | דומיניק דוטשר | 352350 | |
| מסננת תאים 100 אום | דומיניק דוטשר | 352360 | |
| קולגנאז | רוש | 10103586001 ריכוז 0.5 U/mL | |
| צלחת תרבית | Sarstedt | 94.6140.802 | |
| דימתיל סולפוקסיד (DMSO) | Euromedex | UD8050-05-A | |
| Dispase | Roche | 4942078001 ריכוז 3 U/mL | |
| מלקחיים דיסקציה גודל 5 | כלי מדע עדין | 91150-20 | |
| מלקחיים לדיסקציה גודל 55 | Fine Science | Tools 11295-51 | |
| מספריים לדיסקציה (גדולים, ישרים) | Fine Science | Tools 9146-11 | אידיאלי לחיתוך |
| מספריים לדיסקציה (קטנים, מעוקלים) | Fine Science | Tools 15017-10 | |
| מספריים לדיסקציה (קטנים, ישרים) | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Dulbecco שונה Eagle's Medium (DMEM) | ThermoFisher | 41966-029 | |
| ערכת EdU Click-iT ThermoFisher | C10340 | ||
| סרום בקר עוברי – אפשרות 1 | Eurobio | CVF00-01 | |
| סרום בקר עוברי – אפשרות 2 | Gibco | 10270-106 | |
| Matrigel | Corning Life Sciences | 354234 | תמיסת ציפוי |
| Parafilm | דומיניק דוצ'ר | 090261 | סרט גמיש |
| Paraformaldehyde – אפשרות 1 | PanReac AppliChem ITW Reagents | 211511.1209 | ריכוז 4% |
| Paraformaldeyde – אפשרות 2 | ThermoFisher | 28908 | ריכוז 4% |
| פניצילין סטרפטומיצין | Gibco | 15140-122 | |
| אמבט מים רועדים | ThermoFisher | TSSWB27 | |
| TritonX100 | Sigma Aldrich | T8532-500 ML | ריכוז 0.5% |
| עכברים מסוג בר | Janvier | C57BL/6NRj |
מקורות
- Frontera, W. R., Ochala, J. Skeletal muscle: A brief review of structure and function. Calcified Tissue International. 96 (3), 183-195 (2015).
- Forcina, L., Cosentino, M., Musarò, A. Mechanisms regulating muscle regeneration: Ins....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
