Method Article

יישור נתוני סדרות זמן מסונכרנות באמצעות מודל אפיון אובדן מחזור התא לצורך השוואות בין ניסויים

DOI:

10.3791/65466

⸱

June 9th, 2023

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, Duke University, 2Department of Biology, University of Massachusetts, 3Orlando Data Science LLC, 4Department of Computer Science, Duke University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אחד האתגרים בניתוח ניסויים מסונכרנים בסדרות זמן הוא שהניסויים נבדלים לעתים קרובות זה מזה במשך ההתאוששות מסנכרון ובתקופת מחזור התא. לפיכך, המדידות מניסויים שונים אינן ניתנות לניתוח מצטבר או להשוואה בקלות. במאמר זה אנו מתארים שיטה ליישור ניסויים כדי לאפשר השוואות ספציפיות לפאזה.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

חקירת מחזור התא תלויה לעתים קרובות בסנכרון אוכלוסיות תאים כדי למדוד פרמטרים שונים בסדרת זמן כאשר התאים חוצים את מחזור התא. עם זאת, גם בתנאים דומים, ניסויים משוכפלים מציגים הבדלים בזמן הדרוש כדי להתאושש מסנכרון ולחצות את מחזור התא, ובכך למנוע השוואות ישירות בכל נקודת זמן. הבעיה של השוואת מדידות דינמיות בין ניסויים מחריפה באוכלוסיות מוטנטיות או בתנאי גידול חלופיים המשפיעים על זמן ההתאוששות המסונכרן ו/או על תקופת מחזור התא.

פרסמנו בעבר מודל מתמטי פרמטרי בשם Characterizing Loss of Cell Cycle Synchrony (CLOCCS) המנטר כיצד אוכלוסיות סינכרוניות של תאים משתחררות מסנכרון ומתקדמות במחזור התא. לאחר מכן ניתן להשתמש בפרמטרים הנלמדים מהמודל כדי להמיר נקודות זמן ניסיוניות מניסויים מסונכרנים בסדרות זמן לסולם זמן מנורמל (נקודות קו חיים). במקום לייצג את הזמן שחלף בדקות מתחילת הניסוי, סולם קו החיים מייצג את ההתקדמות מסנכרון לכניסה למחזור התא ולאחר מכן דרך השלבים של מחזור התא. מכיוון שנקודות עורק החיים תואמות את הפאזה של התא הממוצע באוכלוסייה המסונכרנת, סולם זמן מנורמל זה מאפשר השוואה ישירה בין ניסויים, כולל אלה עם תקופות שונות וזמני התאוששות. יתר על כן, המודל שימש ליישור ניסויים במחזור התא בין מינים שונים (למשל, Saccharomyces cerevisiae ו - Schizosaccharomyces pombe), ובכך מאפשר השוואה ישירה של מדידות מחזור התא, אשר עשוי לחשוף דמיון והבדלים אבולוציוניים.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מדידות סדרות זמן המבוצעות על אוכלוסיות מסונכרנות של תאים בזמן שהן מתקדמות במחזור התא היא שיטה סטנדרטית לחקר המנגנונים השולטים בהתקדמות מחזור התא 1,2,3,4,5,6,7,8 . היכולת לערוך השוואות בין ניסויים בסדרות זמן סינכרוני/שחרור חיונית להבנתנו את התהליכים הדינמיים הללו. השימוש בניסויים משוכפלים כדי לאשש ממצאים יכול להגביר את הביטחון ביכולת השחזור של המסקנות. יתר על כן, השוואות בין תנאי הסביבה, בין מוטנטים ואפיל....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. איסוף שלב מחזור התא ונתוני ניסוי

  1. סנכרן את התאים ביחס למחזור התא באמצעות שיטת הסנכרון הרצויה (למשל, אלוטריטה צנטריפוגלית כמתואר ב- Leman et al.18 או מעצר פרומון הזדווגות כמתואר ברוזברוק 19; הן Leman et al.18 והן Rosebrock 19 כוללים גם שיטות לשחרור מסנכרון). התחל לדגום לאורך כל סדרת הזמן, ודא שסדרת הזמן היא לפחות שתי תקופות מחזור תא מלאות, ובאופן אופטימלי, לאסוף לפחות 10 דגימות לכל מחזור תא. בכל נקודת זמן, אספו דגימה עבור נתוני פאזת מחזור התא (ציטומטריית ניצנים או זרימה) ודגימה עבור נתוני ניסוי, כמתואר להלן.
  2. אם אתה משתמש בנתוני ניצנים כ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השלבים המתוארים בפרוטוקול לעיל ובזרימת העבודה באיור 1 יושמו על חמישה ניסויים מסונכרנים בסדרות זמן של מחזור התא כדי להדגים שתי השוואות מייצגות: בין שכפולים בשיטות סינכרוניות שונות (פרומון הזדווגות ואלוטריציה צנטריפוגלית18) לבין פלטפורמות ריצוף (ריצוף RNA [RNA-seq] ומיקרו-מערך), כמו גם על פני תנאי ניסוי. ניסויים מרובים בוצעו עם S. cerevisiae, ונאספו נתונים בשלב מחזור התא ובניסוי עבור כל ניסוי. זרימת העבודה כוללת שימוש ב- CLOCCS כדי ליצור פרמטרים לניסויים השונים.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מאמר זה מציג שיטה להערכה מדויקת וכמותית יותר של נתונים מניסויים בסדרות זמן על אוכלוסיות מסונכרנות של תאים. השיטה משתמשת בפרמטרים שנלמדו מ-CLOCCS, מודל היסק בייסיאני המשתמש בנתוני פאזות של מחזור תאי קלט, כגון נתוני ניצנים ונתוני תוכן DNA ציטומטרי של זרימה, כדי לקבוע פרמטרים לכל ניסוי14,15. CLOCCS משתמשת בנתוני הפאזה של מחזור תאי הקלט כדי להסיק את הפרמטרים עבור כל ניסוי, אשר משמשים לאחר מכן ליישור לקנה מידה משותף של קו חיים. המרת ניסויים מרובים של סדרות זמן סינכרונ.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

קמפיונה וס' האזה נתמכו על ידי מימון מהקרן הלאומית למדע (DMS-1839288) ומהמכונים הלאומיים לבריאות (5R01GM126555). בנוסף, המחברים רוצים להודות ל-Huarui Zhou (אוניברסיטת דיוק) על הערות על כתב היד ועל בדיקת בטא של הפרוטוקול. אנו מודים גם לפרנסיס מוטה (אוניברסיטת פלורידה אטלנטיק) וג'ושוע רובינסון על עזרתם בקוד Java.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
2x PBSלפתרון מקבע. מתואר ב-Leman 2014.
פורמלדהידלתמיסה מקבעת.
100% אתנוללקיבוע ציטומטריית זרימה. מתואר ב-Haase 2002.
CLOCCShttps://gitlab.com/haase-lab-group/cloccs_alignment.git
ציטומטרלפרוטוקול ציטומטריית זרימה.
Githttps://git-scm.com/
Java 19
https://www.oracle.com/java/technologies/downloads/#java19 מיקרוסקופלספירת תאים וניצנים.
תמיסת Minicondahttps://docs.conda.io/en/latest/
פרוטאזלפרוטוקול זרימה ציטומטרית. מתואר ב-Haase 2002.
RNAse פתרוןלפרוטוקול זרימה ציטומטרית. מתואר ב-Haase 2002.
SYTOX צבע חומצת גרעין ירוקהInvitrogenS7020לצביעה ציטומטרית זרימה. מתואר ב-Haase 2002.
טריסpH 7.5
4% זרימה

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tyers, M., Tokiwa, G., Futcher, B. Comparison of the Saccharomyces cerevisiae G1 cyclins: Cln3 may be an upstream activator of Cln1, Cln2 and other cyclins. EMBO Journal. 12 (5), 1955-1968 (1993).
  2. Schwob, E., Nasmyth, K.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Cell Cycle SynchronyTime Series AlignmentLifeline NormalizationCross Experiment ComparisonSynchronized Cell PopulationsCell Cycle PhaseFlow CytometryBudding YeastTranscriptomic DataProteomic Data

Related Articles