יישור נתוני סדרות זמן מסונכרנות באמצעות מודל אפיון אובדן מחזור התא לצורך השוואות בין ניסויים

Summary

אחד האתגרים בניתוח ניסויים מסונכרנים בסדרות זמן הוא שהניסויים נבדלים לעתים קרובות זה מזה במשך ההתאוששות מסנכרון ובתקופת מחזור התא. לפיכך, המדידות מניסויים שונים אינן ניתנות לניתוח מצטבר או להשוואה בקלות. במאמר זה אנו מתארים שיטה ליישור ניסויים כדי לאפשר השוואות ספציפיות לפאזה.

Abstract

חקירת מחזור התא תלויה לעתים קרובות בסנכרון אוכלוסיות תאים כדי למדוד פרמטרים שונים בסדרת זמן כאשר התאים חוצים את מחזור התא. עם זאת, גם בתנאים דומים, ניסויים משוכפלים מציגים הבדלים בזמן הדרוש כדי להתאושש מסנכרון ולחצות את מחזור התא, ובכך למנוע השוואות ישירות בכל נקודת זמן. הבעיה של השוואת מדידות דינמיות בין ניסויים מחריפה באוכלוסיות מוטנטיות או בתנאי גידול חלופיים המשפיעים על זמן ההתאוששות המסונכרן ו/או על תקופת מחזור התא.

פרסמנו בעבר מודל מתמטי פרמטרי בשם Characterizing Loss of Cell Cycle Synchrony (CLOCCS) המנטר כיצד אוכלוסיות סינכרוניות של תאים משתחררות מסנכרון ומתקדמות במחזור התא. לאחר מכן ניתן להשתמש בפרמטרים הנלמדים מהמודל כדי להמיר נקודות זמן ניסיוניות מניסויים מסונכרנים בסדרות זמן לסולם זמן מנורמל (נקודות קו חיים). במקום לייצג את הזמן שחלף בדקות מתחילת הניסוי, סולם קו החיים מייצג את ההתקדמות מסנכרון לכניסה למחזור התא ולאחר מכן דרך השלבים של מחזור התא. מכיוון שנקודות עורק החיים תואמות את הפאזה של התא הממוצע באוכלוסייה המסונכרנת, סולם זמן מנורמל זה מאפשר השוואה ישירה בין ניסויים, כולל אלה עם תקופות שונות וזמני התאוששות. יתר על כן, המודל שימש ליישור ניסויים במחזור התא בין מינים שונים (למשל, Saccharomyces cerevisiae ו - Schizosaccharomyces pombe), ובכך מאפשר השוואה ישירה של מדידות מחזור התא, אשר עשוי לחשוף דמיון והבדלים אבולוציוניים.

Introduction

מדידות סדרות זמן המבוצעות על אוכלוסיות מסונכרנות של תאים בזמן שהן מתקדמות במחזור התא היא שיטה סטנדרטית לחקר המנגנונים השולטים בהתקדמות מחזור התא 1,2,3,4,5,6,7,8 . היכולת לערוך השוואות בין ניסויים בסדרות זמן סינכרוני/שחרור חיונית להבנתנו את התהליכים הדינמיים הללו. השימוש בניסויים משוכפלים כדי לאשש ממצאים יכול להגביר את הביטחון ביכולת השחזור של המסקנות. יתר על כן, השוואות בין תנאי הסביבה, בין מוטנטים ואפילו בין מינים יכולים לחשוף תובנות חדשות רבות על ויסות מחזור התא. עם זאת, שונות בין-ניסויית בהתאוששות מסנכרון ובמהירות התקדמות מחזור התא פוגעת ביכולת לבצע השוואות בין נקודת זמן לנקודת זמן בין עותקים משוכפלים או בין ניסויים עם תזמון שונה של מחזור התא. בשל אתגרים אלה, עותקים משוכפלים לעתים קרובות אינם נכללים עבור הסדרה במשרה מלאה (למשל, Spellman et ^al.4). כאשר אוספים עותקים משוכפלים לכל סדרות הזמן, לא ניתן לנתח את הנתונים במצטבר, אלא משתמשים בשכפול יחיד לניתוח, ומשכפלים אחרים נדחקים לעתים קרובות לנתונים משלימים (למשל, אורלנדו ואחרים^). יתר על כן, קשה להשוות בין ניסויים בעלי מאפייני התאוששות או התקדמות שונים של מחזור התא. המדידות של מרווחי זמן קטנים יותר בין אירוע מעניין לבין ציון דרך במחזור התא (לדוגמה, הופעת ניצן, כניסה לשלב S או תחילת אנאפאזה) יכולות לסייע בהפחתת שגיאות אם עוקבים אחר אירועים ציון דרך אלה 1,2,3,9,10,11,12. עם זאת, הבדלים עדינים אך חשובים עשויים להישאר בלתי מזוהים או מוסתרים באמצעות שיטות אד הוק אלה. לבסוף, ניתוחים של תא בודד מאפשרים לנתח את התקדמות מחזור התא מבלי להסתמך על סנכרון או יישור¹³, אם כי מדידות בקנה מידה גדול במחקרים על תא בודד יכולות להיות מאתגרות ויקרות.

כדי להתגבר על קשיים אלה, פיתחנו את מודל Characterizing Loss of Cell Cycle Synchrony (CLOCCS) כדי לסייע בניתוח מדידות סדרות זמן שבוצעו על אוכלוסיות מסונכרנות^14,15. CLOCCS הוא מודל מתמטי גמיש המתאר את התפלגות התאים המסונכרנים על פני שלבי מחזור התא כשהם משתחררים מסנכרון ומתקדמים במחזור התא. מסגרת תהליך ההסתעפות מאפשרת למודל להסביר את התכונות הא-סימטריות של תאי האם והבת לאחר החלוקה, כפי שנצפה ב-S. cerevisiae, ועדיין להיות שימושית עבור אורגניזמים המתחלקים בביקוע, כגון S. pombe. המודל יכול לקחת קלט ממגוון סוגי מדידה כדי לציין את שלב מחזור התא. הוא יכול לבלוע נתוני פאזות של מחזור התא הניצני, הכוללים מדידות של אחוז התאים הניצנים לאורך זמן, מה שמאפשר להעריך את מספר התאים מחוץ לשלב G1^14,15 שלא ניצן. המודל יכול גם לבלוע נתונים ציטומטריים זורמים המודדים את תכולת הדנ"א, ובכך לאפשר הערכה של מעברים פורצי דרך מ-G1 ל-S, S ל-G2 ו-M ל-G1¹⁵. ניתן להשתמש בסמנים מורפולוגיים פלואורסצנטיים גם כדי לזהות את שלב מחזור התא. ניתן להשתמש בתיוג הפלואורסצנטי של טבעות מיוזין, גרעינים וגופי מוטות ציר (SPBs) כדי לקבוע את שלב מחזור התא, ואלה שולבו במודל CLOCCS¹¹; עם זאת, מדידות אלה לא יתוארו בפרוטוקול זה. בנוסף, מדד הספטציה שימש כקלט למידול נתונים מ- S. pombe¹⁴. לפיכך, המודל יכול לשמש לניתוח מחזור התא במגוון אורגניזמים וניתן להרחיב אותו עוד יותר.

CLOCCS הוא מודל פרמטרי המאפשר הסקה בייסיאנית מלאה של פרמטרים מרובים מנתוני הקלט (למשל, אחוז ניצנים, תוכן DNA). פרמטרים אלה כוללים את זמן ההתאוששות מסנכרון, אורך תקופת מחזור התא (המוערך בנפרד עבור תאי אם ובת), ואת המיקום הממוצע של מחזור התא של התאים בכל נקודת זמן. פרמטרים אלה מייצגים את התנהגות התא הממוצע באוכלוסייה, ומאפשרים לחוקר למפות בכל נקודת זמן למיקום מחזור התא המתבטא כנקודת עורק חיים. ההמרה לנקודות קו חיים תלויה בפרמטרי CLOCCS lambda (λ) ו- mu0 (μ₀)^14,15. הפרמטר λ מתאים לתקופת מחזור התא הממוצעת של תאי האם. עם זאת, בשל עיכוב^{אם-בת 14,15,} זו אינה תקופת מחזור התא הממוצעת של כלל האוכלוסייה הכוללת הן את תאי האם והן את תאי הבת. CLOCCS גם מסיק את הפרמטר דלתא (δ), המתאים לעיכוב אם-בת, ובכך מאפשר חישוב של תקופת מחזור התא הממוצעת של האוכלוסייה כולה. לבסוף, מכיוון שכל ניסוי מתחיל לאחר שחרור מסנכרון מחזור התא, הזמן הדרוש להתאוששות משיטת הסינכרון מיוצג על ידי הפרמטר CLOCCS μ₀. CLOCCS מתאים מודל לנתוני הפאזה של מחזור תא הקלט ולאחר מכן מסיק פרמטרים אלה באמצעות הליכה אקראית שרשרת מרקוב אלגוריתם מונטה קרלו^14,15. על ידי מיפוי ניסויים מרובים לסולם זמן משותף של מחזור התא, ניתן לבצע השוואות ישירות ספציפיות לפאזה בין משכפלים או ניסויים שבהם זמן ההתאוששות או תקופות מחזור התא אינם זהים 8,14,15.

מכיוון שאוכלוסיות מסונכרנות מאבדות סנכרון בקצב מסוים במהלך סדרות הזמן^14,15,16,17, שונות בקצב אובדן הסנכרון יכולה גם לעכב השוואות כמותיות בין ניסויים. על ידי זיהוי מיקום האוכלוסיות והשונות בהתפלגות שלהן, CLOCCS מסביר הבדלים בשיעורי אובדן הסנכרון. כלי רב עוצמה זה מאפשר השוואות ספציפיות ומפורטות בין ניסויים, ובכך מספק את היכולת לבצע השוואות רלוונטיות ישירות לא רק בין שכפולים אלא גם בין תנאי סביבה, מוטנטים, ואפילו מינים שיש להם תזמון מחזור תא שונה באופן דרמטי^14,15.

מאמר זה מתאר שיטה המשתמשת ב- CLOCCS כדי להעריך פרמטרים על-ידי התאמת נתונים מניסויים מסנכרון/שחרור סדרות זמן, מיפוי הנתונים לקנה מידה משותף של קו חיים ולאחר מכן ביצוע השוואות רלוונטיות בין עותקים משוכפלים או ניסויים. יישור קו החיים מאפשר השוואות ישירות ספציפיות לפאזה על פני ניסויים אלה, מה שמאפשר צבירה והשוואה של עותקים משוכפלים וביצוע השוואות רלוונטיות יותר בין ניסויים עם תזמוני התאוששות שונים ותקופות מחזור תאים שונות.

Protocol

1. איסוף שלב מחזור התא ונתוני ניסוי

1. סנכרן את התאים ביחס למחזור התא באמצעות שיטת הסנכרון הרצויה (למשל, אלוטריטה צנטריפוגלית כמתואר ב- Leman et al.18 או מעצר פרומון הזדווגות כמתואר ברוזברוק 19; הן Leman et al.18 והן Rosebrock ¹⁹ כוללים גם שיטות לשחרור מסנכרון). התחל לדגום לאורך כל סדרת הזמן, ודא שסדרת הזמן היא לפחות שתי תקופות מחזור תא מלאות, ובאופן אופטימלי, לאסוף לפחות 10 דגימות לכל מחזור תא. בכל נקודת זמן, אספו דגימה עבור נתוני פאזת מחזור התא (ציטומטריית ניצנים או זרימה) ודגימה עבור נתוני ניסוי, כמתואר להלן.
2. אם אתה משתמש בנתוני ניצנים כנתוני פאזת מחזור התא, אסוף נתונים על ניצנים עבור יישור CLOCCS.
   1. דגימה לאורך כל סדרת הזמן. עבור כל נקודת זמן, לאסוף תאים, ולתקן אותם על ידי ערבוב 200 μL של תרבית תאים sonicated עם 200 μL של פתרון קיבוע, כפי שמתואר Leman et ^al.18.
   2. עבור ניצנים סטנדרטיים, לספור לפחות 200 תאים בכל נקודת זמן באמצעות מיקרוסקופ אור משודר עם מטרה 40x והמוציטומטר. הוסף את דגימת התא משלב 1.2.1 להמוציטומטר, ודלל אם הצפיפות מונעת ספירה. רשום את מספר התאים הניצנים והתאים שאינם ניצנים בכל נקודת זמן. חשב את אחוז התאים הניצנים, והתווה עבור כל נקודת זמן בעקומת ניצנים.
      הערה: שיטות אחרות לציון מידע שלב מחזור התא זמינות, אך הן אינן מתוארות בפרוטוקול זה. השיטות האחרות מתוארות בקובץ הקריאה של CLOCCS ובעבודה קודמת¹¹.
3. אם אתה משתמש בנתוני תוכן DNA ציטומטרי של זרימה כנתוני פאזת מחזור התא, אסוף נתוני צביעת DNA של ציטומטריית זרימה עבור יישור CLOCCS ציטומטרי זרימה.
   1. דגימה לאורך כל סדרת הזמן. עבור כל נקודת זמן, לאסוף תאים, ולתקן אותם כמתואר Haase ו ריד²⁰.
   2. מכתימים את הדנ"א, ומנתחים באמצעות אנליזה ציטומטרית סטנדרטית של זרימה. פרוטוקול צביעה מומלץ עבור S. cerevisiae מתואר ב- Haase and Reed²⁰.
4. אסוף אומיקה משויכת או נתוני ניסוי קשורים. עבור נתוני תעתיק סטנדרטיים, אסוף כמתואר ב- Leman et ^al.18 וב- Kelliher et ^al.21,22. ודא שהנתונים משויכים לנקודות זמן המכילות נתוני פאזות של מחזור התא כדי לאפשר יישור במורד הזרם. ליישור מיטבי, ודא שלכל נקודת זמן המכילה נתוני ניסוי משויכים גם נתוני פאזה.
   הערה: נתוני הניסוי יכולים ללבוש צורות רבות. באופן מסורתי, אנו משתמשים בשיטת היישור המתוארת ליישור ניסויי שעתוק של סדרות זמן. עם זאת, כל סוג של נתונים המשויכים לנקודות זמן יכול להיות מיושר (כלומר, פרוטאומיקה²²).

2. התקנת התוכנה הנדרשת

הערה: סעיף זה מניח ש- Conda, Java 19 ו- Git כבר מותקנים (טבלת חומרים).

1. הורד את מאגר CLOCCS_alignment על ידי הזנת הפקודה הבאה לתוך הטרמינל:
   Git Clone Git Clone https://gitlab.com/haase-lab-group/cloccs_alignment.git
2. צור סביבת Conda באמצעות הקובץ conda_req.yml על-ידי הזנת הפקודה הבאה במסוף בתיקייה שבה שוכפל מאגר CLOCCS_alignment:
   Conda env create -f conda_req.yml

3. שימוש ב-CLOCCS לפרמטרים של הניסויים

1. לחץ פעמיים על קובץ cloccs_v2023.jar בתיקייה CLOCCS במאגר CLOCCS_alignment והמתן לפתיחת ממשק משתמש גרפי. מסך זה מאפשר אפשרויות קלט עבור הפעלת CLOCCS ומציג את התוצאות לאחר הפעלתן.
2. הזן את ההגדרות הכלליות.
   1. הגדר Sim Anneal, Burn In ו- Iterations על-ידי הקלדה בתיבות קלט הטקסט המשויכות. Sim Anneal (חישול מדומה) מזהה ערכי פרמטר התחלה טובים, Burn In מחפש מצבים אחוריים, והשלב הסופי מאפשר להסיק את כל המסקנות האחוריות. ערכים גבוהים יותר מגדילים את זמן הריצה אך גם מגדילים את הדיוק.
   2. הזן את תנאי הניסוי על-ידי ציון הטמפרטורה בצלזיוס ושיטת הסינכרון באמצעות תיבת הטקסט שכותרתה טמפרטורה והתפריט הנפתח Synchro. שיטה, בהתאמה.
   3. לחלופין, קבע את תצורת ההגדרות המתקדמות בתפריט הגדרות מתקדמות. ההגדרות המתקדמות מאפשרות להגדיר סדרי עדיפויות עבור כל אחד מהפרמטרים ("mu0", "sigma0", "sigmav", "lambda", "bud.start", "bud.end").
      הערה: מידע נוסף בנוגע להגדרות המתקדמות ניתן למצוא בקובץ readme.txt בתיקייה CLOCCS של מאגר CLOCCS_alignment.
3. הזן את ההגדרות לשימוש עם נתוני ניצנים.
   1. בחרו בבחירה המתאימה מהתפריט הנפתח 'סוג דגם '. אפשרות ברירת המחדל Bud היא עבור מידע ניצנים סטנדרטי עבור שמרים ניצנים.
      הערה: אפשרויות מתקדמות יותר קיימות גם בתפריט הנפתח: מוטנט למידע על ניצנים עבור מוטנטים שעוברים מחזורי ניצנים מרובים ללא חלוקה, BudSSLSMR למידע על ניצנים ומידע נוסף על גוף מוט ציר וטבעת מיוזין, ו- BudNucDivNeck למידע על ניצנים ומידע נוסף על גרעיני צוואר ניצנים וחלוקה. אפשרויות מתקדמות אלה מתוארות בקובץ הקריאה של CLOCCS ובעבודות קודמות^11,14,15.
   2. ייבא את הנתונים באמצעות החלונית Data Import על-ידי הקלדה בתיבות קלט הטקסט או על-ידי העלאת קובץ על-ידי לחיצה על הלחצן Select File . העמודה הראשונה מציינת את נקודות הזמן. שתי העמודות הנותרות מציינות את נתוני ניצן ויכולות לקבל כל אחת מהאפשרויות הבאות: מספר התאים שלא ניצבו (No Bud), מספר התאים הניצנים (Bud) או מספר התאים הכולל (Total).
4. הזן את ההגדרות לשימוש עם הנתונים הציטומטריים של הזרימה. עבור כל ניסוי, הפעל את שלב 3.3 או שלב 3.4.
   הערה: ניתן להשתמש בנתונים ציטומטריים של זרימה ובנתונים ניצנים יחד. למרות שבעבר תיארנו את הרצתם יחד¹⁵, עבור כלי זה, יש להריץ אותם באופן עצמאי ולאחר מכן להשוות.
   1. המר את קבצי ה- .fcs לתבנית הקלט הנכונה של CLOCCS עבור ציטומטריית זרימה על-ידי ביצוע ההוראות בקובץ משלים 1 (נמצא גם במאגר CLOCCS_alignment כ- CLOCCS/flow_cytometry_conversion_instructions.txt).
   2. בחרו בבחירת Flow מהתפריט הנפתח Model Type .
   3. יבא את הנתונים באמצעות החלונית Data Import. לחץ על בחר קובץ ובחר את הקובץ שנוצר בשלב 3.4.1.
   4. בחר את נקודות הזמן שעבורן יש להתוות התאמת CLOCCS ציטומטרית של זרימה על-ידי בחירת נקודות הזמן בתיבה Times for Fitting .
5. לאחר שכל הקלטים נבחרו עבור ציטומטריה ניצנית או זרימה, לחץ על כפתור החל ולאחר מכן לחץ על דוגמה כפתור בחלק העליון של המסך.
6. הצג את עקומת ניצנים או תרשים ציטומטריית זרימה עם ההתאמות החזויות על-ידי בחירה בכרטיסייה התאמות חזויות . כרטיסייה זו נפתחת כברירת מחדל מיד לאחר השלב הקודם.
7. הצג את היסטוגרמות הפרמטרים עבור כל פרמטר על ידי בחירה בכרטיסייה היסטוגרמות פרמטרים ולאחר מכן בחירת כרטיסיית המשנה המתאימה לפרמטר המעניין מבין האפשרויות הבאות: mu0, delta, sigma0, sigmav, lambda, bud.start, bud.end וכו '.
8. הצג את תרשים הניקוד האחורי על-ידי בחירה בכרטיסיה ניקוד אחורי .
9. הצג את ההגדרות ושנה אותן עוד יותר על-ידי בחירה בכרטיסייה הגדרות ; הצג את יומן הרישום של הריצות הקודמות על-ידי בחירה בכרטיסיה יומן .
10. השג את פרמטרי CLOCCS מההתאמה על-ידי בחירה בכרטיסייה פרמטרים אחוריים . הטבלה המתקבלת תהיה בעלת הצורה הבאה: כל שורה מורכבת מפרמטר, כאשר השורה האחרונה היא האחורית. העמודות מורכבות מהפרמטר החזוי עבור הממוצע, רווח בר-סמך נמוך ב-2.5%, רווח בר-סמך עליון של 97.5% ושיעור הקבלה.
    1. רשום את הפרמטרים המשמשים ליישור עבור כל ניסוי: זמן ההתאוששות מסנכרון (μ₀) ותקופת מחזור התא הממוצעת של תאי האם (λ).
    2. חשב את תקופת מחזור התא על ידי חישוב הממוצע של תקופת תא האם (λ) ותקופת תא הבת (λ + δ), כאשר δ הוא העיכוב הספציפי לבת.
       הערה: חזור על סעיף 3 עם כל הניסויים שייכללו בהשוואות.

4. המרה של נקודות זמן לנקודות קו חיים באמצעות פונקציות ההמרה של Python והפרמטרים CLOCCS

הערה: המרה בין נקודות זמן ונקודות קו חיים דורשת שתי נוסחאות המרה²¹. יישום Python להמרה והדמיית נתונים זמין בריפו CLOCCS_alignment ומתואר להלן.

1. הפעל את סביבת Conda על ידי הזנת הפקודה הבאה לתוך המסוף: Conda הפעל CLOCCS_alignment
2. פתח מחברת Python אינטראקטיבית על ידי הקלדת הפקודה הבאה בטרמינל: Jupyter notebook
3. צור מחברת Python חדשה בתיקייה הרצויה.
   הערה: מחברת לדוגמה נכללה כדי להדגים שימוש סטנדרטי וניתן למצוא אותה ב- Alignment/JOVE_example.ipynb במאגר יישור CLOCCS_.
4. ייבא את קובץ Python המכיל את פונקציות היישור על-ידי הפעלת הפקודה הבאה בתא הראשון:
   %הפעל path_to_repo/cloccs_alignment/יישור/כלי שירות.py
   1. החלף את הדרך לריפו CLOCCS_alignment path_to_repo.
5. אם אתה משתמש בנתוני ניצנים כנתוני פאזת מחזור התא, יבא מסגרת נתונים המכילה את אחוז הניצנים בכל נקודת זמן על-ידי הפעלת הפקודה הבאה בתא חדש:
   budding_df = pd.read_csv("path_to_folder/budding_filename.tsv", sep ="\t", index_col=0)
   1. החלף את נתיב הקובץ ואת שם הקובץ המתאימים. אם הקובץ הוא קובץ .csv, הסר sep ="\t"
6. אם אתה משתמש בנתוני ניצנים כנתוני פאזת מחזור התא, יישר את הנתונים הניצנים לסולם זמן של נקודת חיים על-ידי הזנת הפונקציה הבאה לתא חדש:
   aligned_budding_df = df_conversion_from_parameters(budding_df, נקודות זמן, param_mu0, param_lambda)
   1. עבור נקודות זמן, החלף רשימה של נקודות הזמן באינדקס של מסגרת הנתונים budding_df.
   2. עבור param_mu0 ו- param_lambda, החליפו את הפרמטרים הנלמדים מניצני CLOCCS לרוץ בסעיף 3 עבור הניסוי.
7. אם אתה משתמש בנתוני ציטומטריה של זרימה, יבא את נתוני הציטומטריה של זרימה על-ידי הפעלת הפקודה הבאה בתא חדש:
   flow_samples = flow_cytometry_import(flow_input_folder)
   1. עבור flow_input_folder, החלף את הנתיב המתאים לתיקייה הכוללת את קובצי .fcs של ציטומטריית זרימה.
8. אם אתה משתמש בנתוני ציטומטריה של זרימה, צור טבלת המרות בין נקודות הזמן ונקודות קו החיים עבור כל ניסוי על-ידי הקלדת הפקודה הבאה בתא חדש:
   flow_converter = convert_tp_to_ll(נקודות זמן, param_mu0, param_lambda)
   1. עבור נקודות זמן, החלף רשימה של נקודות הזמן מנתוני ציטומטריית הזרימה.
   2. עבור param_mu0 ו- param_lambda, החלף את הפרמטרים הנלמדים מ- CLOCCS של ציטומטריית זרימה המופעלים בסעיף 3 עבור הניסוי.
9. יבא את מסגרת הנתונים המכילה את הנתונים הניסיוניים למחברת על-ידי הפעלת הפקודה הבאה בתא חדש:
   data_df = pd.read_csv("path_to_folder/exp_data_filename.tsv", sep ="\t", index_col=0)
   1. החלף את נתיב הקובץ ואת שם הקובץ המתאימים. אם הקובץ הוא קובץ .csv, הסר sep ="\t".
      הערה: ניתן לעשות זאת עבור כל הנתונים הטבלאיים. נתוני הניסוי חייבים פשוט לכלול את נקודות הזמן כעמודות או כאינדקס של מסגרת הנתונים. נתונים לדוגמה ניתן למצוא במאגר CLOCCS_alignment.
10. יישר את נתוני הניסוי לסולם זמן של נקודת חיים על-ידי הזנת הפונקציה הבאה לתא חדש:
    lifeline_aligned_df = df_conversion_from_parameters(data_df, נקודות זמן, param_mu0, param_lambda, אינטרפולציה, תחתון, עליון)
    1. עבור נקודות זמן, החלף רשימה של נקודות הזמן כאינדקס או בעמודות של data_df הניסוי מהשלב הקודם.
    2. עבור param_mu0 ו- param_lambda, החלף את הערכים המתקבלים בסעיף 3 מ- CLOCCS.
       הערה: הפרמטרים יכולים להגיע מכל הפעלת CLOCCS המבוצעת בכל אחד מסוגי הנתונים המקובלים של שלב מחזור התא.
    3. לחלופין, החלף אינטרפולציה ב- True או False, או השאר ריק (ברירת המחדל היא False).
       הערה: כאשר הנתונים מוגדרים כ - False, הנתונים לא יעברו אינטרפולציה. כאשר הן מוגדרות כ - True, נקודות קו החיים יעוגלו ויעברו אינטרפולציה כדי למלא את הערכים בין נקודות קו החיים, כך שתהיה נקודה למספר שלם בטווח נקודות קו החיים. הדבר מאפשר השוואה טובה יותר בין מערכי נתונים.
    4. לחלופין, החלף את lowerll ו - upperll בערכים ללא או מספרים שלמים.
       הערה: כאשר ההגדרה מוגדרת כללא, כל נקודות קו החיים לאחר אינטרפולציה נשמרות. כאשר מספרים שלמים מסופקים, פעולה זו חותכת את הנתונים כך שנקודות קו החיים נעות בין התחתון לעליון. הדבר מאפשר השוואה בין ערכות נתונים עם תחתון או עליון שונה.
11. הורד את ערכת הנתונים המיושרת לקו החיים על-ידי הזנת הפקודה הבאה לתא חדש: lifeline_aligned_df.to_csv("path_to_desired_location/name_of_file.tsv", sep = "\t")
12. חזור על שלבים 4.5-4.11 עם כל הניסויים שייכללו בהשוואות.

5. השוואת עקומות ניצנים ונתוני ציטומטריית זרימה

1. התווה את עקומות הניצנים לפני היישור באמצעות פונקציית כלי השירות Python על-ידי הזנת הפקודה הבאה לתא חדש:
   plot_budding_curves(list_of_budding_curves, list_for_legend = leg_list, point_type = str_type, title = str_title)
   1. החלף רשימה הכוללת את מסגרות הנתונים של כל עקומות הניצנים הרצויות להתוויית list_of_budding_curves-[bud_df1, bud_df2, bud_df3].
   2. החלף רשימה של תוויות עבור המקרא - [ניסוי 1, ניסוי 2, מוטנט] עבור leg_list אם תרצה. אם לא, אל תכלול או תחליף ללא.
   3. החלף זמן str_type.
   4. החלף כותרת מחרוזת עקומות ניצני השוואה ב- str_title אם תרצה בכך. אם לא, החלף ללא, או אל תכלול.
2. התווה את עקומות הניצנים לאחר היישור באמצעות פונקציית כלי השירות Python על-ידי ביצוע ההוראות בשלב 5.1, אך עם רשימה של עקומות ניצניות מיושרות שהוחלפו ב- list_of_budding_curves ובקו חיים עבור point_type במקום זמן.
3. כדי להתוות את נתוני הציטומטריה של הזרימה, התווה את הנתונים המשויכים מקבצי .fcs בנקודות קו החיים המתאימות באמצעות הממיר שנוצר בשלב 4.8.
4. המר את נקודות קו החיים לשלב מחזור התא באמצעות טבלת הממיר (טבלה 1).
   הערה: ניתן גם להתוות זאת על-ידי ביצוע ההוראות בשלב 5.1, אך עם שלב עבור point_type במקום זמן.

6. השוואת נתוני הניסוי

1. לקבוע את רשימת הגנים שיש לשרטט בגרפים הקוויים בהתבסס על מידע ספרותי או על הגנים המעניינים את המחקר.
2. השתמש plot_linegraph_comparison שסופקו בקובץ כלי השירות של Python כדי לבצע השוואות בין תרשימי קו במסגרת הנתונים המקורית, המיושרת או המיושרת והאינטרפולציה על-ידי הקלדת הפקודה הבאה בתא חדש:
   plot_linegraph_comparison(list_of_dfs, list_for_legend, genelist, point_type = str_type, title = str_title)
   1. החלף רשימה של מסגרות הנתונים של הניסויים שיש להשוות עבור list_of_dfs.
      הערה: מסגרות הנתונים יכולות להיות לא מיושרות או מיושרות; עם זאת, יש להזין את point_type המתאים בשלב 6.2.4.
   2. החלף רשימה של הכותרות לכל מסגרת נתונים באותו סדר כמו רשימת מסגרות הנתונים עבור list_for_legend.
   3. החלף רשימה של שמות הגנים (שיש לכלול באינדקס של מסגרות הנתונים) כדי להתוות עבור גנליסט.
   4. החלף את סוג הנקודה ב- str_type. השתמש בקו חיים (ברירת המחדל היא קנה מידה של נקודת קו חיים) או בפאזה (קנה המידה של קו החיים של שלב מחזור התא) עבור מסגרות הנתונים המיושרות בשלב 6.2.1 או בזמן עבור מסגרות הנתונים הלא מיושרות בשלב 6.2.1.
   5. החלף כותרת מחרוזת אופציונלית ב- str_title.
3. קבע את רשימת הגנים שייכללו במפת החום באמצעות הספרות או האלגוריתמים כדי לקבוע את הגנים המחזוריים המובילים.
   הערה: לצורך השוואות נכונות של מפת חום, הנתונים צריכים להיות מיושרים, אינטרפולציה ומותאמים לציר הזמן בשלב 6.2; זה צריך להיות אותו ערך קו חיים התחלה וסיום עבור כל ניסוי.
   1. הפעל אלגוריתמים מחזוריים כדי לקבוע את הגנים המחזוריים המובילים^23,24, או השתמש בשיטות החלופיות הרצויות כדי לקבוע את רשימת הגנים (כלומר^, תוצאות ספרות).
   2. יבא קובץ רשימת גנים .csv או .tsv למחברת באמצעות הפקודה הבאה בתא חדש:
      sort_df = pd.read_csv("path_to_folder/sorting_filename.tsv", sep="\t", index_col=0)
   3. החלף את נתיב הקובץ ואת שם הקובץ המתאימים. אם הקובץ הוא קובץ .csv, הסר sep="\t".
4. השתמש בפונקציה שסופקה plot_heatmap_comparison בקובץ כלי השירות של Python כדי לבצע השוואת מפת חום במסגרת הנתונים המיושרת, האינטרפולציה ומיושרת הפאזה על-ידי הקלדת הפקודה הבאה בתא חדש:
   plot_heatmap_comparison(list_of_dfs, list_for_legend, genelist, title = str_title)
   1. החלף רשימה של מסגרות הנתונים המיושרות של הניסויים להשוואה עבור list_of_dfs.
   2. החלף רשימה של הכותרות לכל מסגרת נתונים באותו סדר כמו רשימת מסגרות הנתונים עבור list_for_legend.
   3. החלף רשימה של שמות הגנים (שיש לכלול באינדקס של מסגרות הנתונים) כדי להתוות עבור גנליסט.
   4. החלף כותרת מחרוזת אופציונלית ב- str_title.
      הערה: מסגרת הנתונים הראשונה ברשימה היא זו שתשמש לסידור הגנים במפת החום. הגנים יהיו מסודרים לפי המקסימום בתקופה הראשונה עבור אותה מסגרת נתונים, ואותו סדר ישמש למסגרות הנתונים הבאות ברשימה.

Results

השלבים המתוארים בפרוטוקול לעיל ובזרימת העבודה באיור 1 יושמו על חמישה ניסויים מסונכרנים בסדרות זמן של מחזור התא כדי להדגים שתי השוואות מייצגות: בין שכפולים בשיטות סינכרוניות שונות (פרומון הזדווגות ואלוטריציה צנטריפוגלית¹⁸) לבין פלטפורמות ריצוף (ריצוף RNA [RNA-seq] ומיקרו-מערך), כמו גם על פני תנאי ניסוי. ניסויים מרובים בוצעו עם S. cerevisiae, ונאספו נתונים בשלב מחזור התא ובניסוי עבור כל ניסוי. זרימת העבודה כוללת שימוש ב- CLOCCS כדי ליצור פרמטרים לניסויים השונים...

Discussion

מאמר זה מציג שיטה להערכה מדויקת וכמותית יותר של נתונים מניסויים בסדרות זמן על אוכלוסיות מסונכרנות של תאים. השיטה משתמשת בפרמטרים שנלמדו מ-CLOCCS, מודל היסק בייסיאני המשתמש בנתוני פאזות של מחזור תאי קלט, כגון נתוני ניצנים ונתוני תוכן DNA ציטומטרי של זרימה, כדי לקבוע פרמטרים לכל ניסוי^14,15. CLOCCS משתמשת בנתוני הפאזה של מחזור תאי הקלט כדי להסיק את הפרמטרים עבור כל ניסוי, אשר משמשים לאחר מכן ליישור לקנה מידה משותף של קו חיים. המרת ניסויים מרובים של סדרות זמן סינכרונ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2x PBS			לפתרון מקבע. מתואר ב-Leman 2014.
פורמלדהיד			לתמיסה מקבעת.
100% אתנול			לקיבוע ציטומטריית זרימה. מתואר ב-Haase 2002.
CLOCCS			https://gitlab.com/haase-lab-group/cloccs_alignment.git
ציטומטר			לפרוטוקול ציטומטריית זרימה.
Git			https://git-scm.com/
Java 19
https://www.oracle.com/java/technologies/downloads/#java19 מיקרוסקופ			לספירת תאים וניצנים.
תמיסת Miniconda			https://docs.conda.io/en/latest/
פרוטאז			לפרוטוקול זרימה ציטומטרית. מתואר ב-Haase 2002.
RNAse פתרון			לפרוטוקול זרימה ציטומטרית. מתואר ב-Haase 2002.
SYTOX צבע חומצת גרעין ירוקה	Invitrogen	S7020	לצביעה ציטומטרית זרימה. מתואר ב-Haase 2002.
טריס			pH 7.5