Method Article

מיפוי ההתפלגות התאית של חלבון אופטוגנטי באמצעות רשת גירוי אור

DOI:

10.3791/65471

⸱

January 26th, 2024

 ,  ,  , 
1Department of Pharmacology and Chemical Biology, University of Pittsburgh School of Medicine, 2Addgene

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה כולל טרנספקציה של חיישני cAMP ו-bPAC-nLuc, חלבון אופטוגנטי, כדי לעקוב במדויק אחר התפלגות התאים שלו ותגובתו לגירוי האור. הגישה החדשנית של יצירת מפת תגובה cAMP באמצעות מערכת סריקה נקודתית טומנת בחובה פוטנציאל לקידום המחקר עם חלבונים אופטוגנטיים בתחומים שונים.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המטרה שלנו הייתה לעקוב במדויק אחר ההתפלגות התאית של חלבון אופטוגנטי ולהעריך את הפונקציונליות שלו במיקום ציטופלזמי ספציפי. כדי להשיג זאת, ביצענו טרנספקט משותף עם חיישני cAMP ממוקדים גרעיניים וחלבון אופטוגנטי שפותח במעבדה שלנו, אדניליל ציקלאז-ננו-לוציפראז (bPAC-nLuc). bPAC-nLuc, כאשר מגורה עם מצעי אור או לוציפראז של 445 ננומטר, מייצר אדנוזין מונופוספט 3',5'-מחזורי (cAMP). השתמשנו במאיר לייזר במצב מוצק המחובר למערכת סריקה נקודתית שאפשרה לנו ליצור תבנית רשת/מטריצה של כתמים מוארים קטנים (~1 מיקרומטר2) לאורך הציטופלזמה של תאי HC-1. על ידי כך, הצלחנו לעקוב ביעילות אחר התפלגות bPAC-nLuc ממוקד גרעיני וליצור מפת תגובה מקיפה של cAMP. מפה זו ייצגה במדויק את ההתפלגות התאית של bPAC-nLuc, ותגובתה לגירוי האור השתנתה בהתאם לכמות החלבון בנקודה המוארת. גישה חדשנית זו תורמת להרחבת ארגז הכלים של הטכניקות הזמינות לחקר חלבונים אופטוגנטיים תאיים. היכולת למפות את תפוצתו ותגובתו בדיוק רב היא בעלת פוטנציאל מרחיק לכת ועשויה לקדם תחומי מחקר שונים.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אופטוגנטיקה, שנולדה ככלי שחולל מהפכה במדעי המוח, היא כיום תחום מחקר צומח וטכנולוגיה עולה המשמשת באופן שגרתי מעבדות רבות ברחבי העולם ובתחומי מחקר שונים בביולוגיה. פיתחנו bPAC-nLuc, חלבון אופטוגנטי רב-תכליתי, על ידי מיזוג אדניליל ציקלאז רגיש לאור (AC) מ-Beggiatoa sp. (אדניליל ציקלאז חיידקי הניתן לפוטו-אקטיבי; bPAC) לננו-לוציפראז (nLuc)1,2,3. כאשר מגורה באור כחול, bPAC מייצר את השליח השני 3',5'-אדנוזין מונופוספט מחזורי (cAMP). nLuc הוא לוציפראז קטן שפותח לאחרונה, שבנוכחות אחד מהסובסטרטים שלו, יכול לייצר ביולומינסנציה ולהפעיל cAMP production4. לפיכך, ניתן להפעיל חלבון אופטוגנטי זה באופן חולף על ידי שימוש בפולסי אור קצרים או בהתמדה עם Furimazine או מצעי לוציפראז אחרים, מה שמאפשר לנו לחקות דפוסי איתות cAMP שונים ולהעריך תגובות תאיות (הפעלת גורמי שעתוק, ביטוי גנים, התפשטות תאים, נדידה וכו'). ההתקדמות האחרונה באיתות שליח שני הדגישה את המשמעות של אירועים המתרחשים באזורים ציטוזוליים מוגבלים מאוד (למשל, ייצור cAMP אנדוזומי עבור זרחון חלבון קושר יסודות (CREB) של תגובת cAMP או מיקרו-דומיינים של Ca2+ להעברת גורם גרעיני של תאי T מופעלים (NFAT) לגרעין)5,6. לכן, חשוב לפתח אסטרטגיות עקביות ושיטתיות להערכה, חיקוי וחסימת איתות מהתאים הללו בתאים חיים. כדי להראות את היכולת של bPAC-nLuc להיות מופעל באופן ספציפי בתאי תאים שונים, ביצענו העברה משותפת של קו תאים שמקורו בהפטומה (HC-1) עם bPAC-nLuc ממוקד גרעיני ו-H208, חיישן cAMP להעברת אנרגיית תהודה של Förster (FRET) (NLS-bPAC-nLuc; NLS-H208). תאי HC-1 הנובעים מקו ה-HTC נטולי פעילות AC הניתנת לבדיקה, מה שמביא לרמות cAMP בסיסיות נמוכות מאוד, מה שהופך אותו לאידיאלי למדידת ייצור cAMP משוער תוך ניצול הטווח הדינמי המלא של חיישני FRET7,8. באמצעות לייזר מצב מוצק (445 ננומטר, LDI-7, 89 צפון) המחובר למערכת סריקת נקודות (UGA-42 Geo, Rapp OptoElectronic), אנו מתארים פרוטוקול לגירוי שיטתי של אזורים מעגליים קטנים מאוד או כתמים (~1 מיקרומטר2) בתוך תאים בודדים. מערכת סריקת הנקודות הייתה מחוברת לאחת היציאות האחוריות של מיקרוסקופ דו-סיפוני שאפשרה לנו לעורר תאים ולבצע מדידות FRET בו זמנית באמצעות נתיב אור עצמאי. אנו מציגים שיטה בפרוטוקול זה שבה נעשה שימוש בתוכנת SysCon Geo, המסופקת עם מערכת הגירוי על ידי Rapp OptoElectronic, לביצוע סריקה מקיפה של הציטופלזמה של התאים. הגישה כוללת יצירת מפת תגובת cAMP על ידי הגדרת רצף של הארות המגרות תאים בתבנית רשת (איור 1).

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. תרבית תאים HC-1 והכנה להדמיה

  1. שמור על תאי HC-1 ב-DMEM בתוספת 10% סרום בקר עוברי (FBS), פניצילין (100 יחב"ל/ליטר), סטרפטומיצין (100 מ"ג/ליטר) ו-L-גלוטמין בכלים של 10 ס"מ ומודגר ב-37 מעלות צלזיוס, 5%CO2, ב-95% אוויר לח.
  2. העבירו את התאים כל 2-4 ימים ברגע שהתאים מתכנסים ~90% באמצעות דילולים של 1:5 או 1:10.
  3. תאי זרעים לטרנספקציה על כיסויי זכוכית יומיים לפני הניסוי.
    1. עבודה בתנאים סטריליים במכסה מנוע של תרבית רקמות עם מדיה מחוממת מראש ו-PBS, שואבים את המדיה מצלחת תאים כמעט מתכנסת ושוטפים בעדינות עם 5 מ"ל PBS.
    2. שאפו את ה-PBS והוסיפו 1 מ"ל טריפסין. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 3-5 דקות עד שהתאים מתנתקים.
    3. השעו מחדש את התאים ב-4 מ"ל מדיה והעבירו את תרחיף התאים לצינור חרוטי של 15 מ"ל.
    4. השתמש בהמוציטומטר כדי לספור את מספר התאים ולחשב את צפיפות התאים.
    5. לדלל את התאים לצפיפות של 1.5 x 104 תאים/מ"ל.
    6. פיפטה 2 מ"ל של מתלה התא על כיסויי זכוכית 25 מ"מ עם ציפוי פולי-D-ליזין בצלחת של 6 בארות.
    7. דגרו על התאים במשך כ-24 שעות בחממה עד למפגש של 70%.
  4. העבר את התאים באמצעות ערכת טרנספקציה בהתאם להוראות היצרן באמצעות יחס של 0.25 מיקרוגרם של NLS-bPAC-nLuc DNA/0.75 מיקרוגרם של NLS-H208 DNA לכל 3 מיקרוליטר של מגיב טרנספקציה ו-2 מיקרוליטר של מגיב P3000 מדולל במדיה Opti-MEM חסרת פנול אדום.
  5. הנח את התאים בחממה למשך ~48 שעות כדי לאפשר ביטוי מספיק של bPAC-nLuc, החיוני להפקת רמות ניתנות לזיהוי של cAMP.
    הערה: הרמה המינימלית הנדרשת של ביטוי bPAC-nLuc תשתנה בהתאם לעוצמת מערכת הגירוי והפרמטרים של הגירוי.
  6. הכן תאים על כיסויים להדמיה.
    1. שאפו את המדיה מבאר אחת ושטפו פעמיים עם 2 מ"ל PBS.
    2. הרם בזהירות את משטח הכיסוי באמצעות זוג מלקחיים והנח אותו בתא ההדמיה.
    3. הוסף 1 מ"ל של Opti-MEM חסר פנול אדום לתא ההדמיה. ניתן לדמות תאים גם ב-HBSS או בכל תמיסה פיזיולוגית אחרת התואמת פלואורסצנטיות.

2. הדמיית אור והדמיית תאים חיים

  1. לבצע תרבית תאים ומניפולציה של תאים המבטאים NLS-bPAC-nLuc בסביבה חשוכה. כדי למנוע חשיפה לאורכי גל <500 ננומטר, השתמש במנורת פנס אדום (טבלת חומרים) עם נורת פלואורסצנטי קומפקטית בצבע ענבר 13 וואט (טבלת חומרים).
  2. בצע ניסויים במיקרוסקופ דו-סיפוני ממונע (טבלת חומרים) המצויד במנוע אור מרובה LED בעל 6 שורות (טבלת חומרים), גלגל מסנן פליטה (טבלת חומרים), שלב XY (טבלת חומרים), מצלמת CMOS דיגיטלית ORCA-Fusion (טבלת חומרים), ומטרת שמן 100x/1.4 NA (∞/0.17/FN26.5). צלם תמונות באמצעות תוכנת מיקרוסקופיה דיגיטלית (טבלת חומרים). מערך זה מסוגל לעורר תאים ולבצע מדידות FRET בו זמנית על ידי שימוש בנתיב אור עצמאי המסופק עם מסנן דיכרואי ZT458rdc (טבלת חומרים).
    הערה: ניתן להשתמש בכל מערך רכישה אם הוא מאפשר גירוי אופטוגנטי בו זמנית והדמיה FRET/אינטנסיביות עם חיישן תואם.
  3. הפעל את UGA - 42 Geosystem. הפעל את המיקרוסקופ והגדר אותו עם הפרמטרים המתאימים לרכישה עם חיישן H208 FRET. תצורת הרכישה תהיה תלויה ברמות הביטוי של חיישן ה-FRET. הפרמטרים האופייניים הם זמן סימולציה של 40 אלפיות השנייה עבור YFP/mScarletI, 15% הספק LED ו-0.5 הרץ.
  4. פתח את תוכנת SysCon ואת תוכנת ההדמיה השולטת במיקרוסקופ.
  5. בחלון מצלמה, בחר בכרטיסייה כיול ובחר את אורך גל הלייזר התואם לחלבון האופטוגנטי. כדי לעורר את bPAC-nLuc, השתמש באורך גל של 445 ננומטר.
  6. כייל את המערכת לפני כל שימוש. זה חשוב מכיוון ששינויים קטנים בהגדרה, או אפילו שינויים בטמפרטורת החדר (RT), יכולים לשנות את דיוק הגירוי.
  7. בחלון המצלמה, בחר בכרטיסייה מצלמה ולחץ על <התחל רכישה> כדי להתחיל את הרכישה מתוכנת הדמיון.
  8. בחלון מציג התמונות, דמיין רכישה חיה או קודמת של הקרינה של התאים שנלקחו מתוכנת ההדמיה, שתנחה את המיקום של אובייקטי הגירוי.
  9. השתמש במצב Click and Fire כדי להעריך במהירות את ההיענות של תא בודד לפני תחילת הניסוי.
  10. באמצעות חלון מנהל הרצפים, בחר <הוסף> כדי ליצור רצף חדש.
    הערה: כדי לוודא כיול תקין של המערכת, צייר צורות וגדלים שונים בחלון מציג התמונות. אלה צריכים להתאים במדויק לדפוסי הגירוי המוקרנים על התאים, ולהבטיח יישור מדויק עם העיצוב המיועד.
  11. בחלון מציג התמונות , בחר בסמל עגול בסרגל הכלים משמאל כדי לצייר אובייקטים לגירוי מעגלי.
  12. צור מספר עיגולים זהים קטנים והפץ אותם באופן שווה כדי להבטיח כיסוי הומוגני של כל הציטופלזמה של התאים שיש לעורר.
  13. לחץ לחיצה ימנית על כל אחד מהם כדי לאמת את ההומוגניות של אובייקטי הגירוי המעגלי. יופיע חלון; השתמש בו כדי לבחון את הרדיוס, המיקום וכו '.
  14. הגדר את הרדיוס בין 1 ל-5, בהתאם למטרה המשמשת ולגודל התא.
  15. כדי לסייע בריווח השווה וביישור של העיגולים, השתמש בלחצן <הצמד לרשת> בחלון המשנה תצוגה. בנוסף, הגדר את מאפייני הרשת באמצעות לחצן <הגדר רשת>.
  16. ודא שהרשת או המטריצה של אובייקטים לגירוי מעגלי במרווחים שווים מכסים את התא במלואו, וגודלו (למשל, 6 x 6 או 10 x 10) נקבע על פי גודל התא. כבקרה לגירוי אפס שלא אמור לעורר אירועים תאיים, כלול כמה עיגולים הממוקמים מחוץ לתא.
  17. כל אובייקט שנוצר בחלון מציג התמונות יופיע בחלון ציר הזמן.
    1. בחלון המשנה תזמון אובייקט, הגדר את המאפיינים הזמניים של כל אובייקט גירוי (שעת התחלה, משך, השהיה).
    2. בחלון המשנה Lightsource, הגדר את אורך הגל והעוצמה של כל אובייקט. עבור פרוטוקול זה, ודא שכל אובייקט משתמש באותו אורך גל וזהה במשך ובעוצמה. זמן ההתחלה יהיה שונה עבור כל אובייקט, והעיכוב ביניהם יכול להשתנות בהתאם לתוצאה הצפויה כדי למנוע הטלת ההשפעה של גירויים שונים.
  18. בחלון ציר הזמן, שנה את הרצף שבו כל אובייקט גירוי יופעל במידת הצורך. הגדר גירויים בדפוס קבוע (למשל, משמאל לימין, מלמעלה למטה) או בדפוס אקראי, בהתאם לניסוי המסוים.
  19. העלה את הרצף למערכת והגדר את מספר מחזורי הרצף (הפעלות) שהמערכת תבצע.
  20. מקם את אזורי העניין (ROI) בתוכנת ההדמיה במיקומים הרצויים.
  21. התחל לרכוש תמונות פלואורסצנטיות עם המיקרוסקופ ולחץ על <הפעל> בחלון UGA-42.

3. ניתוח נתונים

  1. למרות שהתוכנה המסופקת על ידי מערכת הגירוי מאפשרת שמירת רצפים לשימוש נוסף, היא אינה מתעדת את מידע הניסוי בפועל. לכן, תעד בקפידה את כל הפרטים הקשורים לנקודות הגירוי והרצפים שהופעלו במהלך הניסוי, כולל פרמטרים כמו מיקום, עוצמה, משך זמן, מספר ריצות וכו'. לתעד כל תנאי ניסוי רלוונטיים אחרים, כגון חומרים פרמקולוגיים או פתרונות ספציפיים.
  2. במהלך הניסוי, מקם את החזר ה-ROI הייעודי בתוכנת ההדמיה כדי ללכוד שינויים בעוצמת הקרינה מהתא כולו או ממיקומים ספציפיים בתוך התאים.
  3. שימו לב במיוחד למיקום ההחזר על ההשקעה ביחס לנקודות הגירוי. מדוד את השינויים בעוצמת הקרינה בתוך או רחוק מהאזורים המגורים. התאם את מיקומי ההחזר על ההשקעה לאחר הניסוי, וספק את תוכנת ההדמיה כדי לאפשר שמירת תמונות שנרכשו במהלך הניסוי ולא רק את ערכי עוצמת ההחזר על ההשקעה.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

התוצאות המוצגות באיור 1 מראות שרק גירויים שכוונו לגרעין התא הצליחו ליצור עליות cAMP מדידות. זה מאשר ש-NLS-bPAC-nLuc מתבטא אך ורק בתא הגרעיני של תאי HC-1. ניתן לעורר במדויק חלבון אופטוגנטי באמצעות תבנית רשת/מטריצה זו כדי למפות את התפלגות התוך תאית שלו. בנוסף, הגבהים הגבוהים יותר של cAMP לכיוון המרכז הגרעיני משקפים את המסה הגבוהה יותר של bPAC-nLuc המדומות על ידי נקודות מרכזיות בהשוואה לאלו הממוקמות בפריפריה הגרעינית (<מחלקה חזקה = "xfig">איור 1).

figure-results-1
איור 1: פרוטוקול גירוי הרשת ומפת התגובה של cAMP. גירויים רציפים של אור כחול (445 ננומטר; מרווח של 30 שניות בין פולסים; רכבת פולסים: 50 אלפיות השנייה, משך כולל של 500 אלפיות השנייה, 10 הרץ, 7% עוצמת לייזר) על תאי HC-1 שהועברו עם NLS-H208 (חיישן cAMP) ו-NLS-bPAC-nLuc. הפאנל השמאלי מציג את הקרינה של החלבון הפלואורסצנטי הצהוב (YFP) מה-H208, שהונח על גבי פולסי האור בפועל שנלכדו על ידי מצלמת sCMOS המיוצגת בתמונה אחת. עקבות מימין מראים עליות cAMP חולפות המופעלות על ידי גירוי NLS-bPAC-nLuc בכל נקודת גירוי. הקרינה של NLS-H208 ברקע נמדדה באמצעות החזר ROI יחיד המכסה את כל הגרעין, וחושבו יחסים מנורמלים (R/R0). התגובות באזורים החיצוניים (שורות 1 ו-7, עמודות A ו-G) היו שליליות ואינן מוצגות. בר = 3 מיקרומטר. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מטרת מחקר זה הייתה לנטר במדויק את ההתפלגות התוך תאית של חלבון אופטוגנטי ולהעריך את ביצועיו בתוך תא ציטופלזמי מסוים. הראינו גם את יכולות הגירוי המדויקות של מערכת סריקת נקודות על תאים המבטאים חלבון אופטוגנטי. כדי להשיג זאת, השתמשנו ב-bPAC-nLuc ממוקד גרעיני עם רמות ביטוי גבוהות אך פיזור מוגבל מאוד מוגבל לגרעין. התוצאות הראו שנקודות גירוי המופרדות על ידי ~1 מיקרומטר בלבד יכולות לעורר ייצור cAMP או לא, תלוי בהתפלגות התאית של החלבון האופטוגנטי; רק גירויים שכוונו לגרעין הצליחו להעלות את רמות ה-cAMP. בפרוטוקול זה, המטרה לא הייתה ליצור עליות cAMP מקומיות אלא להראות שגירוי אור קצר יכול להיות מדויק מספיק כדי להפעיל חלבונים אופטוגנטיים באזורים מוגבלים מאוד של התא מבלי לעורר את החלבונים שמסביב. עם זאת, גישה זו מהווה בקרה הכרחית לחקר חלבונים אופטוגנטיים אחרים עם התפלגויות מפוזרות ו/או יצירת עליות cAMP מקומיות. ניתן להשיג זאת על ידי שינוי רמות הביטוי של החלבון האופטוגנטי, עוצמת ותדירות הגירוי וכו'. כדי למדוד במדויק את האותות המקומיים הללו, יש חשיבות מדוקדקת בפרמטרי הרכישה ובמאפייני החיישנים. זה כולל בחירת מיקומים וגדלים מתאימים של החזר ROI, קביעת תדר הרכישה ובחירת חיישני FRET/אינטנסיומטריים עם זיקה, עוצמה, תחום דינמי וקבוע דיסוציאציה אופטימליים.

במאמר שפורסם לאחרונה, השתמשנו באסטרטגיה דומה כדי להדגים פונקציונלית את ההתפלגות של bPAC-nLuc ממוקד גרעיני ואת היכולת של פוספודיאסטראז מותאם (PDE; ΔRI-PDE8) לבטל עליות cAMP בקו תאים שמקורו בבלוטת התריס9. במאמר זה, ביצענו גירוי תאים לאורך קו ישר במקום רשת, ונקודות התאורה הוצבו ביחס לנקודות ציון תאיות (למשל, מרכז גרעיני, קצה גרעיני וכו') ולא בתבנית שיטתית. למרבה הפלא, אפילו גירויים שכוונו לקצה הגרעיני לא היו מספיקים כדי לעורר תגובת cAMP ניתנת לזיהוי. הסקנו שזה כנראה נובע מגירוי מסה לא מספקת של NLS-bPAC-nLuc9. עם זאת, בפרוטוקול הנוכחי, כמה גירויים שכוונו לקרבת הקצה הגרעיני עוררו עלייה ניתנת לזיהוי של cAMP. ניתן לייחס פער זה לגורמים שונים, כולל רמות הביטוי של bPAC-nLuc, מאפייני הגירוי, המורפולוגיה של הגרעין, נוכחות של PDEs אנדוגניים, חלבוני חיץ וכו'.

בעוד שחלבונים אופטוגנטיים ממוקדים או לא ממוקדים אחרים עשויים להציג התפלגויות מפוזרות יותר, גישה שיטתית זו תומכת בהסקת מסקנות משמעותיות על ידי הגדרת ניסויים בקפידה וניתוח הנתונים. יתר על כן, גישה זו מאפשרת להתמקד במבנים תאיים מיוחדים (למשל, lamellipodia, דנדריטים, ריסים ראשוניים וכו'), מה שמקל על השוואות בין תגובות באזורים הדיסטליים והפרוקסימליים של מבנים אלה ו/או גוף התא.

ניתן להשתמש באסטרטגיה זו גם כדי להעריך את ההפעלה של אלמנטים במורד הזרם במסלול cAMP, כגון חלבון קינאז A (PKA) או חלבון ההחלפה המופעל ישירות על ידי cAMP (EPAC1). יתר על כן, מכיוון ש-bPAC-nLuc אינו מושפע מאותם מודולטורים כמו ACs אנדוגניים, שיכולים להיות מושפעים מאינטראקציות מקומיות עם חלבונים או גורמים אחרים, ניתן להניח שהוא מייצר באופן עקבי את אותה כמות של cAMP בהינתן אותה רמת ביטוי. על ידי בחינת הפחתת גבהי cAMP או הירידה ברמות cAMP לאחר עלייה זמנית, גישה זו מאפשרת הערכה של פירוק cAMP, דיפוזיה או הפונקציונליות וההפצה של PDEs אנדוגניים או טרנספקטיביים. אסטרטגיה זו מוכיחה את עצמה כשימושית במיוחד להערכת התנהגותו של כל חלבון אופטוגנטי במיקומים תאיים שונים, ועוזרת למנוע את ההטיה של מיקום שרירותי של נקודות גירוי בתוך הציטופלזמה.

חשוב לקחת בחשבון שגודל נקודת הגירוי והאנרגיה שלה יהיו תלויים בסופו של דבר במאפיינים הספציפיים של המערך בו נעשה שימוש (נתיבי אור, יעדים, מערכת סריקה וכו'). כדי להבטיח תוצאות מדויקות, יש לקחת בחשבון את הביטוי היחסי של החלבון האופטוגנטי, את רגישות התאים לאורך הגל בו נעשה שימוש וכל פרמטר אחר בעת ביצוע כל ניסוי בכל מערכת מסוימת. כמו כן, חשוב לציין שלא חקרנו את המידה המלאה שבה ניתן להניע את המערכת ביישום נקודות גירוי קטנות יותר ו/או רשתות צפופות יותר (כלומר, נקודות גירוי פחות מרווחות) כדי להעריך באופן שיטתי מבנים תאיים קטנים יותר בדיוק מוגבר. בנוסף, בדקנו אסטרטגיה זו באמצעות מערכת סריקת הנקודות הגיאוגרפיות UGA-42 בלבד. גישה זו עשויה להיות אפשרית באמצעות מערכות שונות, בתנאי שהן יכולות ליצור באופן שחזורי נקודות מקומיות במרווחים שווים. יש לבצע אופטימיזציה של כל מערכת כדי להניב תוצאות דומות.

לבסוף, יש להעריך בקפידה את הגירוי הפוטנציאלי של חיישני FRET על ידי מערכת הגירוי. לדוגמה, חלבון פלואורסצנטי ציאן (CFP) בהחלט יעורר או אפילו יולבן על ידי לייזר 445 ננומטר המשמש בפרוטוקול זה. השימוש בעוצמות לייזר גבוהות יותר (או מסנני צפיפות ניטרלית גבוהה יותר (ND)) יגדיל את הסיכוי לעורר את החיישנים הפלואורסצנטיים ולהכניס מידע כוזב לניסוי ו/או ליצור בעיות בניתוח הנתונים. יש להעריך בקפידה גם את ההלבנה הרגילה של חיישני FRET/אינטנסיביות. לבסוף, מכיוון ש-bPAC יכול להיות רגיש לאור הסביבה ולייצר cAMP גם בתנאי חושך (הפעילות הכהה של bPAC נמדדה כ-33 ±-5 pmol/min/mg של חלבון3), יש לתמרן את התאים בזהירות לאחר העברת bPAC-nLUC כדי למנוע זיהום אור (למשל, באינקובטור, לפני ו/או במהלך ניסויים וכו'). לחלופין, ניתן לדגור תאים עם מעכב PDE (למשל, 3-איזובוטיל-1-מתילקסנטין; IBMX10) כדי לקבוע את הפעילות הבסיסית של bPAC-nLuc ולאשר שתנאי התאורה המשמשים כהים כראוי.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין אינטרסים מתחרים.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המימון ניתן על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) מענקי R01 GM099775 ו-GM130612 ל-D.L.A.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
נורת פלואורסצנטית קומפקטית ענבר 13 W - אורות כחולים נמוכיםפיתוחים פוטוניים 
3-איזובוטיל-1-מתילקסנטין (IBMX)SigmaI7018
6 שורות Multi-LED Lumencor Spectra XLumencor מנוע תאורת 6 שורות מרובה LED 
קורנינג - DMEM תרמו פישרMT10013CMEA
קורנינג - סרום בקר עוברי רגילתרמו פישרMT35011CV
כיסוי כוסות: עיגוליםתרמו פישר12545102P
GBX-2 מסנן אור בטוח אדום כהה 5.5 אינץ' מנורת קודאק1416827 אדומה   
תמיסת מלח מאוזנת של הנקס (HBSS) 10xתרמו פישר14185052מדולל ל-1x, pH מותאם
LDI-789 צפון
L-גלוטמיןתרמו פישרBW17605E
ליפופקטמין 3000 ערכת טרנספקציהL3000001 תרמו פישר
אולימפוס IX83 ממונע  שני סיפונים  מיקרוסקופ מיקרוסקופ דו-סיפוני ממונעאולימפוס
Opti-MEM, ללא פנול אדוםThermo Fischer11058021
מצלמת CMOS דיגיטלית ORCA-fusion HamamatsuC14440-20UP
פניצילין-סטרפטומיצין (10,000 U/mL)פוספט Thermo Fischer
(1x)Lonza17516F
ערכות גלגלי מסנן ומסננים עם פליטה קודמתPrior Scientific, Inc.גלגל מסנן פליטה 
קודם  Proscan XY שלבפריור סיינטיפיק, בע"משלב XY 
Slidebook 6הדמיה חכמהתוכנת מיקרוסקופיה דיגיטלית
תוכנת SysConתוכנת SysConהמסופקת על ידי מערכת הגירוי 
UGA-42  גיאו Rapp OptoElectronic
UPlanSApo 100xOlympus100x/1.4 NA מטרת שמן (∞/0.17/FN26.5)
ZT458rdc dichroic Chroma Technology CorpBS, אורך גל (CWL):  498 ננומטר
  תמיסת חוצץ 15140122 חידושי תוכנת

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Naim, N., et al. Luminescence-activated nucleotide cyclase regulates spatial and temporal cAMP synthesis. The Journal of Biological Chemistry. 294 (4), 1095-1103 (2019).
  2. Naim, N., Reece, J. M., Zhang, X., Altschuler, D. L. Dual activation of cAMP production through photostimulation or chemical stimulation. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J). 2173, 201-216 (2020).
  3. Stierl, M., et al. Light modulation of cellular cAMP by a small bacterial photoactivated adenylyl cyclase, bPAC, of the soil bacterium Beggiatoa. The Journal of Biological Chemistry. 286 (2), 1181-1188 (2011).
  4. Hall, M. P., et al. Engineered luciferase reporter from a deep sea shrimp utilizing a novel imidazopyrazinone substrate. ACS Chemical Biology. 7 (11), 1848-1857 (2012).
  5. Liccardo, F., Luini, A., Di Martino, R. Endomembrane-based signaling by GPCRs and G-proteins. Cells. 11 (3), 528(2022).
  6. Groschner, K., Graier, W. F., Romanin, C. Store-operated ca(2)+ entry (SOCE) pathways. , Springer, Vienna. (2017).
  7. Ross, E. M., Howlett, A. C., Ferguson, K. M., Gilman, A. G. Reconstitution of hormone-sensitive adenylate cyclase activity with resolved components of the enzyme. The Journal of Biological Chemistry. 253 (18), 6401-6412 (1978).
  8. Insel, P. A., Maguire, M. E., Gilman, A. G., Bourne, H. R., Coffino, P., Melmon, K. L. Beta adrenergic receptors and adenylate cyclase: products of separate genes. Molecular Pharmacology. 12, 1062-1069 (1976).
  9. Pizzoni, A., Zhang, X., Naim, N., Altschuler, D. L. Soluble cyclase-mediated nuclear cAMP synthesis is sufficient for cell proliferation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 120 (4), e2208749120(2023).
  10. Keravis, T., Lugnier, C. Cyclic nucleotide phosphodiesterase (PDE) isozymes as targets of the intracellular signalling network: benefits of PDE inhibitors in various diseases and perspectives for future therapeutic developments. British Journal of Pharmacology. 165 (5), 1288-1305 (2012).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Optogenetic Protein MappingLight Stimulation GridCyclic AMP SignalingbPAC nanoluciferaseNuclear Targeted ProteinFRET MeasurementsFluorescence ImagingSubcellular ActivationMotorized MicroscopeCellular Distribution

Related Articles