פרוטוקול זה כולל טרנספקציה של חיישני cAMP ו-bPAC-nLuc, חלבון אופטוגנטי, כדי לעקוב במדויק אחר התפלגות התאים שלו ותגובתו לגירוי האור. הגישה החדשנית של יצירת מפת תגובה cAMP באמצעות מערכת סריקה נקודתית טומנת בחובה פוטנציאל לקידום המחקר עם חלבונים אופטוגנטיים בתחומים שונים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
מיפוי ההתפלגות התאית של חלבון אופטוגנטי באמצעות רשת גירוי אור
במאמר זה
סיכום
תקציר
המטרה שלנו הייתה לעקוב במדויק אחר ההתפלגות התאית של חלבון אופטוגנטי ולהעריך את הפונקציונליות שלו במיקום ציטופלזמי ספציפי. כדי להשיג זאת, ביצענו טרנספקט משותף עם חיישני cAMP ממוקדים גרעיניים וחלבון אופטוגנטי שפותח במעבדה שלנו, אדניליל ציקלאז-ננו-לוציפראז (bPAC-nLuc). bPAC-nLuc, כאשר מגורה עם מצעי אור או לוציפראז של 445 ננומטר, מייצר אדנוזין מונופוספט 3',5'-מחזורי (cAMP). השתמשנו במאיר לייזר במצב מוצק המחובר למערכת סריקה נקודתית שאפשרה לנו ליצור תבנית רשת/מטריצה של כתמים מוארים קטנים (~1 מיקרומטר2) לאורך הציטופלזמה של תאי HC-1. על ידי כך, הצלחנו לעקוב ביעילות אחר התפלגות bPAC-nLuc ממוקד גרעיני וליצור מפת תגובה מקיפה של cAMP. מפה זו ייצגה במדויק את ההתפלגות התאית של bPAC-nLuc, ותגובתה לגירוי האור השתנתה בהתאם לכמות החלבון בנקודה המוארת. גישה חדשנית זו תורמת להרחבת ארגז הכלים של הטכניקות הזמינות לחקר חלבונים אופטוגנטיים תאיים. היכולת למפות את תפוצתו ותגובתו בדיוק רב היא בעלת פוטנציאל מרחיק לכת ועשויה לקדם תחומי מחקר שונים.
מבוא
אופטוגנטיקה, שנולדה ככלי שחולל מהפכה במדעי המוח, היא כיום תחום מחקר צומח וטכנולוגיה עולה המשמשת באופן שגרתי מעבדות רבות ברחבי העולם ובתחומי מחקר שונים בביולוגיה. פיתחנו bPAC-nLuc, חלבון אופטוגנטי רב-תכליתי, על ידי מיזוג אדניליל ציקלאז רגיש לאור (AC) מ-Beggiatoa sp. (אדניליל ציקלאז חיידקי הניתן לפוטו-אקטיבי; bPAC) לננו-לוציפראז (nLuc)1,2,3. כאשר מגורה באור כחול, bPAC מייצר את השליח השני 3',5'-אדנוזין מונופוספט מחזורי (cAMP). nLuc הוא לוציפראז קטן שפותח לאחרונה, שבנוכחות אחד מהסובסטרטים שלו, יכול לייצר ביולומינסנציה ולהפעיל cAMP production4. לפיכך, ניתן להפעיל חלבון אופטוגנטי זה באופן חולף על ידי שימוש בפולסי אור קצרים או בהתמדה עם Furimazine או מצעי לוציפראז אחרים, מה שמאפשר לנו לחקות דפוסי איתות cAMP שונים ולהעריך תגובות תאיות (הפעלת גורמי שעתוק, ביטוי גנים, התפשטות תאים, נדידה וכו'). ההתקדמות האחרונה באיתות שליח שני הדגישה את המשמעות של אירועים המתרחשים באזורים ציטוזוליים מוגבלים מאוד (למשל, ייצור cAMP אנדוזומי עבור זרחון חלבון קושר יסודות (CREB) של תגובת cAMP או מיקרו-דומיינים של Ca2+ להעברת גורם גרעיני של תאי T מופעלים (NFAT) לגרעין)5,6. לכן, חשוב לפתח אסטרטגיות עקביות ושיטתיות להערכה, חיקוי וחסימת איתות מהתאים הללו בתאים חיים. כדי להראות את היכולת של bPAC-nLuc להיות מופעל באופן ספציפי בתאי תאים שונים, ביצענו העברה משותפת של קו תאים שמקורו בהפטומה (HC-1) עם bPAC-nLuc ממוקד גרעיני ו-H208, חיישן cAMP להעברת אנרגיית תהודה של Förster (FRET) (NLS-bPAC-nLuc; NLS-H208). תאי HC-1 הנובעים מקו ה-HTC נטולי פעילות AC הניתנת לבדיקה, מה שמביא לרמות cAMP בסיסיות נמוכות מאוד, מה שהופך אותו לאידיאלי למדידת ייצור cAMP משוער תוך ניצול הטווח הדינמי המלא של חיישני FRET7,8. באמצעות לייזר מצב מוצק (445 ננומטר, LDI-7, 89 צפון) המחובר למערכת סריקת נקודות (UGA-42 Geo, Rapp OptoElectronic), אנו מתארים פרוטוקול לגירוי שיטתי של אזורים מעגליים קטנים מאוד או כתמים (~1 מיקרומטר2) בתוך תאים בודדים. מערכת סריקת הנקודות הייתה מחוברת לאחת היציאות האחוריות של מיקרוסקופ דו-סיפוני שאפשרה לנו לעורר תאים ולבצע מדידות FRET בו זמנית באמצעות נתיב אור עצמאי. אנו מציגים שיטה בפרוטוקול זה שבה נעשה שימוש בתוכנת SysCon Geo, המסופקת עם מערכת הגירוי על ידי Rapp OptoElectronic, לביצוע סריקה מקיפה של הציטופלזמה של התאים. הגישה כוללת יצירת מפת תגובת cAMP על ידי הגדרת רצף של הארות המגרות תאים בתבנית רשת (איור 1).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. תרבית תאים HC-1 והכנה להדמיה
- שמור על תאי HC-1 ב-DMEM בתוספת 10% סרום בקר עוברי (FBS), פניצילין (100 יחב"ל/ליטר), סטרפטומיצין (100 מ"ג/ליטר) ו-L-גלוטמין בכלים של 10 ס"מ ומודגר ב-37 מעלות צלזיוס, 5%CO2, ב-95% אוויר לח.
- העבירו את התאים כל 2-4 ימים ברגע שהתאים מתכנסים ~90% באמצעות דילולים של 1:5 או 1:10.
- תאי זרעים לטרנספקציה על כיסויי זכוכית יומיים לפני הניסוי.
- עבודה בתנאים סטריליים במכסה מנוע של תרבית רקמות עם מדיה מחוממת מראש ו-PBS, שואבים את המדיה מצלחת תאים כמעט מתכנסת ושוטפים בעדינות עם 5 מ"ל PBS.
- שאפו את ה-PBS והוסיפו 1 מ"ל טריפסין. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 3-5 דקות עד שהתאים מתנתקים.
- השעו מחדש את התאים ב-4 מ"ל מדיה והעבירו את תרחיף התאים לצינור חרוטי של 15 מ"ל.
- השתמש בהמוציטומטר כדי לספור את מספר התאים ולחשב את צפיפות התאים.
- לדלל את התאים לצפיפות של 1.5 x 104 תאים/מ"ל.
- פיפטה 2 מ"ל של מתלה התא על כיסויי זכוכית 25 מ"מ עם ציפוי פולי-D-ליזין בצלחת של 6 בארות.
- דגרו על התאים במשך כ-24 שעות בחממה עד למפגש של 70%.
- העבר את התאים באמצעות ערכת טרנספקציה בהתאם להוראות היצרן באמצעות יחס של 0.25 מיקרוגרם של NLS-bPAC-nLuc DNA/0.75 מיקרוגרם של NLS-H208 DNA לכל 3 מיקרוליטר של מגיב טרנספקציה ו-2 מיקרוליטר של מגיב P3000 מדולל במדיה Opti-MEM חסרת פנול אדום.
- הנח את התאים בחממה למשך ~48 שעות כדי לאפשר ביטוי מספיק של bPAC-nLuc, החיוני להפקת רמות ניתנות לזיהוי של cAMP.
הערה: הרמה המינימלית הנדרשת של ביטוי bPAC-nLuc תשתנה בהתאם לעוצמת מערכת הגירוי והפרמטרים של הגירוי. - הכן תאים על כיסויים להדמיה.
- שאפו את המדיה מבאר אחת ושטפו פעמיים עם 2 מ"ל PBS.
- הרם בזהירות את משטח הכיסוי באמצעות זוג מלקחיים והנח אותו בתא ההדמיה.
- הוסף 1 מ"ל של Opti-MEM חסר פנול אדום לתא ההדמיה. ניתן לדמות תאים גם ב-HBSS או בכל תמיסה פיזיולוגית אחרת התואמת פלואורסצנטיות.
2. הדמיית אור והדמיית תאים חיים
- לבצע תרבית תאים ומניפולציה של תאים המבטאים NLS-bPAC-nLuc בסביבה חשוכה. כדי למנוע חשיפה לאורכי גל <500 ננומטר, השתמש במנורת פנס אדום (טבלת חומרים) עם נורת פלואורסצנטי קומפקטית בצבע ענבר 13 וואט (טבלת חומרים).
- בצע ניסויים במיקרוסקופ דו-סיפוני ממונע (טבלת חומרים) המצויד במנוע אור מרובה LED בעל 6 שורות (טבלת חומרים), גלגל מסנן פליטה (טבלת חומרים), שלב XY (טבלת חומרים), מצלמת CMOS דיגיטלית ORCA-Fusion (טבלת חומרים), ומטרת שמן 100x/1.4 NA (∞/0.17/FN26.5). צלם תמונות באמצעות תוכנת מיקרוסקופיה דיגיטלית (טבלת חומרים). מערך זה מסוגל לעורר תאים ולבצע מדידות FRET בו זמנית על ידי שימוש בנתיב אור עצמאי המסופק עם מסנן דיכרואי ZT458rdc (טבלת חומרים).
הערה: ניתן להשתמש בכל מערך רכישה אם הוא מאפשר גירוי אופטוגנטי בו זמנית והדמיה FRET/אינטנסיביות עם חיישן תואם. - הפעל את UGA - 42 Geosystem. הפעל את המיקרוסקופ והגדר אותו עם הפרמטרים המתאימים לרכישה עם חיישן H208 FRET. תצורת הרכישה תהיה תלויה ברמות הביטוי של חיישן ה-FRET. הפרמטרים האופייניים הם זמן סימולציה של 40 אלפיות השנייה עבור YFP/mScarletI, 15% הספק LED ו-0.5 הרץ.
- פתח את תוכנת SysCon ואת תוכנת ההדמיה השולטת במיקרוסקופ.
- בחלון מצלמה, בחר בכרטיסייה כיול ובחר את אורך גל הלייזר התואם לחלבון האופטוגנטי. כדי לעורר את bPAC-nLuc, השתמש באורך גל של 445 ננומטר.
- כייל את המערכת לפני כל שימוש. זה חשוב מכיוון ששינויים קטנים בהגדרה, או אפילו שינויים בטמפרטורת החדר (RT), יכולים לשנות את דיוק הגירוי.
- בחלון המצלמה, בחר בכרטיסייה מצלמה ולחץ על <התחל רכישה> כדי להתחיל את הרכישה מתוכנת הדמיון.
- בחלון מציג התמונות, דמיין רכישה חיה או קודמת של הקרינה של התאים שנלקחו מתוכנת ההדמיה, שתנחה את המיקום של אובייקטי הגירוי.
- השתמש במצב Click and Fire כדי להעריך במהירות את ההיענות של תא בודד לפני תחילת הניסוי.
- באמצעות חלון מנהל הרצפים, בחר <הוסף> כדי ליצור רצף חדש.
הערה: כדי לוודא כיול תקין של המערכת, צייר צורות וגדלים שונים בחלון מציג התמונות. אלה צריכים להתאים במדויק לדפוסי הגירוי המוקרנים על התאים, ולהבטיח יישור מדויק עם העיצוב המיועד. - בחלון מציג התמונות , בחר בסמל עגול בסרגל הכלים משמאל כדי לצייר אובייקטים לגירוי מעגלי.
- צור מספר עיגולים זהים קטנים והפץ אותם באופן שווה כדי להבטיח כיסוי הומוגני של כל הציטופלזמה של התאים שיש לעורר.
- לחץ לחיצה ימנית על כל אחד מהם כדי לאמת את ההומוגניות של אובייקטי הגירוי המעגלי. יופיע חלון; השתמש בו כדי לבחון את הרדיוס, המיקום וכו '.
- הגדר את הרדיוס בין 1 ל-5, בהתאם למטרה המשמשת ולגודל התא.
- כדי לסייע בריווח השווה וביישור של העיגולים, השתמש בלחצן <הצמד לרשת> בחלון המשנה תצוגה. בנוסף, הגדר את מאפייני הרשת באמצעות לחצן <הגדר רשת>.
- ודא שהרשת או המטריצה של אובייקטים לגירוי מעגלי במרווחים שווים מכסים את התא במלואו, וגודלו (למשל, 6 x 6 או 10 x 10) נקבע על פי גודל התא. כבקרה לגירוי אפס שלא אמור לעורר אירועים תאיים, כלול כמה עיגולים הממוקמים מחוץ לתא.
- כל אובייקט שנוצר בחלון מציג התמונות יופיע בחלון ציר הזמן.
- בחלון המשנה תזמון אובייקט, הגדר את המאפיינים הזמניים של כל אובייקט גירוי (שעת התחלה, משך, השהיה).
- בחלון המשנה Lightsource, הגדר את אורך הגל והעוצמה של כל אובייקט. עבור פרוטוקול זה, ודא שכל אובייקט משתמש באותו אורך גל וזהה במשך ובעוצמה. זמן ההתחלה יהיה שונה עבור כל אובייקט, והעיכוב ביניהם יכול להשתנות בהתאם לתוצאה הצפויה כדי למנוע הטלת ההשפעה של גירויים שונים.
- בחלון ציר הזמן, שנה את הרצף שבו כל אובייקט גירוי יופעל במידת הצורך. הגדר גירויים בדפוס קבוע (למשל, משמאל לימין, מלמעלה למטה) או בדפוס אקראי, בהתאם לניסוי המסוים.
- העלה את הרצף למערכת והגדר את מספר מחזורי הרצף (הפעלות) שהמערכת תבצע.
- מקם את אזורי העניין (ROI) בתוכנת ההדמיה במיקומים הרצויים.
- התחל לרכוש תמונות פלואורסצנטיות עם המיקרוסקופ ולחץ על <הפעל> בחלון UGA-42.
3. ניתוח נתונים
- למרות שהתוכנה המסופקת על ידי מערכת הגירוי מאפשרת שמירת רצפים לשימוש נוסף, היא אינה מתעדת את מידע הניסוי בפועל. לכן, תעד בקפידה את כל הפרטים הקשורים לנקודות הגירוי והרצפים שהופעלו במהלך הניסוי, כולל פרמטרים כמו מיקום, עוצמה, משך זמן, מספר ריצות וכו'. לתעד כל תנאי ניסוי רלוונטיים אחרים, כגון חומרים פרמקולוגיים או פתרונות ספציפיים.
- במהלך הניסוי, מקם את החזר ה-ROI הייעודי בתוכנת ההדמיה כדי ללכוד שינויים בעוצמת הקרינה מהתא כולו או ממיקומים ספציפיים בתוך התאים.
- שימו לב במיוחד למיקום ההחזר על ההשקעה ביחס לנקודות הגירוי. מדוד את השינויים בעוצמת הקרינה בתוך או רחוק מהאזורים המגורים. התאם את מיקומי ההחזר על ההשקעה לאחר הניסוי, וספק את תוכנת ההדמיה כדי לאפשר שמירת תמונות שנרכשו במהלך הניסוי ולא רק את ערכי עוצמת ההחזר על ההשקעה.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
התוצאות המוצגות ב-איור 1 מראות שרק גירויים המכוונים לגרעין התא הצליחו לייצר עליות מדידות של cAMP. דבר זה מאשר כי NLS-bPAC-nLuc מבוטא באופן בלעדי במדור הגרעיני של תאי HC-1. ניתן לגרות חלבון אופטוגנטי באופן מדויק באמצעות תבנית רשת/מטריצה זו כדי למפות את התהלוכיות התוך-תאית שלו. בנוסף, העליות הגבוהות יותר של cAMP לעבר מרכז הגרעין משקפות את המסה הגבוהה יותר של bPAC-nLuc שגורו על ידי נקודות מרכזיות בהשוואה לאלה שהוצבו בפריפריה הגרעינית (איור 1...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
מטרת מחקר זה הייתה לנטר במדויק את ההתפלגות התוך תאית של חלבון אופטוגנטי ולהעריך את ביצועיו בתוך תא ציטופלזמי מסוים. הראינו גם את יכולות הגירוי המדויקות של מערכת סריקת נקודות על תאים המבטאים חלבון אופטוגנטי. כדי להשיג זאת, השתמשנו ב-bPAC-nLuc ממוקד גרעיני עם רמות ביטוי גבוהות אך פיזור מוגבל מאוד מוגבל לגרעין. התוצאות הראו שנקודות גירוי המופרדות על ידי ~1 מיקרומטר בלבד יכולות לעורר ייצור cAMP או לא, תלוי בהתפלגות התאית של החלבון האופטוגנטי; רק גירויים שכוונו לגרעין הצליחו להעלות את רמות ה-cAMP. בפרוטוקול זה, המטרה לא הייתה...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים שאין אינטרסים מתחרים.
תודות
המימון ניתן על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) מענקי R01 GM099775 ו-GM130612 ל-D.L.A.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| נורת פלואורסצנטית קומפקטית ענבר 13 W - אורות כחולים נמוכים | פיתוחים פוטוניים | ||
| 3-איזובוטיל-1-מתילקסנטין (IBMX) | Sigma | I7018 | |
| 6 שורות Multi-LED Lumencor Spectra X | Lumencor | מנוע תאורת 6 שורות מרובה LED | |
| קורנינג - DMEM | תרמו פישר | MT10013CMEA | |
| קורנינג - סרום בקר עוברי רגיל | תרמו פישר | MT35011CV | |
| כיסוי כוסות: עיגולים | תרמו פישר | 12545102P | |
| GBX-2 מסנן אור בטוח אדום כהה 5.5 אינץ' | מנורת קודאק | 1416827 אדומה | |
| תמיסת מלח מאוזנת של הנקס (HBSS) 10x | תרמו פישר | 14185052 | מדולל ל-1x, pH מותאם |
| LDI-7 | 89 צפון | ||
| L-גלוטמין | תרמו פישר | BW17605E | |
| ליפופקטמין 3000 | ערכת טרנספקציה | L3000001 תרמו פישר | |
| אולימפוס IX83 ממונע שני סיפונים מיקרוסקופ | מיקרוסקופ דו-סיפוני ממונע | אולימפוס | |
| Opti-MEM, ללא פנול אדום | Thermo Fischer | 11058021 | |
| מצלמת CMOS דיגיטלית ORCA-fusion | Hamamatsu | C14440-20UP | |
| פניצילין-סטרפטומיצין (10,000 U/mL) | פוספט Thermo Fischer | ||
| (1x) | Lonza | 17516F | |
| ערכות גלגלי מסנן ומסננים עם פליטה קודמת | Prior Scientific, Inc. | גלגל מסנן פליטה | |
| קודם Proscan XY שלב | פריור סיינטיפיק, בע"מ | שלב XY | |
| Slidebook 6 | הדמיה חכמה | תוכנת מיקרוסקופיה דיגיטלית | |
| תוכנת SysCon | תוכנת SysCon | המסופקת על ידי מערכת הגירוי | |
| UGA-42 גיאו | Rapp OptoElectronic | ||
| UPlanSApo 100x | Olympus | 100x/1.4 NA מטרת שמן (∞/0.17/FN26.5) | |
| ZT458rdc dichroic | Chroma Technology Corp | BS, אורך גל (CWL): 498 ננומטר |
מקורות
- Naim, N., et al. Luminescence-activated nucleotide cyclase regulates spatial and temporal cAMP synthesis. The Journal of Biological Chemistry. 294 (4), 1095-1103 (2019).
- Naim, N., Reece, J. M., Zhang, X., Altschuler, D. L. Dual activation of cAMP production through photostimulation or chemical stimulation. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J). 2173, 201-216 (2020).
- Stierl, M., et al. Light modulation of cellular cAMP by a small bacterial photoactivated adenylyl cyclase, bPAC, of the soil bacterium Beggiatoa. The Journal of Biological Chemistry. 286 (2), 1181-1188 (2011).
- Hall, M. P., et al. Engineered luciferase reporter from a deep sea shrimp utilizing a novel imidazopyrazinone substrate. ACS Chemical Biology. 7 (11), 1848-1857 (2012).
- Liccardo, F., Luini, A., Di Martino, R. Endomembrane-based signaling by GPCRs and G-proteins. Cells. 11 (3), 528(2022).
- Groschner, K., Graier, W. F., Romanin, C. Store-operated ca(2)+ entry (SOCE) pathways. , Springer, Vienna. (2017).
- Ross, E. M., Howlett, A. C., Ferguson, K. M., Gilman, A. G. Reconstitution of hormone-sensitive adenylate cyclase activity with resolved components of the enzyme. The Journal of Biological Chemistry. 253 (18), 6401-6412 (1978).
- Insel, P. A., Maguire, M. E., Gilman, A. G., Bourne, H. R., Coffino, P., Melmon, K. L. Beta adrenergic receptors and adenylate cyclase: products of separate genes. Molecular Pharmacology. 12, 1062-1069 (1976).
- Pizzoni, A., Zhang, X., Naim, N., Altschuler, D. L. Soluble cyclase-mediated nuclear cAMP synthesis is sufficient for cell proliferation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 120 (4), e2208749120(2023).
- Keravis, T., Lugnier, C. Cyclic nucleotide phosphodiesterase (PDE) isozymes as targets of the intracellular signalling network: benefits of PDE inhibitors in various diseases and perspectives for future therapeutic developments. British Journal of Pharmacology. 165 (5), 1288-1305 (2012).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
