Method Article

יצירת Protein-E CENP-E-/- Knockout Cell Lines באמצעות מערכת CRISPR/Cas9

DOI:

10.3791/65476

⸱

June 23rd, 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cell Biology and Genetics, The School of Basic Medical Sciences, Fujian Medical University, 2Key Laboratory of Stem Cell Engineering and Regenerative Medicine, Fujian Province University, 3College of Clinical Medicine for Obstetrics & Gynecology and Pediatrics, Fujian Medical University, 4Medical Research Center, Fujian Maternity and Child Health Hospital

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מאמר זה מדווח על בניית תאי נוקאאוט הקשורים לצנטרומר לחלבון-E (CENP-E) באמצעות מערכת CRISPR/Cas9 ושלוש אסטרטגיות סינון מבוססות פנוטיפ. השתמשנו בקו תאי הנוקאאוט של CENP-E כדי לבסס גישה חדשנית לאימות הספציפיות והרעילות של מעכבי CENP-E, שהיא שימושית לפיתוח תרופות ולמחקר ביולוגי.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מערכת CRISPR (clustered regular interspaced short palindromic repeats)/Cas9 התפתחה ככלי רב עוצמה לעריכת גנים מדויקת ויעילה במגוון אורגניזמים. Centromere-associated protein-E (CENP-E) הוא קינזין מכוון פלוס הנדרש ללכידת קינטוחור-מיקרוטובול, יישור כרומוזומים ומחסום הרכבת ציר. למרות שתפקודים תאיים של חלבוני CENP-E נחקרו היטב, היה קשה לחקור את הפונקציות הישירות של חלבוני CENP-E באמצעות פרוטוקולים מסורתיים מכיוון שאבלציה של CENP-E מובילה בדרך כלל להפעלת מחסום הרכבת צירים, מעצר מחזור תאים ומוות תאי. במחקר זה, חיסלנו לחלוטין את הגן CENP-E בתאי HeLa אנושיים ויצרנו בהצלחה את תאי CENP-E-/- HeLa באמצעות מערכת CRISPR/Cas9.

נקבעו שלוש אסטרטגיות סינון אופטימליות המבוססות על פנוטיפים, כולל סינון מושבות תאים, פנוטיפים של יישור כרומוזומים ועוצמות פלואורסצנטיות של חלבוני CENP-E, המשפרים ביעילות את יעילות הסינון ואת שיעור ההצלחה הניסויית של תאי הנוקאאוט CENP-E . חשוב לציין, מחיקת CENP-E גורמת לחוסר תיאום כרומוזומים, למיקום לא תקין של חלבוני המחסום המיטוטי BUB1 serine/threonine kinase B (BubR1) ולפגמים מיטוטיים. יתר על כן, השתמשנו במודל תאי HeLa הנוקאאוט של CENP-E כדי לפתח שיטת זיהוי עבור מעכבי CENP-E ספציפיים.

במחקר זה נקבעה גישה שימושית לאימות הספציפיות והרעילות של מעכבי CENP-E. יתר על כן, מאמר זה מציג את הפרוטוקולים של עריכת גנים CENP-E באמצעות מערכת CRISPR/Cas9, אשר יכול להיות כלי רב עוצמה לחקור את המנגנונים של CENP-E בחלוקת התא. יתר על כן, קו תאי הנוקאאוט של CENP-E יתרום לגילוי ותיקוף של מעכבי CENP-E, שיש להם השלכות חשובות על פיתוח תרופות נגד גידולים, מחקרים על מנגנוני חלוקת תאים בביולוגיה של התא ויישומים קליניים.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עריכת גנום מהונדסת מתווכת את השינויים הממוקדים של גנים במגוון תאים ואורגניזמים. באיקריוטים, מוטגנזה ספציפית לאתר יכולה להיות מוצגת על ידי יישומים של נוקלאזות ספציפיות לרצף המעוררות רקומבינציה הומולוגית של דנ"א מטרה1. בשנים האחרונות, מספר טכנולוגיות לעריכת גנום, כולל נוקלאזות אצבע אבץ (ZFNs)2,3, נוקלאזות אפקט דמוי מפעיל שעתוק (TALENs)4,5, ומגנוקלאזות ביות 6,7, הונדסו כדי לבקע גנומים באתרים ספציפיים, אך גישות אלה דורשות הנדסת חלבונים מורכבת והליכי ניסוי מיותרים. מחקרים הראו כי מערכת CRISPR/Cas (ראשי תיבות של Type II prokaryotic clustered regular interspaced short palindromic repeats) היא טכנולוגיה יעילה לעריכת גנים, המתווכת באופן ספציפי מחשוף DNA מונחה RNA וספציפי לאתר במגוון רחב של תאים ומינים 8,9,10,11. טכנולוגיית נוקאאוט הגנים CRISPR/Cas9 חוללה מהפכה בתחומי הביולוגיה הבסיסית, הביוטכנולוגיה והרפואה12.

חיידקים ורוב הארכאונים פיתחו מערכת חיסון נרכשת מבוססת רנ"א המשתמשת בחלבוני CRISPR ו-Cas כדי לזהות ולהשמיד נגיפים ופלסמידים13. סטרפטוקוקוס פיוגנס Cas9 (SpCas9) endonuclease מכיל את התחום RuvC-like Holliday junction resolvase (RuvC) ואת התחום His-Asn-His (HNH), אשר יכול לתווך ביעילות הפסקות דו-גדיליות ספציפיות לרצף (DSB) על ידי אספקת RNA סינתטי חד-מנחה (sgRNA) המכיל RNA קריספר (crRNA) ו-crRNA מפעיל טרנס (tracrRNA)14,15,16. ניתן לתקן DSB באמצעות מסלול חיבור קצה לא הומולוגי (NHEJ) או תיקון מכוון הומולוגיה (HDR), אשר מציג מוטציות מרובות, כולל החדרות, מחיקות או תחליפי נוקלאוטידים בודדים ללא צלקת, בתאי יונקים 1,8. ניתן להשתמש הן במסלול NHEJ הנוטה לשגיאות והן במסלול HDR בנאמנות גבוהה כדי לתווך נוקאאוט גנים באמצעות החדרות או מחיקות, מה שעלול לגרום למוטציות frameshift וקודוני עצירה מוקדמים10.

Kinesin-7 CENP-E נדרש עבור חיבור kinetochore-microtubule ויישור כרומוזומים במהלך חלוקת התא 17,18,19. מיקרו-הזרקת נוגדנים20,21, דלדול siRNA22,23, עיכוב כימי 24,25,26 ומחיקה גנטית 27,28,29 של CENP-E מובילה לחוסר תיאום כרומוזומים, הפעלת מחסום הרכבת ציר ופגמים מיטוטיים, מה שגורם לאנאופלואידיות ואי יציבות כרומוזומלית19,30. בעכברים, מחיקת CENP-E גורמת להתפתחות לא תקינה ולקטלניות עוברית בשלבים מוקדמים מאוד של ההתפתחות 27,29,31. מחיקה גנטית של CENP-E מובילה בדרך כלל לחוסר תיאום כרומוזומים ולמוות תאי 26,27,29, המהווה מכשול בחקר הפונקציות והמנגנונים של חלבוני CENP-E.

מחקר שנערך לאחרונה ביסס קו תאי נוקאאוט מותנה של CENP-E באמצעות שיטת עריכת גנים CRISPR/Cas932 הניתנת להשראת אוקסין, המאפשרת פירוק מהיר של חלבוני CENP-E בזמן קצר יחסית33. עם זאת, עד כה, קווי תאי נוקאאוט יציבים של CENP-E לא נקבעו, וזהו אתגר טכני בלתי פתור בביולוגיה של CENP-E. בהתחשב בחוסן גנטי34, בתגובות פיצוי גנטי 35,36,37 ובסביבות תוך-תאיות מורכבות, מכיוון שההשלכות הישירות של מחיקה מוחלטת של CENP-E עשויות להיות מורכבות ובלתי צפויות, חשוב לבסס קווי תאי נוקאאוט של CENP-E לחקר מנגנונים של יישור כרומוזומים, מחסום הרכבת ציר ומסלולי איתות במורד הזרם.

הגילוי והיישומים של מעכבי CENP-E חשובים לטיפול בסרטן. עד כה, שבעה סוגים של מעכבי CENP-E נמצאו וסונתזו, כולל GSK923295 ונגזרותיו24,25, PF-277138,39, אימידזו[1,2-a]נגזרות פיגום פירידין40,41, תרכובת A42,43, סינטלין44,45, UA6278446, ובנזו[ד]פירולו[2,1-b]נגזרות תיאזול47. בין מעכבים אלה, GSK923295 הוא מעכב CENP-E אלוסטרי ויעיל הנקשר לתחום המוטורי של CENP-E ומעכב פעילות ATPase מגורה מיקרוטובול CENP-E עם Ki של 3.2 ± 0.2 ננומטר24,25. עם זאת, בהשוואה להשפעות המעכבות של GSK923295 על תאי סרטן בתרבית, ההשפעות הטיפוליות של GSK923295 בחולי סרטן קליני אינן אידיאליות48,49, מה שהעלה גם חששות לגבי הספציפיות של GSK923295 עבור CENP-E. יתר על כן, הספציפיות ותופעות הלוואי של מעכבי CENP-E אחרים על חלבוני CENP-E הם נושאים מרכזיים בחקר הסרטן.

במחקר זה, חיסלנו לחלוטין את הגן CENP-E בתאי HeLa באמצעות מערכת CRISPR/Cas9. נקבעו שלוש אסטרטגיות סינון אופטימליות מבוססות פנוטיפ, כולל סינון מושבות תאים, פנוטיפים של יישור כרומוזומים ועוצמות פלואורסצנטיות של חלבוני CENP-E, כדי לשפר את יעילות הסינון ואת שיעור ההצלחה של עריכת גנים CENP-E. יתר על כן, ניתן להשתמש בקווי תאי נוקאאוט של CENP-E כדי לבדוק את הספציפיות של תרכובות מועמדות עבור CENP-E.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. בניית וקטורי הנוקאאוט של הגן CRISPR/Cas9

  1. בחר את רצף ה- DNA הגנומי של היעד על הגן האנושי CENP-E (GenBank Accession No. NM_001286734.2) ולעצב את ה-sgRNA באמצעות כלי מקוון לעיצוב CRISPR (http://crispor.tefor.net/).
  2. הזן רצף גנומי יחיד, בחר את הגנום של "הומו ספיינס-אדם-UCSC דצמבר 2013 (ערכת ניתוח hg38) + פולימורפיזמים נוקלאוטידים בודדים (SNPs): dbSNP148", ובחר את המוטיב הסמוך של אב החלל "20 bp-NGG-spCas9". בחר שני רצפים מנחים, כולל sgRNA-1, 5'-CGGCCGCACTCGCACGCAGA-3' ו- sgRNA-2 5'-TTCTTTAGAGACGCGGGCTC-3', בהתאם לציוני הספציפיות50, היעילות החזויה10 והמינימום מחוץ ליעדים.
  3. סדרו וסנתזו את אוליגונוקלאוטידים חד-גדיליים של DNA (ssODN). לדלל את ssODNs ב ddH2O לריכוז סופי של 100 μM. כדי לזרח ולאחות את אוליגוס ה-sgRNA, יש להוסיף 1 μL של אוליגו קדמי, 1 μL של אוליגו הפוך, 0.5 μL של T4 polynucleotide kinase, 1 μL של T4 polynucleotide kinase buffer, ו-6.5 μL של מים נטולי RNase בצינור תגובת שרשרת פולימראז (PCR), ולדגור על הצינור ב-37°C למשך 30 דקות, 95°C למשך 5 דקות; לאחר מכן, רמפה למטה ל 25 °C ב 5 °C דקות -1.
  4. עיכול פלסמיד pX458 באמצעות אנזים הגבלת Bbsfigure-protocol-1 . הוסף 1 מיקרוגרם של פלסמיד pX458, 2 μL של 10x חיץ G, 1 μL של Bbsfigure-protocol-2, והוסף ddH2O ללא RNase ל 20 μL בצינור צנטריפוגה 1.5 מ"ל. לדגור על הצינור ב 37 ° C במשך 2 שעות. לאחר מכן, לטהר את הפלסמיד הליניארי באמצעות ערכת מיצוי ג'ל DNA עמודה בהתאם לפרוטוקולים של היצרן.
  5. חבר את אוליגוס sgRNA לתוך פלסמיד pX458 (pSpCas9(BB)-2A-חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) פלסמיד, Addgene ID. 48138). הוסף 1 μL של אוליגונוקלאוטידים מחושלים, 25 ng של פלסמיד ליניארי, 1 μL של 10x T4 DNA ligation buffer, 0.5 μL של T4 DNA ligase (350 U/μL) ולעשות עד 10 μL עם ddH2O בצינור צנטריפוגה 1.5 מ"ל. לדגור על תמיסת הקשירה ב 16 ° C במשך 2 שעות.
  6. לדגור 10 μL של פלסמיד בנוי עם תאי DH5α המוסמכים על קרח במשך 30 דקות, הלם חום ב 42 ° C במשך 45 שניות, ומיד להניח אותם על קרח במשך 5 דקות. הוסף 500 μL של Luria-Bertani (LB) בינוני וזרע את התאים על צלחת LB המכילה אמפיצילין (100 מיקרוגרם / מ"ל). דגרו עליו בטמפרטורה של 37°C למשך 16 שעות וסננו את השיבוטים העמידים.
  7. בחר 5-10 מושבות בודדות עם קצה פיפטה מעוקר ולהעביר אותם לתרבית 1 מ"ל של מדיום LB עם אמפיצילין (100 מיקרוגרם / מ"ל). לדגור על התרבית ב 37 מעלות צלזיוס ולנער אותו ב 180 סל"ד במשך 12-16 שעות.
  8. בודד את DNA הפלסמיד באמצעות ערכת מיצוי פלסמיד בהתאם לפרוטוקולים של היצרן. אימות הדנ"א הפלסמיד של כל מושבה על ידי ריצוף סנגר מאתר מקדם U6 באמצעות פריימר U6-Fwd 5'-GAGGGCCTATTTCCCATGATTCC-3'.
  9. לחלץ ולטהר את הפלסמידים באמצעות ערכת DNA פלסמיד ללא אנדו בהתאם לפרוטוקולים של היצרן.

2. טרנספקציה, בידוד וסינון של תאי HeLa בנוקאאוט CENP-E

  1. תרבית תאי HeLa במדיום הנשר המהונדס של Dulbecco (DMEM) בתוספת 10% נסיוב בקר עוברי ו-1% פניצילין/סטרפטומיצין באינקובטור לח ב-37°C עם 5% CO2.
  2. לדגור על תאי HeLa באמצעות 0.25% טריפסין/אתילן דיאמין חומצה טטראצטית (EDTA) ב 37 ° C במשך 2-3 דקות, לנתק את התאים על ידי pipetting בעדינות, ולאחר מכן, זרע את התאים בצלחות חדשות ביחס דילול של 1: 4 עבור מעבר התא.
  3. זרעו את התאים בצלחת של 12 בארות, ותרבו למפגש של 60-70% לפני ההדבקה. הדבק את פלסמידים pX458-sgRNA לתוך תאי HeLa באמצעות ריאגנטים הפניה על פי הפרוטוקולים של היצרן (ראה טבלת חומרים).
    1. ערבבו בעדינות 1 מיקרוגרם של פלסמיד pX458-sgRNA מאומת ו-50 מיקרוליטר של מדיום סרום מופחת בצינור A. לאחר מכן, מערבבים בעדינות 2 μL של מגיב transfection ו 50 μL של מדיום סרום מופחת בצינור B. לדגור צינורות A ו- B בנפרד בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות.
    2. מערבבים בעדינות את צינור A ואת צינור B ודגרים בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות. מוסיפים את התערובת לצלחת של 12 בארות, דוגרים על התאים במשך 6 שעות, ומחליפים את המדיום במדיום DMEM טרי.
  4. בדוק תאי HeLa לאחר 24 שעות או 48 שעות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ליעילות הטרנספקציה. לאחר טרנספקציה במשך 48 שעות, נתקו לחלוטין את תאי HeLa הנגועים באמצעות 0.25% טריפסין/EDTA ב-37°C למשך 3-5 דקות, ספרו את מספר התאים באמצעות תא נויבאואר או מונה תאים אוטומטי, ולוחמו את התאים לשלוש צלחות נפרדות בנות 96 בארות עבור כל אוכלוסייה נגועה על פי שיטות דילול סדרתי10.
  5. להחזיר את התאים לאינקובטור לח ולאחר מכן לגדל אותם בתרבית במשך 1-2 שבועות נוספים. שנה את מדיום התרבות אחת לשלושה ימים. לסינון מבוסס פנוטיפ ותיקוף של נוקאאוט CENP-E , נתק והרחיב את התאים בלוחות 24 באר או 12 בארות למשך 5-7 ימים.
  6. מסך את התאים המוטנטיים בקוטר מושבת תאים קטן יותר באמצעות מיקרוסקופ הפוך המצויד בעדשות אובייקטיביות 10x ו- 20x.
    הערה: מוטציות CENP-E בדרך כלל גורמות לעלייה משמעותית במספר התאים המתחלקים במושבות תאים, מה שיכול להיות אחד המדדים העיקריים לסינון תאים מוטנטיים CENP-E .
  7. קצרו את התאים למיצוי DNA באמצעות ערכת מיצוי DNA גנומית של בעלי חיים על פי פרוטוקולי היצרן. הגדר את תגובות ה- PCR באופן הבא: 0.25 μL של Taq פולימראז, 5 μL של חיץ 10x (Mg2+ פלוס), 4 μL של תערובות dNTP, 500 ng של תבנית DNA, 1 μL של אוליגו קדימה, 1 μL של אוליגו הפוך, והתאם ddH2O ל- 50 μL. השתמש בהגדרות תוכנית ה- PCR הבאות להגברת גנים: 98 מעלות צלזיוס, 10 שניות; 98 °C, 10 s, 55 °C, 30 s, 72 °C, 60 s במשך 33 מחזורים; 72°C, 10 דקות, ולאחר מכן להחזיק ב 4 °C.
    הערה: הפריימרים הספציפיים לשיבוט מוקד המטרה מפורטים באופן הבא: יעד CENP-E F1, 5'-GAGGGTCCTGGCCATTTTCCTG-3'; יעד CENP-E R1, 5'-AGATCTCCGATCCTCCCCTGTC-3'; יעד CENP-E F2, 5'-TGGTAACTGCATTTTGGTGTTCTAC-3'; יעד CENP-E R2, 5'-CCTGTTGCAACGTGAGGGAAG-3'.
  8. קשרו את דנ"א המטרה לווקטור pMD18-T בהתאם לפרוטוקולים של היצרן. הדבק את הפלסמיד הקשור לתאי DH5α מוכשרים ולתרבית לבחירת שיבוטים.
  9. בצע ריצוף Sanger כדי לקבוע את סוגי הנוקאאוט של CENP-E . בודד את DNA הפלסמיד באמצעות ערכת מיצוי פלסמיד בהתאם לפרוטוקולים של היצרן. לבצע ריצוף סנגר של DNA פלסמיד של כל מושבה באמצעות M13 קדימה ואחורה פריימרים. פריימר M13F, 5'-TGTAAAACGACGGCCAGT-3'; פריימר M13R, 5'-CAGGAAACAGCTATGACC-3'.
  10. זרעו את תאי HeLa המוטנטיים מסוג בר ו-CENP-E על כיסויי זכוכית בקוטר 12 מ"מ בצלחת בעלת 24 בארות, בהתאמה. הסר את מדיום DMEM המלא וקבע את התאים בתמיסת קיבוע 4% paraformaldehyde/phosphate-buffered saltered salline (PBS) בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.
  11. צבעו את הגרעינים בתמיסת 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות. סנן ואמת את התאים המוטנטיים CENP-E בהתבסס על הפנוטיפ של יישור הכרומוזומים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי המצויד ביעד Plan Fluor 40x / Numerical Aperture (NA) 0.75.
  12. סנן ואמת את תאי הנוקאאוט של CENP-E באמצעות צביעה וניתוח אימונופלואורסצנטיים (ראה סעיף 3) של חלבוני CENP-E.

3. צביעת אימונופלואורסנציה ומיקרוסקופ קונפוקלי ברזולוציה גבוהה

  1. תקן את התאים עם תמיסת קיבוע 4% paraformaldehyde/PBS בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות וטבול במשך 2 x 5 דקות ב- 1x PBS.
    הערה: ודא שהתאים במצב בריא ושהתאים נאספים ומקובעים בעדינות כדי למנוע ניתוק תאים מטא-פאזה.
  2. חדרו את התאים עם 0.25% Triton X-100/PBS בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות וטבלו אותם ב-1x PBS למשך 2 x 5 דקות.
  3. חסום את התאים עם 1% BSA/PBST (0.1% Tween 20 ב-PBS) בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת. לדלל את הנוגדנים הראשוניים עם 1% BSA/PBST ולדגור את הדגימות ב 4 ° C במשך 12 שעות.
  4. השליכו את תמיסות הנוגדנים הראשוניות, שטפו את התאים 3 x 5 דקות עם 1x PBS, ודגרו על התאים עם נוגדנים משניים מדוללים בטמפרטורת החדר למשך שעתיים.
  5. השליכו את הנוגדנים המשניים ושטפו את התאים ב-1x PBS למשך 3X5 דקות.
  6. הכתימו את הגרעינים עם DAPI בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות. הרכיבו את המגלשות עם אמצעי ההרכבה. אטמו את המגלשות בלק.
  7. התבונן והקלט את התמונות הפלואורסצנטיות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי סורק המצויד במטרה 63x/NA 1.40.

4. הכנת כרומוזום וניתוח קריוטיפ

  1. תרבית את תאי הבר מסוג CENP-E-/- HeLa בתווך DMEM מלא בתוספת 10% נסיוב בקר עוברי ו-1% פניצילין/סטרפטומיצין למשך 24 שעות ולאחר מכן, דגרו על תאי הבר ותאי CENP-E-/- HeLa עם קולכיצין 300 ננומטר במשך 5 שעות.
  2. יש לדגור על התאים עם 0.25% טריפסין/EDTA בטמפרטורה של 37°C למשך 3 דקות ולאסוף את התאים לתוך צינורות צנטריפוגות בנפח 1.5 מ"ל.
  3. צנטריפוגו את התאים בטמפרטורה של 1,000 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר, השליכו את הסופרנאטנטים, הוסיפו 1.2 מ"ל של תמיסת KCl 0.075 mol/L ודגרו בטמפרטורה של 37°C למשך 20 דקות.
  4. צנטריפוגו את התאים במהירות של 1,000 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר, השליכו את הסופרנאטנטים, הוסיפו 0.2 מ"ל של התמיסה המקבעת (מתנול: חומצה אצטית קרחונית = 3:1) לקיבוע, וערבבו בעדינות במשך דקה.
  5. צנטריפוגה את התאים ב 1,000 × גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר, לאסוף את הכדורים, להוסיף 1.5 מ"ל של תמיסה קיבוע בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות, ולאחר מכן צנטריפוגה ב 1,000 × גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  6. השליכו את הסופרנאטנטים, הוסיפו 0.6 מ"ל של התמיסות המקבעות, והכינו תרחיף תא. הוסיפו 3-5 טיפות של מתלי התא מגובה של 35-40 ס"מ על מגלשות הקרח.
    הערה: שמור על הגובה לשחרור מתלי התאים על המגלשות על 35-40 ס"מ; אחרת, הכרומוזומים עשויים להיות מפוזרים מדי או לא מופרדים זה מזה.
  7. יבשו את המגלשות מיד עם מנורת אלכוהול, הכתימו את הדגימות בתמיסת צביעה 10% Giemsa למשך 7 דקות, שטפו את המגלשות במים זורמים למשך 2 דקות, והתבוננו בדגימות באמצעות מיקרוסקופ אור המצויד ביעד Plan Fluor 40x/NA 0.75.

5. בדיקת היווצרות מושבת תאים

  1. הכינו את מתלי התאים בלוחות 6 בארות בצפיפות תאים של 1,000-2,000 תאים / באר. נערו בעדינות את הצלחות כדי לפזר את התאים באופן שווה.
  2. הכניסו את צלחות 6 הבארות לאינקובטור CO2 ודגרו במשך 2-3 שבועות בטמפרטורה של 37°C עם 5% CO2. החליפו מדיום תרבות אחת ל-5 ימים. הקלט את התמונות באמצעות מיקרוסקופ הפוך המצויד בעדשות אובייקטיביות 10x ו- 20x. קצור את התאים כאשר מושבות גלויות (מאות תאים בתוך שיבוט).
  3. כדי לחקור את ההשפעות של GSK923295, תרבית את התאים בצלחות 6 בארות במשך 24 שעות, והוסף 2 מ"ל של GSK923295 בריכוזים הסופיים של 10, 25, 50, 100 ו 200 ננומטר.
    הערה: אין להזיז את צלחת התרבית בשלב המוקדם של היווצרות השיבוט כדי למנוע נשירה של תאים, שיכולה ליצור שיבוטים חדשים ולהשפיע על הסינון של תאים נגועים.
  4. השליכו את מדיום התרבית וקבעו את התאים עם 1% PFA בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. הכתימו את המושבות בתמיסת צביעה סגולה קריסטלית 0.1% בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. שטפו את הדגימות עם PBS 1x שלוש פעמים. הקלט את התמונות של מושבות תאים וכמת את הקטרים של כל מושבה באמצעות תוכנת ImageJ. בחרו בכלי בחירת קו ישר , לחצו על 'נתח', בחרו 'מדידה' והקליטו את האורך.
  5. שטפו את המושבות ב-1 מ"ל של תמיסת 10% חומצה אצטית למשך 5 דקות. העבירו 200 μL של תמיסות הסופרנאטנט בלוח של 96 בארות, ומדדו את ערכי הספיגה באמצעות ספקטרופוטומטר מיקרו-פלטהב-A 600 ננומטר.

6. בדיקת כדאיות התא

  1. זרעו את התאים בצלחות של 24 בארות ותרבו את התאים לצפיפות של 48 שעות עד 80-90%.
  2. לדגור על התאים עם 100 μL של 0.25% טריפסין/EDTA ב 37 ° C במשך 3 דקות.
  3. מערבבים 400 μL של PBS עם התאים עם אקדח פיפטה. מעבירים 100 μL של מתלי התא לצלחת 96 בארות.
  4. הוסף 20 μL של תמיסת MTS בכל באר עם ריכוז סופי של 317 מיקרוגרם / מ"ל וערבב בעדינות בהתאם לפרוטוקולים של היצרן. לדגור את הדגימות ב 37 ° C במשך 1-3 שעות באינקובטור CO2 .
  5. רשום את ערכי הספיגה של כל באר בשיא הספיגה של A490 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר מיקרו-פלטות. השתמש באורך גל ייחוס של A630 ננומטר כדי להחסיר את הרקע שנתרם על ידי פסולת תאים ובליעה לא ספציפית (כדאיות התא = A490nm - A630 nm).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תאי CENP-E-/- HeLa נוצרו בהצלחה באמצעות מערכת CRISPR/Cas9 (איור 1). ציר הזמן ושלבי הניסוי הקריטיים של שיטה זו מוצגים באיור 1. ראשית, תכננו וסינתזנו את ה-sgRNA הספציפי ל-CENP-E, חישלנו וקשרנו את ה-sgRNA לפלסמיד pX458, הדבקנו את הפלסמיד לתאי HeLa ותרבנו אותם במשך 48 שעות. התאים הנגועים נותקו ונזרעו בצלחת של 96 בארות באמצעות דילול סדרתי (איור 1A). מושבות בודדות נבחרו ונבדקו באמצעות שלוש אסטרטגיות מבוססות פנ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kinesin-7 CENP-E הוא וסת מפתח ביישור כרומוזומים ומחסום הרכבת ציר במהלך חלוקת התא 17,19,20. מחיקה גנטית של CENP-E גורמת בדרך כלל להפעלת מחסום הרכבת ציר, מעצר מחזור תאים ומוות תאי 27,29,51,52. לפיכך, בניית קווי תאי נוקאאוט יציבים של CENP-E היא סוגיה חשובה ולא פתורה בביולוגיה של CENP-E. במחקר זה,...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים לכל חברי מעבדת Cytoskeleton באוניברסיטה הרפואית פוג'יאן על דיונים מועילים. אנו מודים לג'ון-ג'ין לין, ג'י-הונג הואנג, לינג לין, לי-לי פאנג, לין-יינג ג'ואו, שי לין ומין-שיה וו במרכז השירות לטכנולוגיה ציבורית, האוניברסיטה הרפואית פוג'יאן על עזרתם הטכנית. אנו מודים לסי-יי ג'נג, יינג לין וצ'י קה במרכז ההוראה הניסויית למדעי הרפואה הבסיסיים באוניברסיטה הרפואית פוג'יאן על תמיכתם. מחקר זה נתמך על ידי המענקים הבאים: הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מענק מספר 82001608 ו -82101678), הקרן למדעי הטבע של מחוז פוג'יאן, סין (מענק מספר 2019J05071), הקרנות המשותפות לחדשנות של מדע וטכנולוגיה, מחוז פוג'יאן, סין (מענק מספר 2021Y9160), ופרויקט מימון סטארט-אפ למחקר מדעי ברמה גבוהה של האוניברסיטה הרפואית פוג'יאן (מענק מספר XRCZX2017025).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0.25% טריפסין-EDTAGibco25200056
צינור צנטריפוגה 1.5 מ"לAxygenMCT-150-C
צלחת 24 בארותCorning3524
4S Gelred, 10,000x במיםסנגון ביוטק (שנחאי)A616697
צינור צנטריפוגה 50 מ"לקורנינג430828
צלחת פטרי 6 ס"מקורנינג
95% אתנולסינופארם מגיב כימי10009164
צלחת 96 בארותCorning3599
חומצה אצטיתסינופארם מגיב כימי10000218להמיס ב-H2O להכנת תמיסת עבודה של 10%.
AgaroseSangon Biotech (שנחאי)A620014
Alexa Fluor 488 עם תווית עז נגד עכבר IgG (H+L)BeyotimeA0428לאימונופלואורסצנטיות. יש להמיס ב-1% BSA/PBST. דילול 1:500.
Alexa Fluor 488 עם תווית עז נגד ארנב IgG (H + L)BeyotimeA0423לאימונופלואורסצנטיות. יש להמיס ב-1% BSA/PBST. דילול 1:500.
Alexa Fluor 555 עם תווית חמור נגד עכבר IgG (H + L)BeyotimeA0460לאימונופלואורסצנטיות. יש להמיס ב-1% BSA/PBST. דילול 1:500.
אתנול נטול מיםסינופארם מגיב כימי100092690
נוגדן חד שבטי ארנב אנטי-BubR1Abcamab254326לאימונופלואורסצנטיות. יש להמיס ב-1% BSA/PBST. דילול 1:100 
נוגדן חד שבטי לעכבר נגד CENP-Bסנטה קרוז ביוטכנולוגיהsc-376392לאימונופלואורסצנטיות. יש להמיס ב-1% BSA/PBST. 1:50 דילול.
נוגדן חד שבטי ארנב אנטי-CENP-EAbcamab133583לאימונופלואורסצנטיות. יש להמיס ב-1% BSA/PBST. דילול 1:100.
מדיום הרכבה נגד דהייהBeyotimeP0131מאט את הכיבוי של אותות פלורסנט.
נוגדן חד שבטי של עכבר אנטי &אלפא טובוליןAbcamab7291לאימונופלואורסצנטיות. יש להמיס ב-1% BSA/PBST. דילול 1:100.
Biotek Epoch Microplate ספקטרופוטומטרBiotek Instruments BiotekEpoch
סרום בקר אלבומין (BSA)סינופארם מגיב כימי69003435
BpiI (BbsI)Thermo Fisher ScientificER1011
CellTiter 96 מימי תמיסה אחת תמיסה התפשטות תאים בדיקהPromegaG3580
צנטריפוגהEppendorf5424BK745380
קולכיציןסינופארם מגיב כימי61001563
מיקרוסקופ סריקה קונפוקליLeicaLeica TCS SP8
CoverslipCITOTEST80344-1220
DAPIBeyotimeC1006
DH5 & alpha; תאים מוכשריםסנגון ביוטק (שנחאי)B528413
DL2000 סמן DNATaKaRa3427A
מדיום הנשר השונה של Dulbecco (DMEM)GibcoC11995500BT
ערכת מיני פלסמיד נטולת אנדו figure-materials-1OmegaD6950
Ezup Column ערכת טיהור DNA גנומי של בעלי חייםSangon Biotech (שנחאי)B518251
סרום בקר עובריZhejiang Tianhang Biotechnology11011-8611
Gentianviolet Sinopharm מגיב כימי71019944להמיס ב-PBS להכנת 0.1% סגול ג'נטיאן/PBS.
תמיסת צביעה של Giemsaמגיב כימי סינופארם71020260
תוכנת GraphPad Prism גרסה 8.0 GraphPad www.graphpad.comניתוח סטטיסטי.
GSK923295MedChemExpressHY-10299
קו תאי HeLaATCCCCL-2
חממה לחהHeal ForceHF90/HF240
Image J תוכנההמכונים הלאומיים לבריאותhttps://imagej.nih.gov/ij/עיבוד וניתוח תמונה.
מיקרוסקופ הפוךנאנג'ינג ג'יאנגנן אופטיקה חדשהXD-202
LB אבקת אגרסנגון ביוטק (שנחאי)A507003
מגיב טרנספקציה Lipo6000BeyotimeC0526
מיקרוסקופ Nikon Ti-S2NikonTi-S2
Opti-MEM  מופחת  סרום  מגיב כימי בינוני Gibco31985070
ParaformaldehydeSinopharm80096618ממיסים ב-PBS להכנת 4% paraformaldehyde/PBS.
תמיסת פניצילין-סטרפטומיציןHyCloneSV30010
ערכת מיצוי ג'ל DNA עמודה SanPrepסנגון ביוטק (שנחאי)B518131
SanPrep  טור  פלסמיד  מיני הכנות  ערכתSangon Biotech (שנחאי)B518191
T4 DNA ligaseTaKaRa2011A
T4 polynucleotide kinaseTaKaRa2021A
TaKaRa ExTaq TaKaRaRR001A
Triton X-100Sinopharm מגיב כימי30188928להמיס ב-PBS להכנת 0.25% טריטון X-100/PBS.
Tween 20Sinopharm Chemical Reagent30189328להתמוסס ב-PBS להכנת 0.1% Tween 20/PBS.
430166

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jiang, W., Bikard, D., Cox, D., Zhang, F., Marraffini, L. A. RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems. Nature Biotechnology. 31 (3), 233-239 (2013).
  2. Bibikova, M., Beumer, K., Trautman, J. K., Carroll, D. Enhancing gene targeting with designed zinc finger nucleases. Science. 300 (5620), 764(2003).
  3. Urnov, F. D., Rebar, E. J., Holmes, M. C., Zhang, H. S., Gregory, P. D. Genome editing with engineered zinc finger nucleases. Nature Reviews Genetics. 11 (9), 636-646 (2010).
  4. Joung, J. K., Sander, J. D. TALENs: a widely applicable technology for targeted genome editing. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (1), 49-55 (2013).
  5. Wood, A. J., et al. Targeted genome editing across species using ZFNs and TALENs. Science. 333 (6040), 307(2011).
  6. Stoddard, B. L. Homing endonuclease structure and function. Quarterly Reviews of Biophysics. 38 (1), 49-95 (2005).
  7. Pâques, F., Duchateau, P. Meganucleases and DNA double-strand break-induced recombination: perspectives for gene therapy. Current Gene Therapy. 7 (1), 49-66 (2007).
  8. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  9. Shmakov, S., et al. Discovery and functional characterization of diverse class 2 CRISPR-Cas systems. Molecular Cell. 60 (3), 385-397 (2015).
  10. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  11. Jia, N., Patel, D. J. Structure-based functional mechanisms and biotechnology applications of anti-CRISPR proteins. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 22 (8), 563-579 (2021).
  12. Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).
  13. Horvath, P., Barrangou, R. CRISPR/Cas, the immune system of bacteria and archaea. Science. 327 (5962), 167-170 (2010).
  14. Gasiunas, G., Barrangou, R., Horvath, P., Siksnys, V. Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (39), E2579-E2586 (2012).
  15. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  16. Jackson, S. A., et al. CRISPR-Cas: Adapting to change. Science. 356 (6333), eaal5056(2017).
  17. Wood, K. W., Sakowicz, R., Goldstein, L. S., Cleveland, D. W. CENP-E is a plus end-directed kinetochore motor required for metaphase chromosome alignment. Cell. 91 (3), 357-366 (1997).
  18. Craske, B., Welburn, J. P. I. Leaving no-one behind: how CENP-E facilitates chromosome alignment. Essays in Biochemistry. 64 (2), 313-324 (2020).
  19. Yu, K. W., Zhong, N., Xiao, Y., She, Z. Y. Mechanisms of kinesin-7 CENP-E in kinetochore-microtubule capture and chromosome alignment during cell division. Biology of the Cell. 111 (6), 143-160 (2019).
  20. Schaar, B. T., Chan, G. K., Maddox, P., Salmon, E. D., Yen, T. J. CENP-E function at kinetochores is essential for chromosome alignment. Journal of Cell Biology. 139 (6), 1373-1382 (1997).
  21. McEwen, B. F., et al. CENP-E is essential for reliable bioriented spindle attachment, but chromosome alignment can be achieved via redundant mechanisms in mammalian cells. Molecular Biology of the Cell. 12 (9), 2776-2789 (2001).
  22. Yao, X., Abrieu, A., Zheng, Y., Sullivan, K. F., Cleveland, D. W. CENP-E forms a link between attachment of spindle microtubules to kinetochores and the mitotic checkpoint. Nature Cell Biology. 2 (8), 484-491 (2000).
  23. Kim, Y., Heuser, J. E., Waterman, C. M., Cleveland, D. W. CENP-E combines a slow, processive motor and a flexible coiled coil to produce an essential motile kinetochore tether. Journal of Cell Biology. 181 (3), 411-419 (2008).
  24. Qian, X., et al. Discovery of the first potent and selective inhibitor of Centromere-Associated Protein E: GSK923295. ACS Medicinal Chemistry Letters. 1 (1), 30-34 (2010).
  25. Wood, K. W., et al. Antitumor activity of an allosteric inhibitor of centromere-associated protein-E. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (13), 5839-5844 (2010).
  26. Pisa, R., Phua, D. Y. Z., Kapoor, T. M. Distinct mechanisms of resistance to a CENP-E inhibitor emerge in near-haploid and diploid cancer cells. Cell Chemical Biology. 27 (7), 850.e6-857.e6 (2020).
  27. Putkey, F. R., et al. Unstable kinetochore-microtubule capture and chromosomal instability following deletion of CENP-E. Developmental Cell. 3 (3), 351-365 (2002).
  28. Weaver, B. A., Silk, A. D., Montagna, C., Verdier-Pinard, P., Cleveland, D. W. Aneuploidy acts both oncogenically and as a tumor suppressor. Cancer Cell. 11 (1), 25-36 (2007).
  29. Silk, A. D., et al. Chromosome missegregation rate predicts whether aneuploidy will promote or suppress tumors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (44), E4134-E4141 (2013).
  30. Guo, Y., Kim, C., Ahmad, S., Zhang, J., Mao, Y. CENP-E-dependent BubR1 autophosphorylation enhances chromosome alignment and the mitotic checkpoint. Journal of Cell Biology. 198 (2), 205-217 (2012).
  31. Weaver, B. A., Cleveland, D. W. Aneuploidy: instigator and inhibitor of tumorigenesis. Cancer Research. 67 (21), 10103-10105 (2007).
  32. Nishimura, K., Fukagawa, T. An efficient method to generate conditional knockout cell lines for essential genes by combination of auxin-inducible degron tag and CRISPR/Cas9. Chromosome Research. 25 (3-4), 253-260 (2017).
  33. Owa, M., Dynlacht, B. A non-canonical function for Centromere-associated protein-E controls centrosome integrity and orientation of cell division. Communications Biology. 4 (1), 358(2021).
  34. Barabási, A. L., Oltvai, Z. N. Network biology: understanding the cell's functional organization. Nature Reviews Genetics. 5 (2), 101-113 (2004).
  35. Rossi, A., et al. Genetic compensation induced by deleterious mutations but not gene knockdowns. Nature. 524 (7564), 230-233 (2015).
  36. Ma, Z., et al. PTC-bearing mRNA elicits a genetic compensation response via Upf3a and COMPASS components. Nature. 568 (7751), 259-263 (2019).
  37. El-Brolosy, M. A., et al. Genetic compensation triggered by mutant mRNA degradation. Nature. 568 (7751), 193-197 (2019).
  38. Kung, P. P., et al. Chemogenetic evaluation of the mitotic kinesin CENP-E reveals a critical role in triple-negative breast cancer. Molecular Cancer Therapeutics. 13 (8), 2104-2115 (2014).
  39. Kim, J. H., et al. Development of a novel HAC-based "gain of signal" quantitative assay for measuring chromosome instability (CIN) in cancer cells. Oncotarget. 7 (12), 14841-14856 (2016).
  40. Hirayama, T., et al. Synthetic studies of centromere-associated protein-E (CENP-E) inhibitors: 1. Exploration of fused bicyclic core scaffolds using electrostatic potential map. Bioorganic & Medicinal Chemistry. 21 (17), 5488-5502 (2013).
  41. Hirayama, T., et al. Synthetic studies on Centromere-associated protein-E (CENP-E) inhibitors: 2. Application of electrostatic potential map (EPM) and structure-based modeling to Imidazo[1,2-a]pyridine derivatives as anti-tumor agents. Journal of Medicinal Chemistry. 58 (20), 8036-8053 (2015).
  42. Ohashi, A., et al. A novel time-dependent CENP-E inhibitor with potent antitumor activity. PLoS One. 10 (12), e0144675(2015).
  43. Ohashi, A., et al. Aneuploidy generates proteotoxic stress and DNA damage concurrently with p53-mediated post-mitotic apoptosis in SAC-impaired cells. Nature Communications. 6, 7668(2015).
  44. Ding, X., et al. Probing CENP-E function in chromosome dynamics using small molecule inhibitor syntelin. Cell Research. 20 (12), 1386-1389 (2010).
  45. Liu, X., et al. Phase separation drives decision making in cell division. Journal of Biological Chemistry. 295 (39), 13419-13431 (2020).
  46. Henderson, M. C., et al. UA62784, a novel inhibitor of centromere protein E kinesin-like protein. Molecular Cancer Therapeutics. 8 (1), 36-44 (2009).
  47. Yamane, M., et al. Identification of benzo[d]pyrrolo[2,1-b]thiazole derivatives as CENP-E inhibitors. Biochemical and biophysical research communications. 519 (3), 505-511 (2019).
  48. Lock, R. B., et al. Initial testing of the CENP-E inhibitor GSK923295A by the pediatric preclinical testing program. Pediatric Blood & Cancer. 58 (6), 916-923 (2012).
  49. Chung, V., et al. First-time-in-human study of GSK923295, a novel antimitotic inhibitor of centromere-associated protein E (CENP-E), in patients with refractory cancer. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 69 (3), 733-741 (2012).
  50. Hsu, P. D., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nature biotechnology. 31 (9), 827-832 (2013).
  51. Weaver, B. A., Cleveland, D. W. Decoding the links between mitosis, cancer, and chemotherapy: The mitotic checkpoint, adaptation, and cell death. Cancer Cell. 8 (1), 7-12 (2005).
  52. Manchado, E., Guillamot, M., Malumbres, M. Killing cells by targeting mitosis. Cell Death and Differentiation. 19 (3), 369-377 (2012).
  53. Dang, Y., et al. Optimizing sgRNA structure to improve CRISPR-Cas9 knockout efficiency. Genome Biology. 16, 280(2015).
  54. Ratz, M., Testa, I., Hell, S. W., Jakobs, S. CRISPR/Cas9-mediated endogenous protein tagging for RESOLFT super-resolution microscopy of living human cells. Scientific Reports. 5, 9592(2015).
  55. Koch, B., et al. Generation and validation of homozygous fluorescent knock-in cells using CRISPR-Cas9 genome editing. Nature Protocols. 13 (6), 1465-1487 (2018).
  56. Yan, Q., et al. Multiplex CRISPR/Cas9-based genome engineering enhanced by Drosha-mediated sgRNA-shRNA structure. Scientific Reports. 6, 38970(2016).
  57. Cheng, Y., et al. CRISPR/Cas9-mediated chicken TBK1 gene knockout and its essential role in STING-mediated IFN-β induction in chicken cells. Frontiers in Immunology. 9, 3010(2019).
  58. Zhou, Y., et al. High-throughput screening of a CRISPR/Cas9 library for functional genomics in human cells. Nature. 509 (7501), 487-491 (2014).
  59. Zeng, W., Guo, L., Xu, S., Chen, J., Zhou, J. High-throughput screening technology in industrial biotechnology. Trends in Biotechnology. 38 (8), 888-906 (2020).
  60. Tsai, S. Q., et al. GUIDE-seq enables genome-wide profiling of off-target cleavage by CRISPR-Cas nucleases. Nature Biotechnology. 33 (2), 187-197 (2015).
  61. Kim, D., et al. Genome-wide analysis reveals specificities of Cpf1 endonucleases in human cells. Nature Biotechnology. 34 (8), 863-868 (2016).
  62. Komor, A. C., Kim, Y. B., Packer, M. S., Zuris, J. A., Liu, D. R. Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage. Nature. 533 (7603), 420-424 (2016).
  63. Nishimasu, H., et al. Engineered CRISPR-Cas9 nuclease with expanded targeting space. Science. 361 (6408), 1259-1262 (2018).
  64. Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).
  65. Ablain, J., Durand, E. M., Yang, S., Zhou, Y., Zon, L. I. A CRISPR/Cas9 vector system for tissue-specific gene disruption in zebrafish. Developmental Cell. 32 (6), 756-764 (2015).
  66. Pickar-Oliver, A., Gersbach, C. A. The next generation of CRISPR-Cas technologies and applications. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (8), 490-507 (2019).
  67. Nalawansha, D. A., Gomes, I. D., Wambua, M. K., Pflum, M. K. H. HDAC inhibitor-induced mitotic arrest is mediated by Eg5/KIF11 acetylation. Cell Chemical Biology. 24 (4), 481.e5-492.e5 (2017).
  68. Kavalapure, R. S., et al. Design, synthesis, and molecular docking study of some 2-((7-chloroquinolin-4-yl) amino) benzohydrazide Schiff bases as potential Eg5 inhibitory agents. Bioorganic Chemistry. 116, 105381(2021).
  69. Calligaris, D., Lafitte, D. Chemical inhibitors: the challenge of finding the right target. Chemistry & Biology. 18 (5), 555-557 (2011).
  70. Łomzik, M., et al. Metal-dependent cytotoxic and kinesin spindle protein inhibitory activity of Ru, Os, Rh, and Ir half-sandwich complexes of Ispinesib-derived ligands. Inorganic Chemistry. 59 (20), 14879-14890 (2020).
  71. Ferro, L. S., et al. Structural and functional insight into regulation of kinesin-1 by microtubule-associated protein MAP7. Science (New York, N.Y.). 375 (6578), 326-331 (2022).
  72. Atherton, J., et al. The mechanism of kinesin inhibition by kinesin-binding protein. eLife. 9, e61481(2020).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

CENP E KnockoutCRISPR Cas9HeLa CellsGene EditingChromosome AlignmentPhenotype ScreeningMitotic DefectsFluorescence MicroscopyKaryotype AnalysisCell Cycle Arrest

Related Articles