הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

חלון מיוצב להדמיה תוך חיונית של הלבלב המוריני

2.8K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/65498

⸱

6 באוקטובר 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery, Einstein College of Medicine / Montefiore Medical Center, 2Department of Pathology, Einstein College of Medicine / Montefiore Medical Center, 3Integrated Imaging Program for Cancer Research, Einstein College of Medicine / Montefiore Medical Center, 4Department of Anatomy and Structural Biology, Einstein College of Medicine / Montefiore Medical Center, 5Breast Center, Peking University People's Hospital, 6Department of Microbiology & Immunology, Einstein College of Medicine / Montefiore Medical Center, 7Montefiore Einstein Cancer Center, Einstein College of Medicine / Montefiore Medical Center, 8Cancer Dormancy and Tumor Microenvironment Institute, Albert Einstein College of Medicine / Montefiore Medical Center, 9Gruss-Lipper Biophotonics Center, Einstein College of Medicine / Montefiore Medical Center, 10Department of Cell Biology, Einstein College of Medicine / Montefiore Medical Center

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

אנו מציגים פרוטוקול להשתלה כירורגית של חלון אופטי מיוצב להדמיה ברזולוציה תת-תאית של הלבלב המורין, המאפשר מחקרים סדרתיים ואורכיים של הלבלב הבריא והחולה.

תקציר

הפיזיולוגיה והפתופיזיולוגיה של הלבלב מורכבות. מחלות הלבלב, כגון דלקת הלבלב ואדנוקרצינומה של הלבלב (PDAC) הן בעלות תחלואה ותמותה גבוהות. הדמיה תוך-חיונית (IVI) היא טכניקה רבת עוצמה המאפשרת הדמיה ברזולוציה גבוהה של רקמות הן במצב בריא והן במצב חולה, ומאפשרת תצפית בזמן אמת על הדינמיקה של התא. IVI של הלבלב המורין מציב אתגרים משמעותיים בשל האופי הקרבי העמוק והתואם של האיבר, מה שהופך אותו למועד מאוד לנזק ותנועה.

מתואר כאן תהליך ההשתלה של Stabilized Window for Intravital imaging of the murine Pancreas (SWIP). SWIP מאפשר IVI של הלבלב murine במצבים בריאים נורמליים, במהלך המעבר מהלבלב הבריא לדלקת לבלב חריפה הנגרמת על ידי cerulein, ובמצבים ממאירים כגון גידולים בלבלב. בשילוב עם תאים המסומנים גנטית או מתן צבעים פלואורסצנטיים, SWIP מאפשר מדידה של דינמיקה של תא בודד ותת-תאי (כולל הגירה חד-תאית וקולקטיבית) כמו גם הדמיה סדרתית של אותו אזור עניין במשך מספר ימים.

היכולת ללכוד נדידת תאי גידול היא בעלת חשיבות מיוחדת מכיוון שהגורם העיקרי לתמותה הקשורה לסרטן ב- PDAC הוא הנטל הגרורתי העצום. הבנת הדינמיקה הפיזיולוגית של גרורות ב- PDAC היא צורך קריטי שלא נענה וחיוני לשיפור הפרוגנוזה של המטופל. בסך הכל, SWIP מספק יציבות הדמיה משופרת ומרחיב את היישום של IVI בלבלב בריא ומחלות לבלב ממאירות.

מבוא

מחלות לבלב שפירות וממאירות עלולות לסכן חיים, עם פערים ניכרים בהבנת הפתופיזיולוגיה שלהן. דלקת הלבלב - דלקת בלבלב - היא הגורם השלישי בחשיבותו לאשפוזים ואשפוזים חוזרים הקשורים למחלות במערכת העיכול בארה"ב והיא קשורה לתחלואה משמעותית, תמותה ונטל סוציו-אקונומי1. מדורג כגורם השלישי המוביל למוות הקשור לסרטן2, אדנוקרצינומה של צינור הלבלב (PDAC) מהווה את רוב הממאירויות בלבלב3 ומבשר על שיעור הישרדות גרוע של 5 שנים של 11% בלבד 2. הגורם המוביל לתמותה מסרטן ב-PDAC הוא עומס גרורתי עצום. למרבה הצער, רוב החולים נוכחים עם מחלה גרורתית. לכן, הבנת הדינמיקה של גרורות ב-PDAC היא צורך קריטי שלא נענה בתחום חקר הסרטן.

המנגנונים העומדים בבסיס הדלקת והמפל הגרורתי של הלבלב אינם מובנים היטב. תורם עיקרי לפער הידע הזה הוא חוסר היכולת לצפות בדינמיקה התאית של הלבלב in vivo. התבוננות ישירה בדינמיקה התאית הזו מבטיחה לחשוף מטרות קריטיות כדי למנף ולשפר את האבחון והטיפול בחולי מחלות לבלב.

הדמיה תוך-חיונית (IVI) היא טכניקת מיקרוסקופיה המאפשרת לחוקרים לדמיין ולחקור תהליכים ביולוגיים בבעלי חיים בזמן אמת. IVI מאפשר הדמיה ישירה ברזולוציה גבוהה של דינמיקה תוך-תאית ומיקרו-סביבתית in vivo ובתוך הסביבה הטבעית של התהליך הביולוגי המדובר. לכן, IVI מאפשר התבוננות in vivo של תהליכים בריאים ופתולוגיים.

שיטות הדמיה עכשוויות של כל הגוף כגון MRI, PET ו- CT מציעות תצוגות מצוינות של איברים שלמים ויכולות לחשוף פתולוגיות, עוד לפני הופעת הסימפטומים הקליניים4. הם אינם מסוגלים, עם זאת, להשיג רזולוציה של תא בודד או לחשוף את השלבים המוקדמים ביותר של מחלה - לבלב או ממאירות.

מחקרים קודמים השתמשו ב- IVI ברזולוציה של תא יחיד כדי לצפות במחלות שפירות וממאירות של עור5,6, שד7, ריאות8, כבד9, מוח 10 וגידולי לבלב 11, מה שהוביל לתובנות לגבי מנגנונים של התקדמות המחלה 12. עם זאת, הלבלב המוריני מציב מכשולים משמעותיים להשגת רזולוציה של תא בודד באמצעות IVI, בעיקר בשל מיקומו הקרבי העמוק והתאימות הגבוהה שלו. יתר על כן, זהו איבר מסועף ומפוזר בתוך המזנטריה המתחבר לטחול, למעי הדק ולקיבה, מה שהופך אותו למאתגר לגישה. הרקמה גם רגישה מאוד לתנועה הנגרמת על ידי פריסטלטיקה סמוכה ונשימה. מזעור התנועה של הלבלב חיוני למיקרוסקופיה ברזולוציה של תא יחיד, מכיוון שתוצרי תנועה של אפילו מיקרונים בודדים יכולים לטשטש ולעוות תמונות, מה שהופך את המעקב אחר הדינמיקה של תאים בודדים לבלתי אפשרי13.

כדי לבצע IVI, חלון הדמיה בטני (AIW) חייב להיות מושתל בניתוח 9,11. כדי להשתיל את AIW בניתוח, מסגרת חלון מתכת נתפרת לתוך דופן הבטן. לאחר מכן, האיבר המעניין מחובר למסגרת באמצעות דבק ציאנואקרילט. בעוד שזה מספיק עבור כמה איברים פנימיים נוקשים (למשל, כבד, טחול, גידולים קשיחים), ניסיונות הדמיה של הלבלב הבריא של מורין נפגעים על ידי יציבות צידית וצירית לא אופטימלית בשל מרקם תואם הרקמה וארכיטקטורה מורכבת14. כדי להתמודד עם מגבלה זו, Park et al.14 פיתחו חלון הדמיה שתוכנן במיוחד עבור הלבלב הבריא. חלון הדמיה זה של הלבלב (PIW) ממזער את השפעת תנועת המעי והנשימה על ידי שילוב מדף מתכת אופקי בתוך מסגרת החלון, ממש מתחת לכיסוי הכיסוי, מייצב את הרקמה ושומר על המגע שלה עם זכוכית הכיסוי. בעוד שה-PIW מציע יציבות צידית מוגברת, מצאנו כי חלון זה עדיין מדגים סחף צירי ובנוסף מונע הדמיה של גידולים מוצקים גדולים בשל המרווח הצר בין מדף המתכת לכיסוי15.

כדי להתמודד עם המגבלות האלה, פיתחנו את ה-Stabilized Window for Intravital imaging of the murine Pancreas (SWIP), חלון הדמיה מושתל המסוגל להשיג הדמיה יציבה לטווח ארוך של הלבלב הבריא והחולה כאחד (איור 1)15. כאן, אנו מספקים פרוטוקול מקיף עבור ההליך הכירורגי המשמש להשתלת SWIP. למרות שהמטרה העיקרית הייתה לחקור את המנגנונים הדינמיים המעורבים בגרורות, ניתן להשתמש בשיטה זו גם כדי לחקור היבטים שונים של ביולוגיה ופתולוגיה של הלבלב.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל ההליכים המתוארים בפרוטוקול זה בוצעו בהתאם להנחיות ולתקנות לשימוש בבעלי חוליות, כולל אישור מראש של הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של מכללת אלברט איינשטיין לרפואה (IACUC).

1. פסיבציה של חלונות

הערה: פסיבציה של נירוסטה מנקה את המתכת ממזהמים ויוצרת שכבת תחמוצת דקה המגבירה מאוד את התאימות הביולוגית של המתכת לרקמות רכות, אפילו מעבר לזו של טיטניום16.

  1. התחל את תהליך הפסיבציה על ידי שטיפת מסגרות החלון האופטיות בתמיסת דטרגנט פעילה אנזימטית 1% (w/v).
  2. טבלו את המסגרות בתמיסת נתרן הידרוקסידי 5% (w/v) בטמפרטורה של 70°C למשך 30 דקות בתוך צנצנת זכוכית.
  3. הוציאו את המסגרות ושטפו אותן במים נטולי יונים.
  4. טבלו את המסגרות בתמיסת חומצת לימון בטמפרטורה של 7% (w/v) בטמפרטורה של 55°C למשך 10 דקות בתוך צנצנת זכוכית חדשה.
  5. הסירו את המסגרות ושטפו אותן שוב במים שעברו דה-יוניזציה.
  6. חזור על שלב 1.2, ולבסוף, שטוף את מסגרות החלון עם מים נטולי יונים.

2. הכנה להשתלת גידול או ניתוח חלון

הערה: במחקרים על גידולי לבלב, יש להשתיל תאי גידול ולאפשר להם לגדול לגידולים גלויים. כדי לדמיין את תאי הגידול in vivo, מומלץ להשתמש בתאים ששונו גנטית כדי לבטא חלבונים פלואורסצנטיים כגון Dendra2. שימוש בתוויות חלבון פלואורסצנטיות בהירות יקטין בעיות פוטנציאליות עם אוטופלואורסצנטיות של רקמות. חלבונים פלואורסצנטיים פוטנציאליים אחרים, צבעים, ומודלים פלואורסצנטיים של עכברים מקודדים גנטית שניתן להשתמש בהם נדונו במקומות אחרים17,18. כדי למנוע זיהום של שדה הניתוח, בצע את ההליך הכירורגי במכסה מנוע או בארון זרימה למינרי וודא כי אזורים נפרדים משמשים להכנה, ניתוח והתאוששות.

  1. לפני הניתוח, לעקר את כל כלי הניתוח באוטוקלאב, ואם יש צורך, להשתמש מעקר חרוזים חם עבור הליכים הבאים. ודא כי הניתוח משתמש בטכניקה של טיפים בלבד.
  2. הפעל את כרית הניתוח המחוממת ואת מעקר החרוזים והמתן עד שיגיע לטמפרטורת ההפעלה המתאימה. יש לנטר את טמפרטורת כרית החימום באמצעות מדחום משטח כדי למנוע כוויות פוטנציאליות. הניחו מטלית סטרילית על כרית החימום אם לא ניתן לשלוט כראוי בטמפרטורה.
    הערה: טמפרטורת הגוף במהלך הליכים קצרים (≤20 דקות), כגון השתלת גידול וחלון, מושפעת באופן מינימלי בעת שימוש בכרית כירורגית מחוממת. עם זאת, תקופות ארוכות יותר של הרדמה, כגון במהלך הדמיה ממושכת, דורשות להכניס את העכבר לתא מחומם כדי לשמור על טמפרטורת הגוף.
  3. מרדימים את העכבר עם 5% isoflurane בתא הרדמה.
  4. שלב קריטי: הורידו את כמות ההרדמה ל-2% ברגע שהעכבר מאבד את הכרתו. עקוב בקפידה אחר רמת ההרדמה ואחר חיוניות העכבר (למשל, באמצעות מד דופק)19.
  5. יש להניח טיפה קטנה של חומר סיכה לעיניים על כל עין של העכבר כדי למנוע התייבשות הקרנית.
  6. לפני הניתוח, יש למרוח קרם מסיר שיער בנדיבות על הבטן השמאלית העליונה כדי להסיר שיער. לאחר 20 שניות, יש להשתמש בנייר טישו לח כדי לנגב היטב את השיער ואת קרם depilatory. חזור על התהליך לפי הצורך עד להסרת כל השיער מאזור הניתוח.
  7. הזריקו 10 μL של buprenorphine (0.1 מ"ג / ק"ג) מדולל ב 90 μL של PBS תת עורית כדי להבטיח שיכוך כאבים לפני הניתוח.

3. השתלת גידול בלבלב

  1. להכין aliquots של תאים סרטניים בריכוז הרצוי (מבוסס על זמן הכפלת תאי הגידול). מניחים את תרחיף התא במזרק אינסולין ושומרים אותו על קרח. כדי לעקוב אחר פרוטוקול זה, השתמש ב- 106 תאי גידול סינגניים KPC 20 מרחפים במקסימום של 50 מיקרוליטר PBS, בהתאם לפרוטוקול ההזרקה האורתוטופית שהותאם מ- Erstad etal.21
    הערה: קו תאים זה שהוחדר בריכוז זה ייצר באופן שגרתי גידולים מוחשיים או גדולים כראוי במשך 10-14 ימים. יהיה צורך להעריך תת-שיבוטים של קו תאים זה וקווי תאים אחרים של הלבלב עבור ריכוזים ולוחות זמנים מתאימים כדי לייצר גידולים בגודל מתאים).
  2. לשטוף ידיים באמצעות סבון חיטוי.
  3. לפני כל ניתוח חדש, יש ללבוש כפפות סטריליות חדשות.
  4. מעבירים את העכבר למכסה המנוע הכירורגי הסטרילי ומניחים אותו במצב דקוביטוס צדדי ימני חלקי.
  5. אבטחו את הגפיים בעזרת נייר דבק.
    הערה: שימוש נכון במכשירים חשוב לאורך כל ההליך. דוגמאות להחזקת מלקחיים, מספריים של Castroviejo וכלי איסוף ואקום מוצגות באיור 2A-C.
  6. עיקרו את הבטן באמצעות חומר חיטוי (איור 2D).
  7. ודא שבעל החיים מורדם לחלוטין על ידי ביצוע בדיקת צביטת בוהן.
  8. בצעו חתך תת-קוסטלי שמאלי בקוטר 10-15 מ"מ בעור באמצעות מלקחיים ומספריים של Castroviejo (איור 2E).
  9. שליטה בהמוסטאזיס באמצעות צמר גפן או עט צמר גפן כאשר / היכן שנדרש הצורך.
  10. חלקו בזהירות את השריר התחתון בעזרת מלקחיים ומספריים של Castroviejo כדי להיכנס לצפק (איור 2F).
  11. באמצעות צמר גפן סטרילי, להחצין באופן א-טראומטי את הלבלב והטחול.
  12. הוציאו את הלבלב החוצה כך שלא יהיו קפלים (איור 2G).
  13. זהה את אתר הזרקת הגידול הרצוי בגוף או בזנב הלבלב (הרחק מכלי הדם).
  14. שלב קריטי: לאחר מיקום זהיר של הלבלב, השתמשו במלקחיים כדי לספק מתח לרקמה והכניסו את קצה מזרק האינסולין, כשהשיפוע פונה כלפי מעלה, לאתר הרצוי של הלבלב לעומק של 4-5 מ"מ (איור 2H).
  15. להזריק לאט את תמיסת תאי הגידול. חפשו בועה קטנה שמאשרת הזרקה מוצלחת (איור 2I).
  16. החזירו בזהירות את הלבלב לבטן מבלי להפריע לבועת הזרקת תאי הגידול (איור 2J).
  17. באמצעות תפרים נספגים של 5-0 פולידיוקסאנון, סגרו תחילה את שכבת השריר ולאחר מכן את העור באמצעות תפרים קטועים (איור 2K-N).
  18. כסו את החתך בדבק ציאנואקרילט (איור 2O), ואז החזירו את העכבר לכלוב נקי מתחת למנורת חימום לצורך התאוששות. מתן אנטיביוטיקה במי שתייה כדי למנוע זיהום. עקוב אחר העכברים ואפשר להם להתאושש לחלוטין מהניתוח.
    הערה: אנטיביוטיקה ניתנת כנדרש על פי פרוטוקול IACUC. כל בעלי החיים שוכנים בנפרד.
  19. לאפשר לגידול להתפתח במשך 10-14 ימים עד שהוא מוחשי דרך דופן הבטן.

4. ניתוח חלון לבלב

  1. כאשר בעלי החיים מוכנים להדמיה, התחל בניתוח השתלת חלון. כדי להתחיל, לשטוף ידיים עם סבון חיטוי.
  2. לפני כל ניתוח חדש, יש ללבוש כפפות סטריליות רעננות.
  3. על מעמד כירורגי מחומם, הניחו את העכבר במצב דקוביטוס צדדי ימני כדי לחשוף את הבטן השמאלית.
  4. עוגן את הגפיים הקדמיות והאחוריות של העכבר לשלב הניתוח המחומם בצורה גולגולתית וקאודלית באמצעות נייר דבק. ודאו שהטחול (מתחת לעור) נראה בתוך שדה הניתוח (איור 3A).
  5. כדי לשמור על סטריליות, פרקו את כל כלי הניתוח במכסה המנוע.
  6. לחטא את אתר הניתוח על ידי ספוג העור של העכבר עם יישום נדיב של חיטוי.
  7. ודא שבעל החיים מורדם לחלוטין על ידי ביצוע בדיקת צביטת בוהן.
  8. שלב קריטי: הרימו את עור הרביע העליון השמאלי של הבטן בעזרת מלקחיים ובצעו חתך מעגלי ~10 מ"מ בעור ובשרירים באמצעות מספריים של Castroviejo (איור 3B,C).
  9. לשלוט על הדימום ולשמור על hemostasis באמצעות צמר גפן או עט cautery, במידת הצורך.
  10. למקם את הלבלב, אשר מחובר לטחול, ולזהות את הכיוון הלבלב מונח בתוך החתך כדי להחליט היכן יש למקם את התפר הצולב.
  11. באמצעות תפר משי 5-0, מניחים את התפר הראשון במיקום הרצוי בשכבת השריר. תיקו זה עם 3-5 קשרים. (איור 3D,E)
  12. ממשיכים לתפור ישירות לרוחב החתך. חתכו והשאירו זנב של ~5 ס"מ (איור 3F).
  13. חזור על שלבים 4.11 ו-4.12 בניצב לתפר הראשון (איור 3G,H).
  14. שלב קריטי: הרימו ומקמו בעדינות את הלבלב מעל התפר הצולב, (איור 3I,J). היזהר לא לפגוע בלבלב במהלך מניפולציה.
  15. שלב קריטי: באמצעות תפר משי 5-0, בצעו תפר של חוט ארנק ~1 מ"מ מהחור, באופן היקפי, תוך שזירה של העור ושכבת השריר (איור 3K).
  16. מקמו את מסגרת החלון כך שקצוות החתך העגול יהיו בתוך החריץ של החלון (איור 3L).
  17. הדקו את החלון המושתל על ידי קשירה חזקה של משי 5-0.
  18. יש להעמיס 100 μL של דבק ציאנואקרילט נוזלי לתוך מזרק 1 מ"ל.
  19. יבש את הרקמה על ידי החלת זרימה עדינה של אוויר דחוס במשך ~ 10 שניות.
  20. אחזו את מסגרת החלון בקצה החיצוני שלה במלקחיים והרימו אותה בעדינות כדי להבטיח הפרדה של הלבלב מתחת לפני השטח של מסגרת החלון.
  21. שלב קריטי: הניחו שכבה דקה של דבק ציאנואקרילט נוזלי לאורך שקע החלון (איור 3M). הקפד לא לקבל שום דבק על רקמת הלבלב.
  22. באמצעות טנדרים ואקום, הרימו את הכיסוי בקוטר 5 מ"מ.
  23. הניחו בזהירות את הכיסוי בתוך השקע במרכז מסגרת החלון האופטי. החזק בלחץ קל, ומאפשר לדבק הציאנואקרילט להתקבע (~ 25 שניות).
  24. יש להפריד את הכיסוי מאיסוף הוואקום באמצעות מלקחיים.
  25. הדקו את התפרים הצולבים כדי להצמיד את הלבלב היטב למכסה (איור 3N,O). הערה: אין להדק יתר על המידה את התפר הצולב, שכן הוא עלול לגרום נזק ואיסכמיה ללבלב.
  26. חותכים את קצות התפר.
  27. הפשיט את הקלטת מהעכבר.
  28. כבו את מכשיר האידוי איזופלורן.
  29. העבר את העכבר לכלוב נקי או ישירות למיקרוסקופ התוך-חיוני.
  30. שכן את בעלי החיים בנפרד לאחר ניתוח החלון והשגיח עליהם עד להחלמה מלאה.
  31. לאחר מכן מתבצעת הדמיה במיקרוסקופ מולטיפוטון בעל שני לייזרים כפי שתיארנו בעבר 22,23,24 עבור מפגשי הדמיה ארוכים העכבר ממוקם בתא מחומם כדי לשמור על טמפרטורת הגוף ומסופק עם נוזלים תומכים בהתאם לתקני IACUC.

5. טיפול Cerulein עבור אינדוקציה של הלבלב

  1. כדי לחקור את הופעת הלבלב, לטפל בעכברים בריאים עם cerulein לאחר ההשתלה של SWIP. ודא כי העכברים צמים במשך 14-18 שעות ונותנים להם מים ad libitum לפני מתן cerulein.
  2. הזריקו 50 מיקרוגרם/ק"ג של צרולין ב-100 מיקרוליטר של DPBS סטרילי 1x תוך צפקי במרווחים של שעה למשך עד שמונה זריקות. יש לתת נפח שווה ערך של 1x DPBS בלבד, המוזרק תוך צפקית, לעכברי הביקורת.
  3. לאחר ההדמיה, יש להקריב את העכברים 24 שעות לאחר הזריקה הראשונה על ידי פריקת צוואר הרחם בהתאם לתקני IACUC.
  4. בצע הדמיה במיקרוסקופ מולטיפוטון דו-לייזר כמתואר לעיל22,23,24. למפגשי הדמיה ארוכים, הניחו את העכבר בתא מחומם כדי לשמור על טמפרטורת הגוף ולספק לו נוזלים תומכים בהתאם לתקני IACUC.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

איור 1, שהותאם מ-Du et al.15, מראה תמונות סטילס מסרט IVI בהילוך מהיר של הלבלב המורין. ניתן לראות תנועה מסוימת של רקמות במהלך תקופת השקיעה הראשונית (השעה הראשונה של ההדמיה, איור 1A). אולם עם המשך ההדמיה לאחר תקופת השקיעה הזו (>75 דקות), ראינו עלייה ביציבות הצידית והצירית (איור 1B). השוואת היציבות של SWIP עם חלונות הדמיה קודמים של AIW ו- PIW מזהה שכל החלונות דורשים פרק זמן ראשוני לשיקוע. עם זאת, SWIP הציג את...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

פרוטוקול SWIP המתואר כאן מספק שיטה משופרת לייצוב רקמת הלבלב על ידי שימוש בטכניקת סל תפר צולב. חלונות דימות בטן מוקדמים (AIWs) אפשרו הדמיה תוך חיונית (IVI) של איברים פנימיים של הבטן, אך לא הגבילו במידה מספקת את תנועת הרקמות הרכות כגון הלבלב. בתגובה, פארק ועמיתיו פיתחו חלון הדמיה לבלב (PIW) המשלב מדף מתכת אופקי ומאפשר ייצוב משופר של רקמת הלבלב תוך שמירה על מגע עם כיסוי הזכוכית. בעוד שגישה זו משפרת את היציבות הרוחבית, היא מגבילה הדמיה של גידולי לבלב מוצקים מכיוון שגודלם עולה על המרווח הצר בין המדף לזכוכית הכיסוי. SWIP מטפל ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

תודות

קרן הצדקה ע"ש אוולין ליפר, מרכז גרוס-ליפר לביופוטוניקה, תוכנית הדימות המשולבת לחקר הסרטן, מלגת T-32 של NIH (CA200561) ומענק של תוכנית מחקר סרטן הלבלב של משרד ההגנה (PCARP) PA210223P1.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
תמיסה של 1% (w/v) של חומר ניקוי פעיל אנזימיםAlconox IncNAחומר ניקוי אניוני מרוכז עם אנזימי פרוטאז לניקוי ידני וקולי
5% (w/v) תמיסה של נתרן הידרוקסידSigma-AldrichS8045מגיב פסיבציה
5 מ"מ כיסוי זכוכיתאלקטרונים מדעי מיקרוסקופיה72296-05כיסויי זכוכית עגולים 
תמיסה של 7% (w/v) של חומצת לימוןSigma-Aldrich 251275מגיב פסיבציה
28G 1 מ"ל BD מזרק אינסוליןBD329410מזרק להזרקת תאים
Baytril 100 (אנרופלוקסצין)באייר (סנטה קרוז ביוטכנולוגיה)sc-362890Rxמנורת חום אנטיביוטית
ספסל הרמקמאסטר-קאר3349K51מנורת חום
בופרנורפין 0.3 מ"ג/מ"לCovetrus צפון אמריקה059122בופרנורפין משכך כאבים
Castroviejo מספריים מעוקליםמכשירי דיוק עולמייםWP2220מספריים לחיתוך רקמות
C57BL / 6Jעכבר מעבדת ג'קסון000664 עכבר C57BL/6J
תמיסת כלורהקסידיןDurvet7-45801-10258-3תמיסת חיטוי כלורהקסידין
מיכל אוויר דחוסFalconDPSJB-12אוויר דחוס לייבוש רקמות
ציאנו אקרילט - סיכות דבק סופר ג'ל234790-6דבק עור
ציאנו אקרילט - סיכות דבק-על נוזליLOC1647358דבק כיסוי
DPBS 1xקורנינג21-031-CVDPBS להזרקות סרולאין/תאים
ערכת קוטר תאומים מכשירהרווארד 726067
עט נביטה 500CellPoint ScientificGER  5287-120Vמעקר חרוזים
Graefe מיקרו מלקחיים; משונן; עקומה קלה; רוחב קצה 0.8 מ"מ; אורך 4 אינץ'Roboz כירורגיRS-5135 מלקחיים לניתוח מיקרו של Graefe
מיקרוסקופ הדמיהNANAראה Entenberg et al. 2011 [27]
תוכנת הדמיהNANAראה Entenberg et al. 2011 [27]
Isoethesia (isoflurane)Henry Schein Animal Health50033Isoflurane Anesthesia
Kim WipesFisher Scientific06-666-A קים מגבונים
קלטת מעבדהפישר סיינטיפיק159015Rערכת ניתוח עכבר קלטת מעבדה
מכשירים מדויקים בעולםמכשיריםכירורגיים מכשירים כירורגיים
כף עכבר חיישן אוקסימטר דופקקנט מדעי קורפוחיישן MSTAT-MSEדופק אוקסימטר
עכבר Surgisuiteקנט סיינטיפיקSURGI-M04פלטפורמה מחוממת
Nair הסרת שיער תחליבאמזוןB001RVMR7Kתחליב אפילציה
חמצןTechAirOX TMחמצן
PERMA-HAND תפרי משי קלועים שחורים, ETHICON גודל 5-0VWR95056-872תפר משי
פוספט חוצץ מי מלח 1xLife Technologies10010-023PBS
PhysioSuite SystemKent ScientificPhysioSuiteפלטפורמה מחוממת בקר
Puralubeהנרי שיין בריאות בעלי חיים008897חומר סיכה לעיניים
פוריטני לא סטרילי כותנה עם קצה כותנה Fisher Scientific867WCNOGLUECotton Swabs
SHARP טיפים למחסום דיוק, עבור P-100, 100 ומיקרו; Lדנוויל סיינטיפיק בע"מP1125100 ומיקרו; L טיפים לפיפט
טטרמתילרודמין איזותיוציאנט&ndash– DextranSigma-AldrichT1287-500MGתווית כלי דם
צלחת לקיבוע חלונותNANA צלחת בהתאמה אישית למיקום חלונות על במת המיקרוסקופ. הצלחת עשויה מ-0.008 במלאי נירוסטה. למידות הצלחת ראה Entenberg et al., 2018 [8].
מסגרת חלוןNANAהחלון מורכב ממסגרת פלדה עם צמצם מרכזי המקבל כיסוי של 5 מ"מ. חריץ של 1.75 מ"מ סביב היקף המסגרת מספק מקום לשריר הצפק ולשכבות העור להיצמד אליו. ראה Entenberg et al., 2018 [8].

מקורות

  1. Peery, A. F., et al. Burden and cost of gastrointestinal, liver, and pancreatic diseases in the United States: Update 2021. Gastroenterology. 162 (2), 621-644 (2022).
  2. Siegel, R. L., Miller, K. D., Wagle, N. S., Jemal, A. Cancer statistics, 2023. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 73 (1), 17-48 (2023).
  3. Adamska, A., Domenichini, A., Falasca, M. Pancreatic ductal adenocarcinoma: Current and evolving therapies. International Journal of Molecular Sciences. 18 (7), 1338(2017).
  4. Coste, A., Oktay, M. H., Condeelis, J. S., Entenberg, D. Intravital imaging techniques for biomedical and clinical research. Cytometry A. 97 (5), 448-457 (2020).
  5. Peters, N. C., et al. In vivo imaging reveals an essential role for neutrophils in leishmaniasis transmitted by sand flies. Science. 321 (5891), 970-974 (2008).
  6. Alexander, S., Koehl, G. E., Hirschberg, M., Geissler, E. K., Friedl, P. Dynamic imaging of cancer growth and invasion: a modified skin-fold chamber model. Histochemistry and Cell Biology. 130 (6), 1147-1154 (2008).
  7. Harney, A. S., et al. Real-time imaging reveals local, transient vascular permeability, and tumor cell intravasation stimulated by TIE2hi macrophage-derived VEGFA. Cancer Discovery. 5 (9), 932-943 (2015).
  8. Entenberg, D., et al. A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis. Nature Methods. 15 (1), 73-80 (2018).
  9. Ritsma, L., et al. Intravital microscopy through an abdominal imaging window reveals a pre-micrometastasis stage during liver metastasis. Science Translational Medicine. 4 (158), 158ra145(2012).
  10. Park, K., You, J., Du, C., Pan, Y. Cranial window implantation on mouse cortex to study microvascular change induced by cocaine. Quantitative Imaging in Medicine and Surgery. 5 (1), 97-107 (2015).
  11. Beerling, E., Oosterom, I., Voest, E., Lolkema, M., van Rheenen, J. Intravital characterization of tumor cell migration in pancreatic cancer. Intravital. 5 (3), e1261773(2016).
  12. Entenberg, D., Oktay, M. H., Condeelis, J. S. Intravital imaging to study cancer progression and metastasis. Nature Reviews: Cancer. 23 (1), 25-42 (2023).
  13. Entenberg, D., et al. time-lapsed, large-volume, high-resolution intravital imaging for tissue-wide analysis of single cell dynamics. Methods. 128, 65-77 (2017).
  14. Park, I., Hong, S., Hwang, Y., Kim, P. A novel pancreatic imaging window for stabilized longitudinal in vivo observation of pancreatic islets in murine model. Diabetes & Metabolism Journal. 44 (1), 193-198 (2020).
  15. Du, W., et al. SWIP-a stabilized window for intravital imaging of the murine pancreas. Open Biology Journal. 12 (6), 210273(2022).
  16. DeBold, T. A. M., James, W. How To Passivate Stainless Steel Parts. , https://www.mmsonline.com/articles/how-to-passivate-stainless-steel-parts (2003).
  17. Drobizhev, M., Makarov, N. S., Tillo, S. E., Hughes, T. E., Rebane, A. Two-photon absorption properties of fluorescent proteins. Nature Methods. 8 (5), 393-399 (2011).
  18. Ueki, H., Wang, I. H., Zhao, D., Gunzer, M., Kawaoka, Y. Multicolor two-photon imaging of in vivo cellular pathophysiology upon influenza virus infection using the two-photon IMPRESS. Nature Protocols. 15 (3), 1041-1065 (2020).
  19. Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), pdb prot5563(2011).
  20. Moral, J. A., et al. ILC2s amplify PD-1 blockade by activating tissue-specific cancer immunity. Nature. 579 (7797), 130-135 (2020).
  21. Erstad, D. J., et al. Orthotopic and heterotopic murine models of pancreatic cancer and their different responses to FOLFIRINOX chemotherapy. Disease Models & Mechanisms. 11 (7), dmm034793(2018).
  22. Harney, A. S., Wang, Y., Condeelis, J. S., Entenberg, D. Extended time-lapse intravital imaging of real-time multicellular dynamics in the tumor microenvironment. Journal of Visualized Experiments. (112), e54042(2016).
  23. Entenberg, D., et al. Imaging tumor cell movement in vivo. Current Protocols in Cell Biology. Chapter 19, 19.7.1-19.7.19 (2013).
  24. Entenberg, D., et al. Setup and use of a two-laser multiphoton microscope for multichannel intravital fluorescence imaging. Nature Protocols. 6 (10), 1500-1520 (2011).
  25. Rodriguez-Tirado, C., et al. Long-term high-resolution intravital microscopy in the lung with a vacuum stabilized imaging window. Journal of Visualized Experiments. (116), 54603(2016).
  26. Seynhaeve, A. L. B., Ten Hagen, T. L. M. Intravital microscopy of tumor-associated vasculature using advanced dorsal skinfold window chambers on transgenic fluorescent mice. Journal of Visualized Experiments. (131), 55115(2018).
  27. Gorelick, F. S., Lerch, M. M. Do animal models of acute pancreatitis reproduce human disease. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 4 (2), 251-262 (2017).
  28. Dolai, S., et al. Depletion of the membrane-fusion regulator Munc18c attenuates caerulein hyperstimulation-induced pancreatitis. Journal of Biological Chemistry. 293 (7), 2510-2522 (2018).
  29. Niederau, C., Ferrell, L. D., Grendell, J. H. Caerulein-induced acute necrotizing pancreatitis in mice: protective effects of proglumide, benzotript, and secretin. Gastroenterology. 88 (5 Pt 1), 1192-1204 (1985).
  30. Dunphy, M. P., Entenberg, D., Toledo-Crow, R., Larson, S. M. In vivo microcartography and subcellular imaging of tumor angiogenesis: a novel platform for translational angiogenesis research. Microvascular Research. 78 (1), 51-56 (2009).
  31. Shanja-Grabarz, X., Coste, A., Entenberg, D., Di Cristofano, A. Real-time, high-resolution imaging of tumor cells in genetically engineered and orthotopic models of thyroid cancer. Endocrine-Related Cancer. 27 (10), 529-539 (2020).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

ייצוב הלבלבאדנוקרצינומה של הלבלבמודל לפנקראטיטיסנדידת תאי גידולדימוי של תא בודדהשתלת חלוןדינמיקה תת-תאיתדימוי סדרתי
חלון מיוצב להדמיה תוך חיונית של הלבלב המוריני
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.