בדיקת דחיסה חד-צירית של חוליות מותניות של עכבר עם הטבעה של משטח הטעינה

שינויים הקשורים לגיל העצם מוכרים באופן נרחב כבעייתיים בשל הסיכון המוגבר לשברים בעצמות הקשורים לשינויים אלה. שברים בעצמות אצל בני אדם יכולים להוביל לכאב כרוני, ניידות מופחתת, נכות ארוכת טווח, סיכון מוגבר למוות ונטל כלכלי¹. טיפולים נפוצים שנחקרו כדי לטפל בסימפטומים של שינויים בעצמות הקשורים לגיל כוללים תוספי תזונה, טיפולים הורמונליים ותרופות 2,3,4,5,6,7,8,9. חקירות ראשוניות של טיפולים כאלה בבני אדם נעשות בדרך כלל באמצעות מודלים של בעלי חיים קטנים (למשל, חולדות מעבדה ועכברים), שיש להם את שני סוגי העצמות העיקריים שנמצאים בשלד האנושי¹⁰. עצמות ארוכות של התוספתן, כגון עצם ההומרוס, עצם הירך והשוקה, עשירות בעצם קליפת המוח (כלומר, קומפקטית), ואילו החוליות עשירות בעצם מבטלת (כלומר, עצם ארוגה, ספוגית או טרבקולרית)⁴. ישנו ידע הולך וגדל כי מנגנוני ויסות העצם ומסלולי האיתות שונים בין עצם קליפת המוח (למשל, עצם ארוכה באמצע דיאפיזיס) לבין עצם מבטלת (למשל, מרכז חוליות)². בגלל זה, טיפולים עשויים להיות השפעות דיפרנציאליות כי הם ספציפיים עצם או אפילו ספציפי לאתר בתוך אותה עצם ^2,3,4.

הפעלת כוח על אובייקט (למשל, עצם) גורמת לאובייקט לעבור תאוצה, עיוות או שניהם, בהתאם לתנאי הגבול של האובייקט. כאשר העצם מוגבלת, כוח נגדי בגודל שווה מתנגד לתאוצת העצם, ומתרחש עיוות. כאשר העצם מקיימת דפורמציה, נוצרת התנגדות פנימית הנקראת מתח, ממנה ישנם שני סוגים בסיסיים: כוח רגיל, בצורה של מתח או דחיסה, וכוח גזירה¹⁰. לעתים קרובות, שילוב של סוגים בסיסיים של מתח נוצר, בהתאם למערכת הכוח להחיל¹⁰. כוחו של חומר הוא יכולתו לעמוד בלחץ מבלי להיכשל. ככל שמופעלים כוחות גדולים יותר ויותר על חומר, הוא עובר בסופו של דבר עיוות קבוע, ואז נאמר שהוא עבר ממצב אלסטי (כלומר, יחזור לצורתו המקורית אם הכוח יוסר) למצב פלסטי (כלומר, לא יחזור לצורתו המקורית אם הכוח יוסר)¹¹. הנקודה שבה מתרחש המעבר ממצב אלסטי למצב פלסטי נקראת נקודת התשואה. ככל שמופעלים כוחות גדולים עוד יותר על החומר שמעבר לנקודת היבול, הוא סופג יותר ויותר מיקרו-שברים (כלומר, נזק) עד שמתרחש שבר מוחלט; בשלב זה, נאמר כי החומר נכשל^11,12. שבר בעצם מייצג כשל הן ברמה המבנית והן ברמת הרקמה¹⁰. לדוגמה, שבירה של עצם חוליה מתרחשת מכיוון שלא רק שטרבקולה מרובה נכשלת ברמה המבנית, אלא שיש גם כשל של יסודות מטריצה חוץ-תאיים כמו קולגן וגבישי הידרוקסיאפטיט בטרבקולה בודדת ברמת הרקמה.

את האירועים המכניים שהובילו לכשל של חומר ניתן למדוד במגוון שיטות בדיקה. כיפוף תלת נקודתי הוא שיטה נפוצה לבדיקת התכונות המכניות של עצמות ארוכות משלד התוספתן. שיטה זו פשוטה וניתנת לשחזור, מה שהופך אותה לשיטה המועדפת לבדיקות ביומכניות עבור חוקרים רבים¹³. על ידי הורדת קרן מוצלבת אל הדיאפיזה האמצעית של עצם ארוכה הנשענת על שתי קורות תמיכה תחתונות, שיטה זו בודקת באופן ספציפי את התכונות המכניות של אזור הדיאפיזה האמצעית, שהוא עצם קליפת המוח המאורגנת בצפיפות. מעקומות עומס-תזוזה, ניתן לקבוע השפעות כוח מתיחה על גמישות, קשיחות, כוח לכישלון, ומעבר מהתנהגות אלסטית לפלסטית של חומרי עצם, בין תכונות אחרות.

בסוג השני של העצם, המכונה עצם טרבקולרית, ספוגית, ארוגה או מבטלת, אלמנטים של עצם נוצרים למערך של מוטות וקורות הנקראים trabeculae, המעניקים מראה "ספוגי". גופי החוליות העיקריים (כלומר, סנטרה) עשירים בעצם מבטלת ולעתים קרובות הם האתרים של שברי עצם דחיסה הקשורים לגיל בבני אדם¹⁴. חוליות מותניות (כלומר, גב תחתון) הן החוליות הגדולות ביותר, נושאות את רוב משקל הגוף, והן האתר השכיח ביותר לשברים בחוליות^15,16. התכונות המכניות של גופי חוליות ניתנות להערכה ישירה בצורה הטובה ביותר באמצעות שיטות בדיקת דחיסה חד-צירית מכיוון שדחיסה צירית היא עומס הכוח הרגיל המוטל על עמודי חוליות in vivo¹⁷. דחיסה של גופי החוליות in vivo מתרחשת כתוצאה מהתכווצויות שרירים ורצועות, כוח הכבידה, וכוחות תגובת קרקע¹⁸.

בדיקת דחיסה Ex vivo של חוליות חיות קטנות יכולה להיות קשה בגלל גודלן הקטן, צורתן הלא סדירה ושבריריותן. ניתן להעריך את צורת גופי החוליות כמקבילית עם הטיה גחונית קלה וקרום גולגולתי קל¹⁷. צורה זו מציבה אתגרים להשגת בדיקות דחיסה חד-ציריות ex vivo מכיוון שללא הכנה נאותה למשטח הטעינה, כוחות דחיסה יופעלו רק על חלק משטח הטעינה, וכתוצאה מכך נוצר "מגע מקומי"^17,19. זה יכול לגרום לתוצאות לא עקביות וכישלון מוקדם¹⁹. זה לא המקרה in vivo מכיוון שמשטח ההעמסה מוקף בדיסקים בין חולייתיים במפרקי החוליות, מה שמאפשר לחלק את העומס בכל לוח קצה הגולגולת. מכלול לוחית הקצה הבין חולייתי דיסק וגולגולת ממלא תפקיד חשוב בהפעלת כוח בכל גוף החוליה ובביומכניקה של השבר לגוף החוליה^14,20. בעוד בדיקות דחיסה אינן חדשות בתחום הביולוגיה, ישנן מגבלות בשיטות הנוכחיות של בדיקה מכנית של עצמות. מגבלות אלה כוללות היעדר מודלים לחיזוי והדמיות עבור מכניקת העצם, ארכיטקטורה מרחבית גיאומטרית ייחודית, ואפילו וריאציות ביולוגיות מבוססות מדגם מובנות²¹. חשוב מכך, התחום מאותגר על ידי חוסר סטנדרטיזציה בין שיטות ומחסור כללי בשיטות מדווחות בספרות²².

ישנן שתי שיטות שדווחו בספרות להכנת חוליות מותניות מכרסמים להשגת בדיקת דחיסה חד צירית: שיטת החיתוך ושיטת ההטבעה 17,19,23,24,25,26. שיטת החיתוך דורשת לחתוך את תהליכי החוליות, לוחית קצה הגולגולת ולוחית הקצה הקאודלית מגוף החוליה. פנדלטון ואחרים ¹⁹ דיווחו בעבר על שיטה מפורטת לשימוש בשיטה זו על חוליות מותניות של עכבר. שיטה זו מציבה את האתגרים של השגת חתכים מקבילים לחלוטין הן בלוחות הקצה הקאודליים והן בלוחות הגולגולת תוך הימנעות מכל נזק לדגימה. יש לו גם את המגבלה כי צלחת קצה הגולגולת מוסר. לוחית קצה הגולגולת מכילה מעטפת צפופה של עצם קליפת המוח וממלאת תפקיד חשוב בפיזור עומסים מהדיסקים הבין חולייתיים in vivo ומעורבת בכשל של העצם עבור שברים in vivo 17,20,27. לעומת זאת, שיטת ההטבעה כוללת הסרת תהליכי החוליות תוך שמירה על שלמות לוחית קצה הגולגולת של גוף החוליה. משטח ההעמסה נעשה אופקי בקירוב על ידי הנחת כמות קטנה של מלט עצם על קצה הגולגולת של גוף החוליה. לשיטה זו יתרון בכך שהיא מתגברת על האתגרים הטכניים הקשורים לשיטת החיתוך ועשויה לחקות טוב יותר את מנגנון הפעלת העומס ואי ספיקת עצם in vivo עקב שימור לוחית קצה הגולגולת. גישה זו תועדה בעבר במחקרים שכללו בדיקות דחיסה חד-צירית על עצמות חולדות. עם זאת, ככל הידוע לנו, זה לא תועד בעבר בהקשר של חוליות מותניות עכבר קטנות יותר 17,25,26. השיטה המדוברת פורטה בעבר על ידי Chachra et ^al.25 ובמקור השתמשה בדגימת עצם שהוחזקה בין שני לוחות, כל אחד עם חלל גלילי, אשר לאחר מכן היה מלא פולימתילמתקרילט (PMMA). אותה קבוצת מחקר שיפרה מאוחר יותר את השיטה שבה קצה אחד משויף בעדינות (קאודלי), ובקצה השני יש כתם קטן של מלט עצם שנוסף (גולגולתי)²⁶. שיטה זו מהווה שיפור לעומת השיטה הקודמת מכיוון שהיא ממזערת את החומר בין הלוחות והיא המוקד של מאמר זה. למרות האתגרים הקשורים לבדיקת דחיסת חוליות חד צירית, זוהי שיטה שעשויה לספק מידע רב ערך לגבי ההשפעות של טיפול מוצע על העצם, במיוחד בשילוב עם כיפוף שלוש נקודות.

כאן, מוצג השימוש במכונת בדיקת כיפוף/דחיסה תלת נקודתית הניתנת להמרה כדי לאפשר בדיקה קלה של עצמות ארוכות וגופי חוליות באמצעות מכונה אחת. יתר על כן, מוצג השימוש בשיטת הטבעה להשגת בדיקת דחיסה חד צירית של חוליות מותניות של עכבר. המחקר הנוכחי בוצע כחלק ממחקר גדול יותר שמטרתו לחקור את ההשפעות של תוספי זרעי קנבוס תזונתיים על תכונות עצם השלד אצל נקבות צעירות וגדלות C57BL/6 עכברים ^5,6. בודק הכיפוף התלת-נקודתי נבנה במקור על ידי סגל וסטודנטים במחלקת ההנדסה באוניברסיטת קולורדו-פואבלו ושימש את קבוצת המחקר שלנו במבחני כיפוף תלת-נקודתיים על עצמות ארוכות [עצם הירך של החולדה ועצם השוקה⁷ והומרוס העכבר, עצם הירך והטיביה 5,6,8,9 ]. עם זאת, השינוי והיישום שלה לשימוש בבדיקות דחיסת גוף חוליה עכבר לא נחקרו. התכנון והבנייה של מכונת הכיפוף התלת-נקודתית תוארו בעבר⁷. דוח זה יתמקד בשיטות המשמשות לשינוי המכונה לבדיקת דחיסה ולתיקון תזוזת מערכת. שנית, מתוארת שיטת ההטבעה להכנת משטח העמסת גוף חוליות עכבר, יחד עם שיטות לבדיקת דחיסה חד צירית וניתוח נתוני תזוזת עומס.

כל הניסויים והפרוטוקולים נערכו בהתאם למדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה מהמכונים הלאומיים לבריאות וקיבלו אישור מהוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת מדינת קולורדו (מספר פרוטוקול: 000-000A-021). נהלים מפורטים לטיפול בבעלי חיים תוארו בעבר ^5,6. העכברים התקבלו בגיל שלושה שבועות כחלק ממחקר רחב יותר שמטרתו לחקור את ההשפעות של תזונה עם תוספת זרעי קנבוס על נקבות צעירות וגדלות C57BL/6 עכברים (ראו טבלת חומרים). מגיל 5 עד 29 שבועות, העכברים גודלו באחת משלוש דיאטות: קבוצת ביקורת (0% זרעי קנבוס), 50 גרם/ק"ג (5%) קנבוס, או 150 גרם/ק"ג (15%) קנבוס, עם שמונה עכברים בכל קבוצה ^5,6. במהלך המחקר, לעכברים הייתה גישה לתזונה ולמים שלהם, הם שוכנו בזוגות בכלובי פוליקרבונט, והוחזקו במחזור חושך של 12 שעות אור (עם אורות דולקים בין השעות 06:00 ל-18:00). משקלם ובריאותם של העכברים הוערכו מדי שבוע, וכל העכברים סיימו את המחקר בהצלחה מבלי לפתח מצבים בריאותיים שליליים. בגיל עשרים ותשעה שבועות, העכברים הורדמו עמוקות באמצעות גז איזופלורן והומתו באמצעות פריקת צוואר הרחם ^5,6. בוצע חתך בקו האמצע על פני הגחון מעצם החזה ועד הזנב, וכל האיברים התוך-חזיים, הצפקיים והרטרופריטוניאליים הוצאו מהפגרים. הפגרים נשמרו בתמיסת נתרן כלורי 0.9% בטמפרטורה של -70°C עד למועד דיסקציה של העצם לצורך בדיקת חוליות, שהתרחשה כשנה לאחר מכן.

1. הסבה של מכונת כיפוף תלת נקודתית למכונת בדיקת דחיסה

1. שחררו את הברגת הקרן הצולבת המחוברת לחיישן העומס^במכונת הכיפוף 7 בעלת שלוש הנקודות (ראו טבלת חומרים) (איור 1A,B).
2. הברג פלטה עליונה המיושרת מעצמה אל חיישן העומס (ראה טבלת חומרים) עם השחלה זהה לקורה הצולבת (איור 1C).
3. קדח שני חורים אופקיים בכל אחת מהתומכות התחתונות, שם הלוח התחתון יחובר מאוחר יותר (איור 1D).
4. יש להקיש על חוטים בשני הצדדים של לוח תחתון מפלדת אל-חלד כדי ליישר קו עם החורים שנקדחו בתמיכות התחתונות (איור 1E).
5. הדקו את הפלטה התחתונה לשתי התמיכות התחתונות באמצעות ברגי משושה מושחלים והדקו עד לאבטחה (איור 1F).
   הערה: ברגי Hex חייבים להיות בעלי חוטים התואמים את החורים המהודקים על התמיכות התחתונות ועל הלוחות העליונים/התחתונים. השימוש בפלטה עליונה המיישרת את עצמה עשוי לסייע בהשגת מגע אחיד בין הפלטה העליונה למשטח ההעמסה, אך הוא אינו מספיק בהתחשב בקערה של קצה הגולגולת של גופי החוליות. נדרשת הכנה נוספת בשיטת הכנת משטח העמסה. בעת בניית מכונת בדיקת דחיסה לעצמות בעלי חיים קטנים, שהן קטנות וחלשות יותר מחומרים תעשייתיים / הנדסיים רבים, חיוני לקחת בחשבון את קיבולת העומס של חיישן העומס ואת גודל מסגרת המטען. בנוסף, יש לנקות ולשמן את המכונות באופן קבוע כדי להבטיח תוצאות מדויקות ופעולה חלקה.

2. תיקון לתזוזה של מכונת בדיקת הדחיסה

1. ללא חומר בדיקה בין הפלטה העליונה לפלטה התחתונה, הורידו את הפלטה העליונה אל הפלטה התחתונה עד ליצירת מגע קל (~ 0.3-0.5 N כוח טעינה מראש).
2. הפעל את המכשיר במהירות הנמכה קבועה (~ 1 מ"מ לדקה) כדי להתחיל בבדיקת דחיסה. אסוף מדידות עומס (N) ותזוזה (מ"מ) באמצעות תוכנה דיגיטלית לאיסוף נתונים (ראה טבלת חומרים) לאיסוף נתונים של בדיקות מכניות.
   הערה: מכיוון שאין חומר בין הלוח העליון לתחתון, כל התזוזה שנצפתה תהיה כתוצאה מתזוזה של המכונה בלבד (_מכונת Δx) (מסגרת, תא עומס, צלחות, צימודים וכו ').
3. המשיכו להוריד את הפלטה העליונה אל הפלטה התחתונה במהירות קבועה (כלומר, מונוטונית) עד לקבלת כוחות גבוהים יותר ממה שיתקבל מכל דגימות העצם.
4. חזור על שלבים 2.1 עד 2.3 בסך הכל שלוש פעמים.
5. התווה את הנתונים עבור תזוזת מערכת (_מכונת Δx, mm) לעומת עומס מופעל (כוח, N).
6. התאימו קו רגרסיה המתאים ביותר לנתונים (איור 2A-D).
7. בגיליון אלקטרוני עם הנתונים מבדיקת דחיסת עצם, השתמש במשוואה שסופקה על-ידי ניתוח הרגרסיה כדי לקבוע את כמות התזוזה של המכונה (_מכונת Δx) המשפיעה על התזוזה המתועדת (Δx_{סה"כ נרשם}) עבור נקודת נתונים של בדיקת דחיסת חוליות מותניות של עכבר.
   הערה: לדוגמה, שקול נקודת נתונים שבה מופעל 18 N של כוח, ונרשם 2.730 מ"מ של תזוזה (Δx_{סה"כ נרשם}). על פי משוואת הרגרסיה הפולינומית מסדר שלישי לדוגמה (איור 2D) [_מכונת Δx = (4 × 10-7 x עומס מוחל³) - (8 × ^10-5 x עומס מוחל²) + (0.0044 x עומס מיושם)], 0.056 מ"מ מהעקירה שנרשמה נובעת מתזוזה של מכונה (_מכונת Δx).
   Δx_{סה"כ נרשם = מכונת} Δx + _דגימת Δx
8. תקן את ההזחה שנרשמה עבור נקודת הנתונים.
   הערה: לדוגמה, שקול את הדוגמה לעיל. אם נרשמת תזוזה של 2.730 מ"מ (Δx_{סה"כ נרשם}) ותזוזת מכונה _(מכונת Δx) מהווה 0.056 מ"מ מהסך הכולל, אז התזוזה שהדגימה (כלומר, העצם) המעניינת עברה (_דגימת Δx) היא 2.664 מ"מ. לפיכך, 2.664 מ"מ הוא התזוזה בפועל שעברה החוליה (_דגימת Δx) והוא הערך שישמש לניתוח עקומת עומס-תזוזה.
   _דגימת Δx = Δx_{סה"כ נרשם - מכונת} Δx
9. חזור על שלבים 2.7-2.8 עבור כל נקודת נתונים שנאספה עבור כל דגימה בודדת (עצם).
   הערה: שלב זה חשוב מכיוון שבמהלך בדיקת דחיסה, התזוזה שנצפתה אינה נובעת רק מתזוזה של הדגימה, אלא במקום זאת, התזוזה שנצפתה היא שילוב של תזוזה של מכונה (_מכונת Δx) (למשל, דחיסה/תזוזה של המסגרת, תא עומס, צלחות, זיווגים וכו ') והדגימה (_דגימת Δx). לכן, עבור דגימות שעוברות כמויות קטנות יחסית של עקירה, כגון אלה של חיה קטנה (למשל, עכבר), תזוזה של המערכת (_מכונת Δx) יכולה לגרום לשגיאות גדולות. ההליכים המתוארים כאן לתיקון תזוזת המערכת דווחו בעבר על ידי קלידינדי ואבוספיה²⁸, המפרטים גם שתי שיטות נוספות בנוסף לזו המתוארת כאן. כמה חוקרים צוינו להשתמש ביותר משיטה אחת לקביעת תזוזת המערכת¹⁷. כל מכונה עשויה להציג דפוסים ייחודיים ודרגות של תזוזת מערכת כאשר מופעלים עליה עומסים. מסיבה זו, יש לקבוע את מקדם תיקון התזוזה של המערכת עבור כל מכונה ולא יהיה זהה בין שתי מכונות. בניגוד לבדיקת דחיסה של עצם חוליית, לא תיצפה הפחתת כוח גדולה בעת מדידה לתזוזה של המערכת מכיוון שאין חומר בין הלוח העליון לתחתון.

3. דיסקציה של החוליה המותנית ^{החמישית} (L5) מפגר העכבר

1. הפשירו פגר עכבר קפוא בטמפרטורת החדר, תוך הקפדה על לחות רקמות ועצמות רכות על ידי יישום קבוע של תמיסה איזוטונית של 0.9% NaCl.
2. בצע חתך קטן (<0.5 ס"מ) בעור בקו האמצע הגבי ליד בסיס הזנב, ולאחר מכן הרחב את החתך לאורך כל גפה אחורית ומשוך בעדינות כדי להסיר את הפרוות מבסיס הזנב לראש החיה.
3. חותכים את שרירי דופן הבטן עד שעמוד השדרה נראה בקלות.
4. תחת מיקרוסקופ ניתוח, לדמיין את שני המפרקים sacroiliac ואת קצה הגולגולת של העצה.
5. בעזרת סכין גילוח או אזמל, בצעו חיתוך דק כדי להפריד את החוליה המותנית האחרונה (L6) מקצה הגולגולת של העצה.
6. שוב, כאשר חותכים בין החלל הבין חולייתי, מסירים את L6 ו-L5 מעמוד השדרה, ומניחים בצד L5 לניתוח (איור 3).
7. בדקו את החוליה תחת מיקרוסקופ מנתח והוציאו את כל הרקמות הרכות מהעצם, כולל הדיסק הבין חולייתי, בעיקר באמצעות רפידות גזה ובעדינות עם מלקחיים במידת הצורך.
   הערה: במחקר הנוכחי, L5 נבחרה כחוליה המעניינת, אך חוליות מותניות אחרות עשויות להיבחר לבדיקת דחיסה.

4. הכנת משטח העמסת חוליות L5 לבדיקת דחיסה חד צירית בשיטת PMMA להטמעת צמנט עצם

1. באמצעות גלגל חיתוך יהלום (ראו טבלת חומרים) המחובר לכלי סיבובי, בצעו חתך בכל פדיקור כדי להסיר את התהליך הרוחבי והקוצני (איור 4). אם נשארים מחוברים לצנטרום, תהליכים חולייתיים יכולים לגרום למגע מקומי עם הלוחות העליונים/התחתונים בתהליכים עצמם, בניגוד לפיזור של העומס לאורך הצנטרום.
2. חול עדין של הקצה הקאודלי של החוליה באמצעות נייר זכוכית עדין של 120 חצץ (ראה טבלת חומרים) כדי להסיר את כל הדיסקים הבין חולייתיים, הרקמה הרכה ואי הסדירות.
3. סמנו את הקצה הקאודלי המלוטש בטוש קבוע לזיהוי קל בהמשך.
4. ערבבו את מלט העצם PMMA בהתאם להוראות היצרן (ראו טבלת חומרים).
5. כאשר מלט העצם PMMA עדיין רך למחצה, הניחו כמות מינימלית על קצה הגולגולת (הלא מסומן) של החוליה הפונה כלפי מעלה, וודאו שכל פני השטח מכוסים בזמן שהחוליה יושבת באמבט מלח כדי לשמור על דגימת העצם לחה וקרירה.
6. כאשר ה-PMMA עדיין רך למחצה, מקמו את החוליה על הפלטה התחתונה כאשר הצד הקאודלי (המסומן) פונה כלפי מטה (איור 5).
7. הפעל את המכונה כדי להפעיל את גלגלי השיניים של הכונן והורד לאט את הפלטה העליונה אל קומפלקס צמנט העצם של החוליה + PMMA עד שנוצר מגע עם מלט העצם ומופעל כוח מינימלי (<0.5 N) לפיזור ה- PMMA באופן שווה על פני העצם. ניתן להעריך את המשטח העליון במצב נייטרלי כאופקי, וכאשר לוחצים על PMMA רך למחצה, יגרום ל- PMMA למלא את החלל בקצה הגולגולת של החוליה וליצור משטח אופקי שטוח מתחת ללוח העליון.
8. כאשר הפלטה העליונה לוחצת בעדינות כלפי מטה על מלט העצם PMMA, הניחו לדגימה לשבת ללא הפרעה עד שמלט העצם PMMA התקשה לחלוטין (~ 10 דקות לפי הוראות היצרן עבור מלט העצם PMMA ששימש במחקר הנוכחי). שמור את הדגימה באמבט מלח או תרסס אותה לעתים קרובות עם מי מלח במהלך תקופה זו כדי לשמור על הדגימה hydrated וקריר.
9. לאחר שמלט העצם PMMA התקשה לחלוטין, ניתן להתחיל בבדיקות דחיסה. איסוף נתונים עבור עומס (כלומר, כוח) (N) ותזוזה (כלומר, הטיה) (מ"מ) מהחיישנים לגיליון אלקטרוני בזמן אמת באמצעות תוכנה דיגיטלית המיועדת לאיסוף נתונים של בדיקות מכניות (ראה טבלת חומרים).
10. לאחר איסוף נתונים בסיסיים במשך 5 שניות, המופעלים בכוח טעינה מראש מינימלי של <0.5 N, התחל להוריד את הלוח העליון אל הדגימה במהירות הנמכה אחת (כלומר, מונוטונית), שנקבעה מראש כדי להתחיל את בדיקת הדחיסה (~ 1 מ"מ לדקה).
11. הפסק לאסוף נתונים לאחר שנצפתה ירידה גדולה בעומס (N), המעידה על כשל מהותי.
    הערה: הוראות היצרן יציינו את זמן ההתקשות המשוער עבור מלט עצם PMMA. זמן ההתקשות של מלט העצם PMMA עשוי להשתנות בהתאם לסוג מלט העצם PMMA בו נעשה שימוש. פעל בהתאם להוראות היצרן כדי לקבוע את זמן ההמתנה להתקשות PMMA. עם זאת, כאינדיקטור לכך שצמנט העצם PMMA התקשה לחלוטין, ניתן לערבב דגימה נוספת של מלט העצם PMMA במקביל לדגימה שתונח על החוליה אך תישמר בצד ותבדוק אם היא עדיין רכה או מוקשחת לחלוטין. אם התקשה לחלוטין, זה יכול להצביע על כך שה- PMMA על העצם גם מתקשה לחלוטין מבלי להפריע לקומפלקס העצם + PMMA. דגימת העצם חייבת להישאר מיובשת היטב וקרירה לאורך תקופות ההתקשות והבדיקות של PMMA. חשיפה קצרה של כמה דקות לאוויר יבש יכולה לגרום לשינויים בתכונות הביומכניות. חלק מהחוקרים משתמשים במכונות בדיקת דחיסה המצוידות באמבט מלח¹⁹. למכונת בדיקת הדחיסה לא הייתה אמבטיית מלח במחקר הנוכחי. במקום זאת, תרסיס עדין של מי מלח נמרח באופן קבוע לאורך תקופת ההתקשות של PMMA ותקופת הבדיקה.

5. ניתוח עקומות תזוזת עומס עבור בדיקות דחיסה חד-צירית של חוליות L5

1. העתק והדבק נתוני עומס (N) ותזוזה מתוקנת (mm) מהגיליון האלקטרוני לתוכנת גרפים טכנית וניתוח נתונים (ראה טבלת חומרים).
2. צור גרף עם עומס (N) על ציר y ותזוזת דגימה מתוקנת (_דגימת Δx, mm) על ציר ה-x (איור 6). עשה זאת בתוכנה על ידי לחיצה תחילה על Windows, טבלה חדשה, ולאחר מכן עשה זאת כדי ליצור טבלה. העתק נתוני תזוזה מתוקנת (מ"מ) וטען (N) מהגיליון האלקטרוני של הנתונים הגולמיים לטבלה החדשה.
3. לאחר מכן, צור צורת גל שתייצג נתונים גולמיים על ידי לחיצה על נתונים, ולאחר מכן לחץ על XY Pair לצורת גל ובחר נתוני תזוזה מתוקנים עבור X-Wave וטען נתונים עבור Y-Wave. ודא שהמספר הנכון של נקודות נתונים נמצא בתיבה "מספר נקודות", תן שם לצורת הגל ולאחר מכן לחץ על צור צורת גל. לאחר יצירת צורת גל, צור גרף על ידי לחיצה על Windows, ולאחר מכן על גרף חדש, ומקם את צורת הגל על ציר Y ו"מחושב" על ציר X.
4. השתמש בכלי הסמן כדי לסמן נקודות/אזורי עניין בגרף לצורך ניתוח. כמה מהנקודות/האזורים המעניינים לחישוב תכונות מכניות נפוצות של עצם שלמה מוזכרות בשלבים 5.4-5.8 (איור 6), וכוללות עבודה-לכישלון (N x mm), עומס מרבי (N), קשיחות (N/mm), עומס תפוקה (N) ותזוזה לאחר תפוקה (mm).
5. לחישוב עבודה לכישלון (N x mm), מקם סמן (A) בתחילת הבדיקה וסמן (B) בנקודה שלפני כשל החומר (כלומר, בעומס המרבי שהושג במהלך הבדיקה לפני שנצפתה ירידה גדולה בעומס).
   הערה: לפיכך, סמנים A-B יסגרו את כל הבדיקה מהרגע שבו החומר מתחיל לעמוד בכוחות ולעבור תזוזה עד לנקודה שבה החומר נכשל. ניתן למדוד עבודה לכישלון (N x mm) כשטח הכולל מתחת לעקומה (כלומר, השטח שמתחת לעקומה בין הסמנים A ו- B).
6. חשב עומס מרבי (N) כערך הגבוה ביותר עבור העומס שנצפה במהלך הבדיקה (כלומר, עומס בסמן B).
7. חשב את קשיחות החומר (N/mm) כשיפוע האזור האלסטי הליניארי (כלומר, השיפוע בין הסמנים C ו-D).
8. עומס התשואה (N) הוא העומס שבו עקומת התזוזה של העומס סוטה מלינאריות ונכנסת לאזור הפלסטיק, ובכך שומרת על עיוות קבוע (כלומר, עומס בנקודה D). חשב זאת על ידי מדידת העומס בסמן D.
9. התזוזה שלאחר התשואה (mm) היא אינדיקטור למשיכות החומר. מדדו זאת כתזוזה בין נקודת התשואה לנקודת הכשל החומרי (כלומר, התזוזה בין הסמנים D ו-B).
   הערה: הפרמטרים המפורטים לעיל הם רק חלק מהתכונות המכניות הנפוצות של עצם שלמה המדווחות. זו אינה רשימה מלאה של כל התכונות המכניות של העצם כולה שניתן לקבל מעקומת עומס-תזוזה. פרמטרים אחרים של תכונות מכניות של עצם שלמה כוללים תזוזה כוללת (מ"מ), אנרגיה אלסטית נספגת (N x מ"מ), תזוזה אלסטית (מ"מ), אנרגיה פלסטית נספגת (N x מ"מ) ותזוזה פלסטית (מ"מ), אם להזכיר כמה. יתר על כן, תכונות מכניות של עצם ברמת הרקמה אינן רשומות; אלה דורשים טרנספורמציות נתונים באמצעות מדידות אנטומיות ספציפיות, כגון קוטר עצם. קוד לדוגמה לביצוע המדידות מעקומת תזוזת העומס בתוכנה מופיע בקובץ משלים 1.

עם פרוטוקול שלב אחר שלב זה המשתמש בהטבעה של משטח הטעינה L5 ומכונת כיפוף תלת נקודתית / מכונת בדיקת דחיסה הניתנת להמרה, ניתן לבצע בדיקות דחיסה על חוליות מותניות של עכבר לצורך השוואה בין קבוצות. בסך הכל הוכנו עשרים וארבע חוליות עכבר L5 בשיטת ההטבעה. עם זאת, שלוש מהדגימות נפגעו במהלך הסרת תהליכי החוליות באמצעות גלגל חיתוך יהלום על כלי סיבובי, ולכן לא נבדקו. בהתחשב בכך, התכונות המכניות המפורטות התקבלו בהצלחה מעשרים ואחת מתוך עשרים וארבע דגימות בשיטת ההטבעה. הדגימות נבדקו חזותית לאחר כל בדיקה, וכובע PMMA לא ניזוק באף אחת מהבדיקות. כפי שצוין, העכברים ששימשו במחקר הנוכחי היו חלק ממחקר גדול יותר שמטרתו לקבוע את ההשפעות של זרעי קנבוס תזונתיים על עצמותיהן של עכברות צעירות וגדלות C57BL/6. סטטיסטיקה תיאורית של חמש תכונות מכניות של עצם שלמה המדווחת בדרך כלל מוצעת בטבלה 1. עקומות תזוזת העומס עבור כל עשרים ואחת הדגימות מוצגות באיור 7.

איור 1: ההמרה של מכונת כיפוף תלת-נקודתית למכונת בדיקת דחיסה. (A) המכונה מצוידת במלואה לפעול כמכונת כיפוף תלת-נקודתית עם חיישן התזוזה וחיישן העומס המצוינים (חיצים לבנים). (B) המכונה לאחר הסרת הקורה הצולבת. (C) המכונה לאחר יישור עצמי של פלטה עליונה הונחה במקום שבו הונחה קודם לכן קרן הצולב. (D) קורות התמיכה התחתונות עם חורים שנקדחו לתוכן. (E) פלטה תחתונה מפלדת אל-חלד עם ארבעה חורים מושחלים המחוברים אליה, ובורג מוברג חלקית לאחד החורים. שני החורים האחרים שלא נראו בתמונה נמצאים בצד הנגדי. (F) קורות התמיכה התחתונות עם הפלטה התחתונה המחוברת אליהן על ידי ארבעה ברגי משושה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: תזוזה לדוגמה של מערכת (מכונת Δx) לעומת חלקת עומס המצוידת ברגרסיה ליניארית (A), לוגריתמית (B), פולינום מסדר שני (C) ורגרסיה פולינומית מסדר שלישי (D). בדוגמה זו, פולינום מסדר שלישי מספק את ההתאמה הטובה ביותר לכל ערך R2, והרגרסיה שלו משמשת כגורם תיקון התזוזה של המערכת. תמונות מייצגות נתונים לדוגמה כדי להדגים התאמה לרגרסיה ויצטרכו להתקבל על ידי חוקרים עבור מכונות בודדות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: עמוד השדרה המותני של העכבר. עמוד חוליה מותני של עכבר תחת מיקרוסקופ מנתח לפני הסרת L6 (A), ולאחר הסרת L6, השארת L5 מחובר (B). L5 יוסר לאחר מכן ויהיה מוכן לבדיקת דחיסה. הפסים הלבנים הם הדיסקים הבין חולייתיים שנותחו והוסרו. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: אנטומיה של חוליה L5. חוליית עכבר L5 מייצגת במבט גולגולתי, קאודלי, גבי וגחוני תחת מיקרוסקופ מנתח. מידות חשובות לגוף החוליה כוללות גובה, רוחב דורסו-ונטרלי ורוחב רוחבי, כפי שמוצג על ידי הקווים הצבעוניים. הקווים המקווקווים השחורים מראים בערך היכן יש לבצע חתכים כדי להסיר את תהליכי החוליות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 5: תקופת ההתקשות של מלט עצם PMMA. חוליה L5 לדוגמה עם מלט עצם PMMA (ירוק) מונחת על לוחית קצה הגולגולת והפלטה העליונה מונמכת על צמנט עצם PMMA + קומפלקס עצם. לאחר שמלט העצם PMMA התקשה במלואו, בדיקת הדחיסה תתחיל. המשטח העליון יונמך עוד יותר עד שיבחינו בכשל של החומר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 6: בדיקת דחיסת עצם חוליה של עכבר, עקומת תזוזת עומס וניתוח נתונים. סמן A מסמן את תחילת בדיקת הדחיסה. סמן B מסמן את נקודת הכשל החומרי. סמן C מסמן את תחילת האזור האלסטי הליניארי, ואילו סמן D מסמן את הסוף (כלומר, נקודת התשואה). האזור המוצלל באפור בהיר הוא האזור האלסטי הלינארי, שבו החומר יחזור לצורתו המקורית אם יוסר העומס. האזור המוצלל באפור כהה הוא אזור הפלסטיק, שבו החומר עבר עיוות קבוע ולא יחזור לצורתו המקורית אם יוסר העומס. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 7: עקומות תזוזת עומס עבור כל עשרים ואחת דגימות העצם. הדפוסים השתנו בין העצמות. באופן כללי, השונות הגדולה ביותר הייתה בתזוזה שלאחר היבול, כאשר לכמה (n = 5) מהעצמות הייתה תזוזה קטנה יחסית לאחר היבול ולאחרות (n = 16) הייתה תזוזה גדולה יחסית לאחר היבול. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה 1: ערכים מייצגים עבור תכונות מכניות של עצם שלמה המדווחות בדרך כלל המתקבלות בשיטת ההטבעה של הכנת משטח העמסה. הערכים התקבלו באמצעות כל הפרוטוקולים המפורטים במחקר הנוכחי. לפיכך, הערכים מייצגים את אלה שניתן להשיג באמצעות השיטות המתוארות כאן. הערכים הם אמצעים ± SEM. קבוצות מייצגות נקבות עכברים C57BL/6 שניזונו מתזונה מועשרת בזרעי קנבוס שלמים בריכוזים של 0% (CON), 50 גרם/ק"ג (5%) (5HS), או 150 גרם/ק"ג (15%) (15HS) בגילאי 5-29 שבועות. עבור אחד הפרמטרים (עבודה לכישלון), נראה כי הדיאטה השפיעה על הערכים לכל ANOVA חד כיווני (p < 0.05). ערכים בעלי אותו כתב עילי של אותיות אינם שונים באופן משמעותי (p > 0.05), בעוד ערכים עם אותיות עיליות שונות שונים שונים באופן משמעותי (p < 0.05), לפי ניתוח פוסט-הוק של Tukey-Kramer.

קובץ משלים 1: קוד לדוגמה להשגת תכונות מכניות של עצם שלמה. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

המחברים מצהירים כי אין ניגוד עניינים.