גישה ייחודית לבידוד נויטרופילים ממח עצם של חולדה עם קיבולת דומה

נויטרופילים מהווים תת-קבוצה קריטית של לויקוציטים הממלאים תפקיד מרכזי בתגובה החיסונית המולדת. הם מאופיינים גרעינים מרובי אונות וגרגירים המכילים פרוטאזות שונות ופפטידים מיקרוביאליים¹. נויטרופילים מתפקדים בעיקר באמצעות דה-גרנולציה, פגוציטוזה והיווצרות רשתות חשמל. התצפית של NETs נעשתה לראשונה על ידי Takei et al. בשנת 1996 במהלך ניסוי שבו נויטרופילים היו מגורים עם phorbol myristate אצטט (PMA)². לאחר מכן, תהליך היווצרות הרשת נטבע "NETosis" על ידי Brinkmann et ^al.3 בשנת 2004. המחקר שלהם האיר עוד יותר את התפקיד המכריע של NETs בתגובות מיקרוביאליות בתיווך נויטרופילים. NETs הם מבנים דמויי רשת המורכבים מכרומטין, היסטונים וחלבונים אנטי-מיקרוביאליים המשתחררים מנויטרופילים פעילים בתגובה לגירויים זיהומיים ודלקתיים. רשתות יכולות לשתק ולהרוג פתוגנים פולשים על ידי לכידתם וחשיפתם לריכוז גבוה של פפטידים אנטי-מיקרוביאליים ופרוטאזות ^1,3. בנוסף, NETs תורמים לסילוק תאים אפופטוטיים ומשתתפים ברזולוציית דלקת. מחקרים אחרונים מצביעים גם על כך שהיווצרות מוגזמת של NETs או פגיעה בפירוק הרשת עלולה להוביל לנזק לרקמות, הפרעות אוטואימוניות, טרומבוגנזה ופגיעה ברה-וסקולריזציה 4,5,6,7,8,9,10.

התפקיד הפתוגני של NETs בפיברוזיס בלתי מבוקר לאחר אוטם שריר הלב והיווצרות מפרצות חדריות הוכח באמצעות הרחבת פיברוזיס פריווסקולרי ^4,11. מודל אוטם שריר הלב והבידוד של נויטרופילים ממח עצם בעכברים מבוססים היטב. לויקוציטים פולימורפו-גרעיניים (PMN), סוג של תאי דם לבנים המצויים בשפע בדם אנושי, משמשים כמקור מצוין לבידוד נויטרופילים אנושיים. שיטה זו מבטלת את הצורך לקצור מח עצם, ובכך משפרת את הבטיחות והיעילות.

NETs גם לשחק תפקיד בפרפור פרוזדורים הקשורים שיפוץ הלב. עם זאת, בעלי חיים גדולים כגון כלבים וחזירים נוצלו כדי למדל פרפור פרוזדורים, מכיוון שלעכברים אין אטריום גדול מספיק כדי ליצור מחזור כניסה מחדש או מודל AF, אלא אם כן תעלות יונים ספציפיות או מסלולי איתות הופלו או הושמדו¹². בעוד שניתן לגרום לפרפור פרוזדורים בחולדות ולבודד נויטרופילים מדם היקפי של חולדות כפי שתואר קודם לכן, החוקרים נתקלו במגבלה לפיה ניתן לבודד רק 2 x 10^{5-5 x} 10 5 נויטרופילים מדם היקפי (10 מ"ל לחולדה). חילוץ מספיק NETs בכל נקודת זמן דרש בערך 10-25 חולדות (5 x 10⁶ נויטרופילים בסך הכל), וכתוצאה מכך תהליך גוזל זמן, יקר, ולעתים קרובות תפוקה נמוכה¹³. בהקשר זה, לי הא ועמיתיו מציגים אסטרטגיה מוכוונת מח עצם להשגת רשתות נאותות מחולדות¹⁴. במאמרם הם מספקים תיאור מקיף של בידוד נויטרופילים ממח עצם של חולדה ומשווים את יכולות הפרשת NET של נויטרופילים היקפיים ומח עצם של חולדות. שתי השיטות המתוארות מספקות מטרות ניסוי נפרדות, ושתיהן מביאות לכמויות מספיקות של נויטרופילים ממח עצם של חולדה תוך הפחתת מספר החולדות הדרושות. שיטת הבידוד הדו-שלבי הדגימה טיהור נויטרופילים מעולה, בעוד ששיטת הצעד האחד הוכיחה את עצמה כיעילה בזמן עם רמות טיהור מקובלות. יתר על כן, החוקרים השוו NETosis והיווצרות NET בין נויטרופילים של מח עצם חולדה לבין עמיתיהם ההיקפיים, ומצאו עוצמה שווה עם PMN. ממצאים אלה תורמים באופן משמעותי למחקרים הקשורים לנויטרופילים על פרפור פרוזדורים ומדגישים את החשיבות של בחירה גמישה של מקורות שונים לבידוד נויטרופילים בחיות ניסוי שונות עם התפלגות נויטרופילים שונה.

המחקר בוצע תחת רישיון פרויקט (מס '20211404A) שניתן על ידי ועדת האתיקה של בעלי חיים בבית החולים מערב סין, אוניברסיטת סצ'ואן, בהתאם להנחיות ועדת האתיקה של בעלי חיים של בית החולים מערב סין, אוניברסיטת סצ'ואן לטיפול ושימוש בבעלי חיים. בהתאם להנחיות אתיות, החולדות ששימשו במחקר זה נשמרו בסביבה מבוקרת עם מחזור אור/חושך של 12 שעות, טמפרטורה של 22-24 מעלות צלזיוס ולחות של 50%-60%. לחולדות ניתנה גישה למזון ומים עד לליביטום. בעלי החיים ששימשו במחקר זה היו חולדות זכרים בני 6-8 שבועות מסוג Sprague Dawley (SD), במשקל של כ-250 גרם וללא פתוגנים ספציפיים. בעלי החיים התקבלו ממקור מסחרי (ראו טבלת חומרים).

1. בידוד נויטרופילים של חולדות

1. קצירת מח עצם
   1. הניחו את החולדה במיכל מתאים להרדמה (ראו טבלת חומרים). יש לתת איזופלורן 3% לחולדה עד שהחיה מאבדת את הכרתה. בדוק היעדר תגובה לצביטה בבוהן או צביטת זנב כדי להבטיח את עומק ההרדמה.
   2. לאחר שהחולדה מורדמת עמוק, בצעו נקע צוואר הרחם על ידי הנחת החולדה על גבה והחזקת זנבה ביד אחת תוך אחיזת הראש ביד השנייה. נקע את הצוואר במהירות ובחוזקה על ידי הפעלת כוח פתאומי וחזק כלפי מעלה על הזנב תוך משיכת הראש כלפי מטה עד לקטיעת עמוד השדרה הצווארי. המתן לאישור על מוות, כגון הפסקת נשימה וחוסר דופק, לפני שתמשיך באיסוף רקמות או בסילוקן.
   3. טבלו את החולדה באתנול 75% ותנו לה לשבת כמה דקות כדי לעקר את הפרווה והעור. השכיבו את החולדה על גבה וקטעו את הגפיים התחתונות בירך כדי להגן על ראש עצם הירך. השתמש במספריים לדיסקציה כדי לחתוך את הרצועה במפרק ההוק ולקפל את מפרק הברך לאחור כדי לחשוף את עצם הירך והשוקה.
   4. בעזרת מלקחיים ומספריים, הסירו בזהירות את כל השרירים, הגידים ורקמות אחרות המחוברות לעצמות. שטפו את העצמות בתמיסת מלח מאוזנת של האנק (HBSS) כדי להסיר את שאריות הרקמות והדם. חזרו על הפעולה פעמיים נוספות, ובסך הכל שלוש כביסות. הכניסו את העצמות הנקיות למיכל סטרילי.
   5. השתמש מזרק 5 או 10 מ"ל עם מחט כדי לדחוף את המוח דרך שני הקצוות של העצם כדי לשחרר את מטריצת מח. שטפו את מח העצם במדיה של 10-15 מ"ל Roswell Park Memorial Institute (RPMI) עם מזרק אחר, עד שלא ניתן יהיה לשטוף את מח העצם הנראה לעין.
   6. צנטריפוגה את תאי מח העצם ב 300 x גרם במשך 10 דקות ב 20 ° C. הוסף 5-10 מ"ל חיץ ליזה של תאי דם אדומים (ראה טבלת חומרים) כדי להשהות מחדש את התאים ולדגור בטמפרטורת החדר למשך 3 דקות. מוסיפים פי 4 מנפח HBSS לתערובת. צנטריפוגה את התאים ב 600 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר, להשליך את supernatant עם פיפטה, ולהשתמש גלולה שנוצר לשימוש נוסף.
2. בידוד נויטרופילים ממח עצם
   1. עבור השיטה הדו-שלבית, בצע את השלבים הנוספים הבאים:
      1. בודדו תאי מח עצם באמצעות ערכת בידוד נויטרופילים של חולדות ממוסחרת בהתאם להוראות היצרן (ראו טבלת חומרים).
      2. הכינו שיפוע צפיפות על ידי שכבות 2 מ"ל של מגיב פרקול 55% (ראה טבלת חומרים), 2 מ"ל של 65% מגיב, 2 מ"ל של 70% מגיב, ו -2 מ"ל של 80% מגיב בצינור צנטריפוגה חדש של 15 מ"ל. צנטריפוגה את הצינור ב 800 x גרם במשך 40 דקות ב 20 ° C, כאשר התאוצה מוגדרת ל 5 וההאטה מוגדרת ל 0 או 1.
      3. אספו את שכבת השיפוע של 70%, כולל שכבות התא בגבול שבין 65% ל-70% מגיב מעבר צבע, באמצעות פיפטה סטרילית. העבר את מתלה התא לצינור צנטריפוגה חדש של 15 מ"ל. הוסף 15 מ"ל HBSS לתוך הצינור ובעדינות להפוך את הצינור מספר פעמים כדי לשטוף את התאים. צנטריפוגה את הצינור ב 300 x גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר כדי לגלול את התאים.
   2. עבור השיטה החד-שלבית, בצע את השלבים הנוספים הבאים:
      1. יש להעביר את תאי מח העצם לשיפועים מבלי להשתמש בערכת בידוד הנויטרופילים של החולדה.
      2. אספו את שכבת השיפוע של 70%, כולל שכבות התא בגבול שבין 65% ל-70% מעבר צבע, באמצעות פיפטה סטרילית. העבירו את מתלה התא לצינור צנטריפוגה חדש של 50 מ"ל ושטפו את התאים עם HBSS. צנטריפוגה את הצינור ב 400 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר כדי pellet את התאים.
      3. ספרו את הנויטרופילים המבודדים באמצעות המוציטומטר והעריכו את הכדאיות באמצעות צביעה כחולה טריפאן.
         הערה: ניתן לשנות את הפרוטוקול בהתאם למספר החולדות ולמספר הרצוי של נויטרופילים מבודדים. כמות מקובלת של עצמות מתקבלת משלוש חולדות כאשר שיטה זו משמשת לראשונה בסביבה ניסיונית חדשה. כל ההליכים צריכים להתבצע בתנאים סטריליים. בידוד נויטרופילים ממח העצם צריך להתבצע מהר ככל האפשר כדי למזער את הנזק לתאים ואת אובדן הכדאיות.

2. רכישת רשתות חולדות

1. יש להשהות מחדש 0.5 x 10^8-1 x 10⁸ נויטרופילים מבודדים במדיית RPMI של 4 מ"ל (בתוספת 10% סרום בקר עוברי (FBS) ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין) בצלחת פטרי סטרילית בקוטר 10 ס"מ.
2. הוסף PMA של 500 ננומטר (ראה טבלת חומרים) לתרחיף הנויטרופילים כדי לגרום ל- NETosis. יש לדגור במשך 3 שעות בטמפרטורה של 37°C ו-5% CO₂.
3. עבור הבקרה השלילית, הוסף DNase I (10 U/mL) לתרחיף הנויטרופילים כדי לפרק את הרשתות המופרשות.
4. כדי לקצור את הרשתות, הסירו את המדיה ושטפו בעדינות את הרשתות המחוברות לצלחת הפטרי עם HBSS. לאחר מכן, השתמשו בשטיפה אינטנסיבית עם 4 מ"ל של מדיה טרייה עבור כל צלחת כדי לנתק את הרשתות מהצלחת.
5. יש לאסוף את מדיום הכביסה והפיפטה לעתים קרובות להשעיה מוחלטת של הרשתות.
6. צנטריפוגה את המתלה ב 300 × גרם למשך 10 דקות ב 20 ° C כדי להסיר תאים צפים.
7. העבירו את המתלה המכיל את ה-NETs לצינור סטרילי ואחסנו בטמפרטורה של -20°C לשימוש נוסף תוך שבועיים.
   הערה: רשתות רגישות להתכלות, ולכן מומלץ להשתמש בחומר שזה עתה נקטף לקבלת התוצאות הטובות ביותר.

3. אימות נוכחות של NETs

1. תקן את התאים (משלב 2.4) על גבי כיסויים עם 4% פרפורמלדהיד למשך 15 דקות ו- NETs (משלב 2.7) למשך 30 דקות עד שעה אחת.
2. הפכו את הכיסוי על טיפת PBS/PBST על מעמד מבחנה מכוסה סרט פרפין וחזרו על תהליך הכביסה שלוש פעמים במשך 5 דקות כל אחת.
3. יש להחדיר את התאים עם 0.5% Triton-X-100 למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר ולשטוף שלוש פעמים ב-PBS/PBST למשך דקה אחת כל אחד. אטמו את התאים עם סרום חמור 10% רגיל (ראו טבלת חומרים) בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת.
4. לדגור על התאים עם נוגדן נויטרופיל אלסטאז נגד חולדה ונוגדן myeloperoxidase נגד חולדה (ראה טבלה של חומרים) במשך הלילה ב 4 ° C. לאחר מכן, שטפו את הכיסוי ב-PBS/PBST שלוש פעמים למשך 5 דקות כל אחת.
5. לדגור על התאים עם נוגדן משני A488-מצומד חמור נגד ארנב IgG (H + L), חמור מצומד A594-anti-mouse IgG (H + L), ו A594-מצומד עז נגד עכבר IgG1 (ראה טבלה של חומרים) בטמפרטורת החדר במשך 1 שעה בחושך. לאחר מכן, שטפו את הכיסוי ב-PBS/PBST שלוש פעמים למשך 5 דקות כל אחת.
6. גרעיני תאי צביעה ושלדי נטו עם 10 מ"ג/מ"ל DAPI. לאחר מכן, שטפו את הכיסוי ב-PBS/PBST שלוש פעמים למשך 5 דקות כל אחת.
7. הניחו טיפה של אמצעי הרכבה על מגלשת זכוכית והפכו את הכיסוי עם תאים עליו. תן לו להתייבש במשך 1 שעה לניתוח מיקרוסקופי עם עדשות טבילה; אחרת, הוא מוכן לבדיקה.
   הערה: יש לנקוט משנה זהירות בעת מניפולציה של רשתות, גם לאחר קיבוע, מכיוון שהן שבירות ביותר ויכולות בקלות ללכת לאיבוד במהלך ההכנה.

4. כימות רשתות

1. הכן את מאגר Tris-EDTA (TE) ואת פתרון העבודה PicoGreen (מגיב בדיקת dsDNA) בהתאם להוראות היצרן (ראה טבלת חומרים).
2. הכינו תקנים על ידי דילול DNA מלאי לריכוזים של 1 ננוגרם/מ"ל, 10 נ"ג/מ"ל, 100 נ"ג/מ"ל ו-1 מיקרוגרם/מ"ל.
   הערה: כדי לכמת את ריכוז ה-NETs, נעשה שימוש בערכת בדיקת dsDNA (ראה טבלת חומרים), בהתאם להנחיות היצרן. חיץ Tris-EDTA (TE) וריאגנטים לבדיקת dsDNA הוכנו באמצעות נפח של פי 19 של מים מזוקקים כפול או נפח של פי 199 של חיץ TE, בהתאמה. לאחר מכן הוכנו תמיסות סטנדרטיות (1 ננוגרם/מ"ל, 10 נ"ג/מ"ל, 100 נ"ג/מ"ל ו-1 מק"ג/מ"ל), וכל 50 מיקרוליטר מהמדגם שולבו עם 450 מיקרוליטר של חיץ TE.
3. הוסף 50 μL מכל דגימה למאגר TE של 450 μL.
4. הוסף 100 μL של תקנים או דוגמאות יחד עם נפח שווה של פתרון עבודה מגיב בדיקה לכל באר בלוח 96 בארות, כולל תקנים ודגימות.
5. דוגרים על הצלחת בטמפרטורת החדר למשך 2-5 דקות, תוך הימנעות מאור ישיר.
6. קרא את הדגימות באמצעות קורא מיקרו-לוחות פלואורסצנטי עם ספקטרום פליטה של כ-530 ננומטר וספקטרום ספיגה של כ-480 ננומטר.
7. חשב את ריכוז ה- NETs בכל מדגם באמצעות העקומה הסטנדרטית הנוצרת על ידי התקנים.

5. ניתוח הפרשת NETs על ידי ציטומטריה של התא

1. הוסיפו כתם גרעין (ראו טבלת חומרים) לתאים המודגרים בצלחת בת 96 הקידוחים כדי להגיע לריכוז סופי של 10 ננוגרם/מ"ל ולדגור במשך 30 דקות.
2. הוסיפו לתאים כתם DNA ללא תאים (cfDNA, ראו טבלת חומרים) כדי להגיע לריכוז סופי של 300 ננומטר ולדגור במשך 10 דקות.
3. מערבבים את הצבעים הפלואורסצנטיים על ידי פיפטינג עדין. אין להשליך את הסופרנאטנט או לשטוף את הכדור.
4. טען את צלחת הדגימה במכשיר הציטומטר.
5. הגדר את הפרמטרים למיקוד ולזמן חשיפה עבור הערוצים השונים: כחול (לדוגמה: 377/50 ננומטר, em: 470/22 ננומטר), בדרך כלל עם חשיפה של 30,000 ננומטר, ירוק (לדוגמה: 483/32 ננומטר, eM: 536/40 ננומטר) בדרך כלל עם חשיפה של 5,000 אלפיות השנייה.
6. צלם תמונות אחידות במיוחד של כל הלוח בערוצים שונים.
7. נתח את ספירת כתמי הגרעין עבור קבוצות שונות. אם הם דומים, הפרשת NETs יכולה להיקבע על ידי ספירת כתמי cfDNA.

הפרוטוקול המתואר כאן מתאר שתי שיטות נפרדות, שכל אחת מהן מאופיינת בטיהור משופר או בצעדים יעילים. שתי השיטות הניבו בערך 0.5 x 108-1 x 108 נויטרופילים לכל חולדה. ניתוח ציטומטריית זרימה, תוך שימוש בערכת זיהוי אפופטוזיס ANNEXIN V-FITC/PI, הראה כדאיות תאים מעל 90%, בדומה לעמיתיהם בעכבר ובבני אדם (איור 1). בעוד שזיהום לימפוציטים נראה בלתי נמנע במהלך בידוד נויטרופילים ממח העצם, השיטה הדו-שלבית הדגימה רמת טוהר משופרת של 90% בהשוואה ל-50% שהושגו בשיטה החד-שלבית (איור 2).

תגובות דומות בהפרשת NET הובחנו בין נויטרופילים היקפיים לנויטרופילים של מח עצם, ללא קשר לגירוי PMA (איור 3). יתר על כן, רשתות של חולדות הציגו יכולות קישור צולבות מוגבלות זו עם זו (איור 4). במאמץ להעמיק בתהליך ה-NETosis של חולדות, PMA הועסק כמשרה. NETs זוהו באמצעות צביעת cfDNA, ותמונות מקיפות צולמו באמצעות מנתח הדמיה תאית. יש לציין כי נויטרופילים של חולדות הפגינו נטייה גבוהה יותר לנטאוזיס ספונטני בניגוד לנויטרופילים של עכברים ובני אדם, גם ללא גירוי חיצוני. הדגירה עם PMA הובילה לעלייה של 10% בתכולת cfDNA לאחר 4 שעות (איור 5). כאשר נחשפה ל-PMA של 500 ננומטר, מח העצם של כל חולדה הניב ריכוז סופי של 8-12 מיקרוגרם/מ"ל דנ"א נטו. ראוי לציין כי התוכן התוך-תאי הושחל באופן לא מלא בנויטרופילים של חולדות במהלך NETosis, וכתוצאה מכך נצפתה תצפית על רכיבים תוך-תאיים רבים. בנוסף, רשתות חולדות הפגינו נטייה ליצור סרט דמוי גזה בשל נטיות הדבקה משופרות, והציגו מראה דמוי ענן מובהק.

איור 1: הערכת כדאיות נויטרופילים מבידוד מח עצם. המקור האופטימלי לבידוד נויטרופילים של חולדות הוא מח עצם, המאפשר רכישת מלכודות נויטרופילים חוץ-תאיות לאחר מכן. נתון זה נלקח מתוך He et al.14. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: טיהור נויטרופילים מדם היקפי וממח עצם באמצעות צביעת רייט-גימסה. (A) מקור דם היקפי. (B) מקור מח העצם בשיטה החד-שלבית. (C) מקור מח עצם בשיטה הדו-שלבית. מיצוי מח עצם משמש כגישה המועדפת לבידוד נויטרופילים של חולדות ולרכישה של מלכודות חוץ-תאיות של נויטרופילים כתוצאה מכך. סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. הגדלה = 400x. נתון זה נלקח מתוך He et al.14. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: הפרשה נטו לאחר הדגירה עם PMA או PMA + DNase I. מיצוי מח עצם מייצג את המסלול המועדף לבידוד נויטרופילים של חולדות ולאיסוף הבא של מלכודות נויטרופילים חוץ-תאיות. נתון זה נלקח מתוך He et al.14. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: ניתוח אימונופלואורסצנטי. צביעה אימונופלואורסצנטית של הגרעין (כחול, A), MPO (ירוק, B) ומיזוג תמונה (C). NET: מלכודת נויטרופילים חוץ-תאיים; MPO: Myeloperoxidase. מיצוי מח עצם הוא השיטה המועדפת לבידוד נויטרופילים של חולדות ולאיסוף מלכודות חוץ-תאיות של נויטרופילים לאחר מכן. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. הגדלה = 200x. נתון זה נלקח מתוך He et al.14. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 5: ניתוח מקיף של cfDNA באמצעות אנלייזר הדמיה של תאים בתנאים שונים. צביעה פלואורסצנטית של cfDNA (ירוק) וגרעין (כחול). מיצוי מח עצם הוא הגישה העיקרית לבידוד נויטרופילים של חולדות ולאיסוף מלכודות נויטרופילים חוץ-תאיות כתוצאה מכך. סרגל קנה מידה = 500 מיקרומטר. נתון זה נלקח מתוך He et al.14. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר.