מאמר שיטה

הערכת ציטוטוקסיות מהירה במבחנה של קולטן אנטיגן כימרי Jurkat באמצעות הדמיה פלואורסצנטית

DOI:

10.3791/65560

⸱

27 באוקטובר 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Radiation Oncology, University of Kansas Cancer Center, 2Department of Cancer Biology, University of Kansas Cancer Center, 3BioEngineering Program, University of Kansas, 4Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of Kansas Medical Center, 5University of Kansas Cancer Center, 6Kansas Institute for Precision Medicine, University of Kansas Medical Center

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול להערכת הרג כמותי של תאי גידול על ידי תאי Jurkat המבטאים קולטן אנטיגן כימרי (CAR) המכוון לאנטיגן גידול יחיד. פרוטוקול זה יכול לשמש כפלטפורמת סינון לאופטימיזציה מהירה של מבני צירי CAR לפני אישור בתאי T היקפיים שמקורם בדם.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תאי T של קולטן אנטיגן כימרי (CAR) נמצאים בחזית האונקולוגיה. CAR בנוי מתחום מיקוד (בדרך כלל מקטע משתנה שרשרת יחיד, scFv), עם מקשר תוך-שרשרת נלווה, ואחריו ציר, טרנסממברנה ותחום קוסטימולטורי. שינוי של המקשר התוך-שרשרת ותחום הציר יכול להשפיע באופן משמעותי על הרג בתיווך רכב. בהתחשב באפשרויות השונות הרבות עבור כל חלק של מבנה CAR, ישנם מספר רב של תמורות. ייצור תאי CAR-T הוא תהליך גוזל זמן ויקר, וייצור ובדיקה של מבנים רבים הוא השקעה כבדה בזמן ובחומר. פרוטוקול זה מתאר פלטפורמה להערכה מהירה של מבני CAR ממוטבים לציר בתאי Jurkat (CAR-J). תאי Jurkat הם קו תאי T אימורטלי עם ספיגה גבוהה של לנטיוירוסים, המאפשרים העברת CAR יעילה. כאן, אנו מציגים פלטפורמה להערכה מהירה של CAR-J באמצעות הדמיה פלואורסצנטית, ואחריה אישור של ציטוליזה בתאי T שמקורם ב-PBMC.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טיפול בתאי CAR-T הראה הבטחה גדולה בממאירויות המטולוגיות, כפי שעולה מ-6 מוצרי CAR-T שאושרו על ידי ה-FDA מאז 2017, כפי שדווח על ידי המכון הלאומי לסרטן1. ישנם תאי CAR-T רבים בניסויים קליניים להתמקדות בגידולים מוצקים. תכנון מטרות CAR חדשניות ואופטימיזציה של מבנה CAR חיוניים ליעילות של תא CAR-T. בחירת מבנה CAR האידיאלי עבור כל יישום חיונית למיקוד מדויק של אנטיגנים הקשורים לגידול (TAA) תוך הימנעות מרמות נמוכות של ביטוי TAA ברקמות נורמליות2.

מבנה CAR מורכב בעיקר מחמישה תאים: (1) תחום משתנה חד-תאי חוץ-תאי (scFv) המכוון לאנטיגן גידולי; (2) תחום ציר; (3) תחום טרנסממברנלי; (4) תחום קוסטימולטורי ציטופלזמי....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: כל עבודת תרבית התאים נעשית בארון בטיחות ביולוגית עם חלוק מעבדה, כפפות וטכניקות אספטיות סטנדרטיות.

1. יצירת מכוניות המבטאות יורקטים (CAR-J)

  1. לרכוש תאי Jurkat, לשכפל E6-1 מ ATCC. הפשירו 1 x 106 תאים בבקבוק T-75 ותרבו אותם בצלוחיות T-75. שמור אותם בהשעיה ב 0.6 x 106 תאים למ"ל באמצעות Roswell Park Memorial Institute (RPMI) מדיה בתוספת 10% FBS באינקובטור ב 37 ° C עם 5% CO2.
  2. צלחת 1 x 105 תאי Jurkat לכל באר של תרבית רקמה מטופלת 24 צלחת באר ב 500 μL של RPMI מצע גידול המכיל 4 מיקרוגרם / מ"ל פוליברן אשר משפר את היעילות lentiviral. ספירת תאים באמצעות מנתח תאים עליון ....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טווח של יחס E:T בין 1:8 ל-8:1 עבור CAR-J1 הוערך ב-72 שעות, והתמקד ב-EGFR בתאי TNBC MDA-MB-231. תאי Jurkat הומרו עם CAR lentivirus עם פוליברן כדי ליצור תאי CAR-J כמתואר בשלב 2. ציטוטוקסיות של CAR-J1 עלתה באופן משמעותי עם יחס E:T גבוה יותר ללא הבדל בהרג ביחס של 1:8 (איור 1). יותר מ-50% מקרי הרג נצפו ביחס של 4:1 E:T במשך 72 שעות. E:T זה שימש לניסויים הבאים עם משך מופחת ל -48 שעות להערכה ציטוטוקסיות מהירה של מבני CAR מרובים. EGFR המכוון למבני מכוניות עם תחום הציר שונה תוכננו (טבלה 1

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן הצענו שיטה מהירה להערכה יעילה של הפעילות הציטוליטית הספציפית למטרה הנגרמת על ידי ביטוי CAR בתאי Jurkat. לכל מבני CAR יש אותו scFv אך תחומי ציר וטרנסממברנה שונים אשר הוכחו כמשפיעים על עוצמת תאי CAR-T13. הערכה נוספת של הרג לא ספציפי על ידי CAR-J אלה נעשתה על ידי תרבית שלהם עם תאי אנטיגן נוק אאוט (KO). זה מוכיח כי ההרג הוא ספציפי אנטיגן הגידול ולא עקב הפעלה בסיסית על ידי CAR-J. ניתן לקבוע בקלות פוטנציאל ציטוטוקסי של טווח יחסי E:T תוך זיהוי המספר הקטן ביותר של תאי השפעה הדרושים לסילוק תאי הגידול ב.......

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מד"א-MB-231 היו מתנה חביבה מד"ר שיין סטקליין. המחברים מודים על מימון ממרכז הסרטן של אוניברסיטת קנזס לביצוע מחקר זה.

....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
15 מ"ל צינור חרוטי (סטרילי)Midwest Scientific#C15Bכל דומה יעבוד
50 מ"ל צינור חרוטי (סטרילי)Thermo Scientific339652כל דומה יעבוד
שחור/שקוף 96 צלחת בארFalcon353219Celligo יש רשימה של צלחות תואמות
Celigo 4 Channel Imaging CytomenterNexcelcom Bioscience200-BFFL-5Cכל דומה יעבוד
Celigo SoftwareNexcelcom Bioscienceגרסה 5.3.0.0כל דומה יעבוד
חממת תרבית תאיםThermo ScientificHeraCell 160iכל דומה יעבוד
צלוחיות מטופלות בתרבית תאים (T75, גדלים שונים, סטרילי)TPP90076כל דומה יעבוד
CFSETonbo13-0850-U500כל דומה יעבוד
מנתח תאים של Cytek MuseCytek0500-3115כל דומה יעבוד
DMEMGibco11995-040כל דומה יעבוד
FBSGemini bio-products900-108כל דומה יעבוד
Flow CytometerCytek, BD וכו 'Aurora, LSR II וכו 'כל דומה יעבוד
FlowJo SortwareBecton Dickinson & חברה גרסה 10.7.1כל דומה יעבוד
Fluorobrite DMEMGibcoA18967-01כל דומה יעבוד
GraphPad SoftwareGraphPadגרסה 9.3.1 (471)כל דומה יעבוד
Multichanel PipetteThermo ScientificFinnpipette F2כל דומה יעבוד
PBSGibco10010-031כל דומה יעבוד
PenStrepGibco15070-063כל דומה יעבוד
קצות פיפטה (סטרילי, מסונן, 1 מ"ל, גדלים שונים)Pr1maPR-1250RK-FL וכו'כל דומה יעבוד
פיפטורים Thermo ScientificFinnpipette F2כל דומה יעבוד
Propidium IodideInvitrogenP1304MPכל דומה יעבוד
RPMICorning10-041-cvכל דומה יעבוד
Serological Pipette AidDrummond Scientific4-000-105כל דומה יעבוד
פיפטות סרולוגיות (סטריליות, בגדלים שונים)Pr1maPR-SERO-25וכו 'כל דומה יעבוד
נתרן פירובטקורנינג25-000-CIכל דומה יעבוד
מאגרים סטריליים המערבהתיכון מדעיRESE-2000כל דומה יעבוד
צנטריפוגה שולחניתEppendorf5810Rכל דומה יעבוד

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mitra, A. From bench to bedside: the history and progress of CAR T cell therapy. Front Immunol. 14, 1188049(2023).
  2. Labanieh, L., Mackall, C. L. CAR immune cells: design principles, resistance and the next generation. Nature. 614, 635-648 (2023).<....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

CAR TJurkatEGFRHinge DomainT PBMC96

מאמרים קשורים