מאמר שיטה

הערכת ציטוטוקסיות מהירה במבחנה של קולטן אנטיגן כימרי Jurkat באמצעות הדמיה פלואורסצנטית

DOI:

10.3791/65560

⸱

27 באוקטובר 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Radiation Oncology, University of Kansas Cancer Center, 2Department of Cancer Biology, University of Kansas Cancer Center, 3BioEngineering Program, University of Kansas, 4Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of Kansas Medical Center, 5University of Kansas Cancer Center, 6Kansas Institute for Precision Medicine, University of Kansas Medical Center

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול להערכת הרג כמותי של תאי גידול על ידי תאי Jurkat המבטאים קולטן אנטיגן כימרי (CAR) המכוון לאנטיגן גידול יחיד. פרוטוקול זה יכול לשמש כפלטפורמת סינון לאופטימיזציה מהירה של מבני צירי CAR לפני אישור בתאי T היקפיים שמקורם בדם.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תאי T של קולטן אנטיגן כימרי (CAR) נמצאים בחזית האונקולוגיה. CAR בנוי מתחום מיקוד (בדרך כלל מקטע משתנה שרשרת יחיד, scFv), עם מקשר תוך-שרשרת נלווה, ואחריו ציר, טרנסממברנה ותחום קוסטימולטורי. שינוי של המקשר התוך-שרשרת ותחום הציר יכול להשפיע באופן משמעותי על הרג בתיווך רכב. בהתחשב באפשרויות השונות הרבות עבור כל חלק של מבנה CAR, ישנם מספר רב של תמורות. ייצור תאי CAR-T הוא תהליך גוזל זמן ויקר, וייצור ובדיקה של מבנים רבים הוא השקעה כבדה בזמן ובחומר. פרוטוקול זה מתאר פלטפורמה להערכה מהירה של מבני CAR ממוטבים לציר בתאי Jurkat (CAR-J). תאי Jurkat הם קו תאי T אימורטלי עם ספיגה גבוהה של לנטיוירוסים, המאפשרים העברת CAR יעילה. כאן, אנו מציגים פלטפורמה להערכה מהירה של CAR-J באמצעות הדמיה פלואורסצנטית, ואחריה אישור של ציטוליזה בתאי T שמקורם ב-PBMC.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טיפול בתאי CAR-T הראה הבטחה גדולה בממאירויות המטולוגיות, כפי שעולה מ-6 מוצרי CAR-T שאושרו על ידי ה-FDA מאז 2017, כפי שדווח על ידי המכון הלאומי לסרטן1. ישנם תאי CAR-T רבים בניסויים קליניים להתמקדות בגידולים מוצקים. תכנון מטרות CAR חדשניות ואופטימיזציה של מבנה CAR חיוניים ליעילות של תא CAR-T. בחירת מבנה CAR האידיאלי עבור כל יישום חיונית למיקוד מדויק של אנטיגנים הקשורים לגידול (TAA) תוך הימנעות מרמות נמוכות של ביטוי TAA ברקמות נורמליות2.

מבנה CAR מורכב בעיקר מחמישה תאים: (1) תחום משתנה חד-תאי חוץ-תאי (scFv) המכוון לאנטיגן גידולי; (2) תחום ציר; (3) תחום טרנסממברנלי; (4) תחום קוסטימולטורי ציטופלזמי תוך-תאי של תאי T; ו-(5) תחום האיתות. שינוי כל אחד מתחומים אלה משפיע על הדיוק של תא CAR-T העוסק בתא היעד שלו3. לפיכך, הערכת ציטוטוקסיות ותגובתיות צולבת של מבני CAR אלה במבחנה היא קריטית לבחירת המבנה הנכון להתקדמות לקראת ניסויים in vivo. השיטות הנוכחיות להערכת ציטוליזה על ידי תאי T כוללות בדיקת שחרור 51Cr, בדיקת שחרור לקטט דהידרוגנאז, בדיקת הדמיה ביולומינסנטית, ניתוח תאים מבוסס עכבה בזמן אמת ובדיקת ציטומטריית זרימה מבוססת תאים 4,5. הפלטפורמה מבוססת הדימות הפלואורסצנטי המתוארת כאן מזהה את מספר התאים החיים לעומת המתים, שהוא כימות ישיר של ציטוליזה של תאי T בניגוד לשיטה עקיפה להערכת הציטוליזה על ידי תאי T.

להלן טכניקה קלה, חסכונית, מהירה ובעלת תפוקה גבוהה עם התערבות מינימלית להערכת ציטוטוקסיות של תאי Jurkat המבטאים קולטן גורם גדילה אפידרמלי (EGFR) CAR כנגד תאי סרטן שד טריפל נגטיב (TNBC) של MDA-MB-231 ותאי EGFR CRISPR מחסלים תאי MDA-MB-231. תאי Jurkat הם תאי לימפוציטים אנושיים מסוג Tאימורטליים 6 הנמצאים בשימוש נרחב לחקר הפעלת תאי T ומנגנוני איתות7. יתר על כן, תאי Jurkat שימשו לבדיקות CAR במבחנה במחקרים מרובים 8,9,10,11. תאי Jurkat מתמרים בקלות על ידי lentivirus ויש להם שגשוג מתמשך, ומערכת זו מונפה כדי לייעל את תחום הצירים של מבני EGFR CAR שונים.

בדיקה זו יכולה לשמש לבדיקת מבני CAR מרובים המכוונים לאנטיגנים סרטניים שונים ולהשתמש בהם כנגד קווי תאים סרטניים נצמדים מרובים וביחסי השפעה לגידול (E:T) שונים. בנוסף, ניתן להעריך נקודות זמן מרובות, ולשנות את מספר העותקים המשוכפלים כדי לזהות את ההרג הטוב ביותר בין מבני CAR השונים. המבנים הטובים ביותר צריכים להיות מאושרים באמצעות תאי דם מונוגרעיניים היקפיים (PBMCs) נגזר CD3 T תאים. המטרה הכוללת מאחורי פיתוח שיטה זו היא לייעל במהירות את הגיאומטריה של ציר CAR באופן בתפוקה גבוהה תוך התגברות על מחסומים כגון יעילות התמרה נמוכה, ולאחר מכן אישור בתאי T הנגזרים מ-PBMC.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: כל עבודת תרבית התאים נעשית בארון בטיחות ביולוגית עם חלוק מעבדה, כפפות וטכניקות אספטיות סטנדרטיות.

1. יצירת מכוניות המבטאות יורקטים (CAR-J)

  1. לרכוש תאי Jurkat, לשכפל E6-1 מ ATCC. הפשירו 1 x 106 תאים בבקבוק T-75 ותרבו אותם בצלוחיות T-75. שמור אותם בהשעיה ב 0.6 x 106 תאים למ"ל באמצעות Roswell Park Memorial Institute (RPMI) מדיה בתוספת 10% FBS באינקובטור ב 37 ° C עם 5% CO2.
  2. צלחת 1 x 105 תאי Jurkat לכל באר של תרבית רקמה מטופלת 24 צלחת באר ב 500 μL של RPMI מצע גידול המכיל 4 מיקרוגרם / מ"ל פוליברן אשר משפר את היעילות lentiviral. ספירת תאים באמצעות מנתח תאים עליון מבוסס לייזר מבוסס לייזר. מספר הבארות תלוי במספר המבנים שיש להעריך. דוגמה זו תשתמש ב- 4 מבנים ופקד לא מותמר. תכנון מבנה המכונית מוצג בטבלה 1.
  3. הוסף 10 μL של lentivirus/well של כל מבנה CAR. תכנון מבנה הרכב וייצור הלנטיוירוס נעשה כמתואר קודם לכן12.
  4. למחרת להוסיף 1 מ"ל של מדיה RPMI צמיחה לכל באר ולהמשיך לגדל באינקובטור ב 37 ° C עם 5% CO2.
  5. לאסוף תאים 2 ימים מאוחר יותר (סה"כ 72 שעות לאחר התמרה Jurkat) ולספור אותם.
  6. קח 1 x 104 תאים לזרימה רצה כדי לאשר ביטוי CAR על תאי Jurkat. בקצרה, שטפו את התאים 2x עם תמיסת צביעה FACS (FSS) לפני תיוג CAR-J עם נוגדנים המכוונים תג דגל המשמש לזיהוי CAR חיובי במשך 30 דקות בחושך ב 4 ° C. שטפו שוב פעמיים עם FSS והריצו תאים דרך ציטומטר זרימה כפי שתואר קודם לכן12. יש להשתמש בריכוז נוגדנים לפי המלצת היצרן.
  7. תאי Jurkat מתמרים בקלות וכמעט תמיד מראים >90% ביטוי CAR. יש לייצר CAR-J זמן רב לפני בדיקת ציטוטוקסיות התרבות המשותפת ולהקפיא לשימוש מאוחר יותר.

2. ציפוי CFSE מסומן תאים סרטניים

הערה: תאי MDA-MB-231 (מ-ATCC, HTB-26) היו מתנה ממשתף פעולה, ו-EGFR KO MDA-MB-231 נוצרו כמתוארקודם 12.

  1. הפשירו 1 x 106 תאים בבקבוק T-75 ותרבו אותם בצלוחיות T-75. שמור על תאי גידול MDA-MB-231 ותאי גידול CRISPR EGFR KO MDA-MB-231 ב- 14 מ"ל של מדיום הנשר המעובד של דולבקו (DMEM) בתוספת 10% נסיוב בקר עוברי (FBS) באינקובטור ב 37 ° C עם 5% CO2 ומפוצל כאשר כ 70% מתמזג.
  2. התבונן בתאי גידול דבקים תחת מיקרוסקופ שדה בהיר רגיל כדי להבטיח כמעט 70% מפגש.
  3. מוציאים את מצע הגידול מהבקבוק בעזרת פיפטה סרולוגית. הוסף 3 מ"ל של טריפסין לבקבוק T75 ומניחים באינקובטור ב 37 ° C עם 5% CO2 למשך 3-5 דקות כדי לנתק את התאים מן הצלוחית.
  4. נטרל את הטריפסין באמצעות כמות שווה (3 מ"ל) של מצע גידול. אספו את תרחיף התא בצינור צנטריפוגה וסובבו את התאים במהירות של 400 x גרם למשך 4 דקות כדי לזרוק את התאים למטה.
  5. השליכו את הסופרנאטנט באמצעות פיפטה והשהו מחדש את התאים ב-2 מ"ל של מלח חוצץ פוספט (PBS). קבע את ריכוז התא באמצעות מונה תאים.
  6. העבר 8 x 105 תאים לתוך צינור נוסף של 15 מ"ל והוסף PBS כדי להגיע לנפח של 1 מ"ל.
  7. הוסף 2 μL של carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE; ריכוז מלאי 5 μM) לתוך כל צינור ולערבב היטב באמצעות פיפטה 1 מ"ל.
  8. לדגור על התאים עם CFSE במשך 20 דקות באינקובטור ב 37 ° C עם 5% CO2. הסר את הצינורות מן האינקובטור לאחר 20 דקות ולהוסיף 5 מ"ל של מדיה צמיחה לצינור.
  9. צנטריפוגה את הצינורות ב 400 x גרם במשך 4 דקות כדי לגלול למטה את התאים המסומנים CFSE. השליכו את הסופרנאטנט באמצעות פיפטה והוסיפו 1 מ"ל של מדיה טרייה כדי להשהות מחדש את התאים.
  10. להעריך מחדש את ריכוז התא באמצעות מונה תאים. העבר 4 x 105 תאים למאגר מגיב 25 מ"ל והוסף מדיה לנפח כולל של 8 מ"ל.
    1. כדי להבטיח נפח מספיק כדי לזרוע 5000 תאים סרטניים / באר ב 100 μL של מדיה, נפח צריך להיות מסוגל פיפטה באמצעות פיפטה רב ערוצית, כדי לפצות על אובדן של כמה תאים במהלך שלב 1.7, להכין 10%-20% תאים נוספים נפח מדיה.
  11. מערבבים היטב את תרחיף התא באמצעות פיפטה סרולוגית של 5 מ"ל. באמצעות פיפטה רב ערוצית 100 μL, פיפטה 100 μL של תרחיף התא לתוך כל שורה של צלחת הבאר השחורה התחתונה השטוחה השקופה במחצית השמאלית. אסטרטגיית ציפוי לדוגמה ניתן למצוא בטבלה 2.
  12. פיפטה EGFR KO תאים באופן דומה על החצי הימני של הצלחת. לאחר שכל הצלחת מצופה, גרור את הצלחת קדימה ואחורה ומצד לצד על פלטפורמת מכסה המנוע של תרבית הרקמה כדי להבטיח פיזור אחיד של תאי הגידול בבארות.
  13. לדגור על הצלחת במשך 4 שעות באינקובטור ב 37 ° C עם 5% CO2 עבור תאי הגידול להתחבר.

3. תרבית משותפת של מכוניות המבטאות יורקטים עם תאי גידול המסומנים ב-CFSE

  1. באמצעות ספירת תאי Jurkat שאינם מומרים ומבטאי CAR, מעבירים 4 x 105 תאים מכל CAR-J למאגר של 25 מ"ל. הוסף מדיית צמיחה DMEM לנפח כולל של 2 מ"ל.
  2. עבור E:T של 4:1, 2 x 104 CAR-J נוספו לכל באר ב 100 μL של מדיה באמצעות פיפטה רב ערוצית בעדינות לאורך הצד של כל באר כדי לא להפריע לתאי הגידול המחוברים.
  3. הוסף עוד 100 μL של מצע גידול באמצעות פיפטה רב ערוצית לצד בארות המכילות תאי גידול ותאי Jurkat. רק קבוצות הגידול מקבלות 200 מיקרוליטר של מדיה כדי להפוך אותו לסך של 300 מיקרוליטר מדיה בכל הבארות.
  4. גרור את הצלחת לאורך הפלטפורמה קדימה ואחורה ובתנועה מצד לצד כדי להבטיח פיזור אחיד של תאי Jurkat על תאי הגידול.
  5. אפשר תרבית משותפת בחממה ב 37 ° C עם 5% CO2 במשך 48 שעות.

4. הכנת צלחת להדמיה

  1. צור תמיסה של יודיד פרופידיום (PI) ב 1 מיקרוגרם / מ"ל במדיה פלואורסצנטית ברקע נמוך בהתבסס על מספר הבארות וכל אחת מקבלת 100 מיקרוליטר של מדיה.
  2. עבור 84 בארות להכין 9 מ"ל של מדיה המכילה PI. מערבבים היטב את המדיה באמצעות פיפטה.
  3. לייצר 10 מ"ל של 20% תמיסת Triton-X על ידי דילול Triton-X עם מים נטולי יונים. לאחר 48 שעות של תרבית משותפת, השליכו את הסופרנאטנט המכיל CAR-J על ידי היפוך יחיד של הצלחת והקשה על מגבת נייר.
  4. כעת הוסף 100 μL של מדיה מוכנה לעיל (שלב 4.2) המכיל PI לכל באר באמצעות פיפטה רב ערוצית בעדינות כדי לא להפריע לתאי הגידול המודבקים.
  5. הוסף 20 μL של 20% תמיסת Triton-X לבאר הראשונה מכל סוג גידול המתפקדת כבקרה מתה מוחלטת.
  6. משאירים את הצלחת באינקובטור למשך 20 דקות. צלם את הלוח באמצעות ציטומטר הדמיה פלואורסצנטי. הנתונים מאוחסנים במחשב וניתן לנתח אותם במועד מאוחר יותר.

5. ניתוח תמונות ניאון

  1. השתמש באחד הגידול רק טוב של תאים כדי להגדיר את התעלה הפלואורסצנטית הירוקה.
  2. להקטין את מסיכת הבאר ל 98% כדי להסיר את התאים על קצה הבאר כמו האות אינו מושלם על הקצה.
  3. זהה תאים סרטניים המסומנים ב-CFSE על תעלת CFSE הירוקה והפלואורסצנטית. שנה את ערך הסף של עוצמת הפלואורסצנטיות כדי לאסוף את כל התאים על הבאר.
  4. הגדר את קוטר התא המינימלי ל- 25 מיקרומטר כדי להסיר פסולת שזוהתה בתעלת CFSE. הדבר משתנה בהתאם לסוג התא המנותח.
  5. הפעל אובייקטים נוגעים נפרדים כדי לזהות תאים בודדים כאשר הם באים במגע זה עם זה.
  6. בחר CFSE בתצוגת התמונה והתבונן בשכבת-על גרפית כדי להבין מה נבחר על-ידי המערכת.
  7. לאחר שתאים המסומנים ב-CFSE נאספים כראוי, הגדר שערים להגדרת אוכלוסיית תאים חיים לעומת מתים.
  8. בחירת התאים המסומנים CFSE, ליצור היסטוגרמה של ספירות על ציר y לעומת עוצמת PI ממוצע על ציר x.
  9. בהתבסס על הבאר שבה הוספנו Triton-X (שלב 4.5), ציירו מפצל כדי להבדיל בין תאים מוכתמים PI נמוך לעומת תאים מוכתמים PI גבוה. באר זו צריכה להיות רוב התאים באזור מוכתם PI גבוה.
    הערה: PI מציג אות בסיסי בתאים חיים. לפיכך, הוספת Triton-X הורגת את כל התאים והם מכתימים בבהירות בתעלה הפלואורסצנטית האדומה. זה מקל על ציור שערים להפרדת תאים מתים מתאים חיים.
  10. התאם את ערך ציר ה- x כדי שתוכל להציג טוב יותר את התאים. כעת תייגו את התאים המוכתמים ב-PI הנמוך כתאים חיים.
  11. בחירת התאים החיים, הגדר היסטוגרמה נוספת עם שטח על ציר ה- x וספירה על ציר y.
  12. צייר מפצל נוסף באמצעות הגידול רק טוב כדי ללכוד תאים ולא פסולת. בארות מטופלות Jurkat יתחילו לצבור פסולת שתהיה מוכתמת CFSE ויש צורך להסיר אותה מהספירות. שאר הפסולת שאינה פסולת מסומנת כ"תאים גדולים".
  13. הפעל את הניתוח על הלוח כולו וייצא את הגיליון האלקטרוני המכיל את המספרים.
  14. תכננו את הספירה הגדולה כדי לזהות את מספר תאי הגידול החיים המסומנים ב-CFSE שנותרו בבאר לאחר החשיפה ל-CAR-J. קבע סטטיסטיקה באמצעות ANOVA חד-כיוונית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טווח של יחס E:T בין 1:8 ל-8:1 עבור CAR-J1 הוערך ב-72 שעות, והתמקד ב-EGFR בתאי TNBC MDA-MB-231. תאי Jurkat הומרו עם CAR lentivirus עם פוליברן כדי ליצור תאי CAR-J כמתואר בשלב 2. ציטוטוקסיות של CAR-J1 עלתה באופן משמעותי עם יחס E:T גבוה יותר ללא הבדל בהרג ביחס של 1:8 (איור 1). יותר מ-50% מקרי הרג נצפו ביחס של 4:1 E:T במשך 72 שעות. E:T זה שימש לניסויים הבאים עם משך מופחת ל -48 שעות להערכה ציטוטוקסיות מהירה של מבני CAR מרובים. EGFR המכוון למבני מכוניות עם תחום הציר שונה תוכננו (טבלה 1

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן הצענו שיטה מהירה להערכה יעילה של הפעילות הציטוליטית הספציפית למטרה הנגרמת על ידי ביטוי CAR בתאי Jurkat. לכל מבני CAR יש אותו scFv אך תחומי ציר וטרנסממברנה שונים אשר הוכחו כמשפיעים על עוצמת תאי CAR-T13. הערכה נוספת של הרג לא ספציפי על ידי CAR-J אלה נעשתה על ידי תרבית שלהם עם תאי אנטיגן נוק אאוט (KO). זה מוכיח כי ההרג הוא ספציפי אנטיגן הגידול ולא עקב הפעלה בסיסית על ידי CAR-J. ניתן לקבוע בקלות פוטנציאל ציטוטוקסי של טווח יחסי E:T תוך זיהוי המספר הקטן ביותר של תאי השפעה הדרושים לסילוק תאי הגידול ב...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מד"א-MB-231 היו מתנה חביבה מד"ר שיין סטקליין. המחברים מודים על מימון ממרכז הסרטן של אוניברסיטת קנזס לביצוע מחקר זה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
15 מ"ל צינור חרוטי (סטרילי)Midwest Scientific#C15Bכל דומה יעבוד
50 מ"ל צינור חרוטי (סטרילי)Thermo Scientific339652כל דומה יעבוד
שחור/שקוף 96 צלחת בארFalcon353219Celligo יש רשימה של צלחות תואמות
Celigo 4 Channel Imaging CytomenterNexcelcom Bioscience200-BFFL-5Cכל דומה יעבוד
Celigo SoftwareNexcelcom Bioscienceגרסה 5.3.0.0כל דומה יעבוד
חממת תרבית תאיםThermo ScientificHeraCell 160iכל דומה יעבוד
צלוחיות מטופלות בתרבית תאים (T75, גדלים שונים, סטרילי)TPP90076כל דומה יעבוד
CFSETonbo13-0850-U500כל דומה יעבוד
מנתח תאים של Cytek MuseCytek0500-3115כל דומה יעבוד
DMEMGibco11995-040כל דומה יעבוד
FBSGemini bio-products900-108כל דומה יעבוד
Flow CytometerCytek, BD וכו 'Aurora, LSR II וכו 'כל דומה יעבוד
FlowJo SortwareBecton Dickinson & חברה גרסה 10.7.1כל דומה יעבוד
Fluorobrite DMEMGibcoA18967-01כל דומה יעבוד
GraphPad SoftwareGraphPadגרסה 9.3.1 (471)כל דומה יעבוד
Multichanel PipetteThermo ScientificFinnpipette F2כל דומה יעבוד
PBSGibco10010-031כל דומה יעבוד
PenStrepGibco15070-063כל דומה יעבוד
קצות פיפטה (סטרילי, מסונן, 1 מ"ל, גדלים שונים)Pr1maPR-1250RK-FL וכו'כל דומה יעבוד
פיפטורים Thermo ScientificFinnpipette F2כל דומה יעבוד
Propidium IodideInvitrogenP1304MPכל דומה יעבוד
RPMICorning10-041-cvכל דומה יעבוד
Serological Pipette AidDrummond Scientific4-000-105כל דומה יעבוד
פיפטות סרולוגיות (סטריליות, בגדלים שונים)Pr1maPR-SERO-25וכו 'כל דומה יעבוד
נתרן פירובטקורנינג25-000-CIכל דומה יעבוד
מאגרים סטריליים המערבהתיכון מדעיRESE-2000כל דומה יעבוד
צנטריפוגה שולחניתEppendorf5810Rכל דומה יעבוד

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mitra, A. From bench to bedside: the history and progress of CAR T cell therapy. Front Immunol. 14, 1188049(2023).
  2. Labanieh, L., Mackall, C. L. CAR immune cells: design principles, resistance and the next generation. Nature. 614, 635-648 (2023).
  3. Sterner, R. C., Sterner, R. M. CAR-T cell therapy: current limitations and potential strategies. Blood Cancer J. 11 (4), 69(2021).
  4. Lisby, A. N., Carlson, R. D., Baybutt, T. R., Weindorfer, M., Snook, A. E. Methods in Cell Biology. 167, Academic Press. 81-98 (2022).
  5. Kiesgen, S., Messinger, J. C., Chintala, N. K., Tano, Z., Adusumilli, P. S. Comparative analysis of assays to measure CAR T-cell-mediated cytotoxicity. Nat Protoc. 16 (3), 1331-1342 (2021).
  6. Schneider, U., Schwenk, H. U., Bornkamm, G. Characterization of EBV-genome negative "null" and "T" cell lines derived from children with acute lymphoblastic leukemia and leukemic transformed non-Hodgkin lymphoma. Int J Cancer. 19 (5), 621-626 (1977).
  7. Abraham, R. T., Weiss, A. Jurkat T cells and development of the T-cell receptor signalling paradigm. Nat Rev Immunol. 4 (4), 301-308 (2004).
  8. Bloemberg, D., et al. A high-throughput method for characterizing novel chimeric antigen receptors in Jurkat cells. Mol Ther Methods Clin Dev. 16, 238-254 (2020).
  9. Lipowska-Bhalla, G., Gilham, D. E., Hawkins, R. E., Rothwell, D. G. Isolation of tumor antigen-specific single-chain variable fragments using a chimeric antigen receptor bicistronic retroviral vector in a Mammalian screening protocol. Hum Gene Ther Methods. 24 (6), 381-391 (2013).
  10. Alonso-Camino, V., et al. CARbodies: Human antibodies against cell surface tumor antigens selected from repertoires displayed on T cell chimeric antigen receptors. Mol Ther Nucleic Acids. 2 (5), e93(2013).
  11. Jahan, F., et al. Using the Jurkat reporter T cell line for evaluating the functionality of novel chimeric antigen receptors. Front Mol Med. 3, 1070384(2023).
  12. Subham, S., et al. EGFR as a potent CAR T target in triple negative breast cancer brain metastases. Breast Cancer Res Treat. 197 (1), 57-69 (2023).
  13. Guedan, S., Calderon, H., Posey, A. D. Jr, Maus, M. V. Engineering and Design of Chimeric Antigen Receptors. Mol Ther Methods Clin Dev. 12, 145-156 (2019).
  14. Zaritskaya, L., Shurin, M. R., Sayers, T. J., Malyguine, A. M. New flow cytometric assays for monitoring cell-mediated cytotoxicity. Expert Rev Vaccines. 9 (6), 601-616 (2010).
  15. Shan, X., et al. Deficiency of PTEN in Jurkat T cells causes constitutive localization of Itk to the plasma membrane and hyperresponsiveness to CD3 stimulation. Mol Cell Biol. 20 (18), 6945-6957 (2000).
  16. Wu, W., et al. Multiple signaling roles of CD3ε and its application in CAR-T cell therapy. Cell. 182 (4), 855-871 (2020).
  17. Wang, D. Glioblastoma-targeted CD4+ CAR T cells mediate superior antitumor activity. JCI Insight. 3 (10), e99048(2018).
  18. Haggerty, T. J., Dunn, I. S., Rose, L. B., Newton, E. E., Kurnick, J. T. A screening assay to identify agents that enhance T-cell recognition of human melanomas. Assay Drug Dev Technol. 10 (2), 187-201 (2012).
  19. Spencer, V. A., Kumar, S., Paszkiet, B., Fein, J., Zmuda, J. F. Cell culture media for fluorescence imaging: Striking the right balance between signal strength and long-term cell health. Genetic Engineer Biotech News. 34 (10), 16-18 (2014).
  20. Immune Cell Killing Assays for Live-Cell Analysis. , https://www.sartorius.com/en/applications/life-science-research/cell-analysis/live-cell-assays/cell-function/immune-cell-killing (2023).
  21. Kessel, S., et al. High-throughput 3D tumor spheroid screening method for cancer drug discovery using celigo image cytometry. SLAS Technol. 22 (4), 454-465 (2017).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

CAR TJurkatEGFRHinge DomainT PBMC96

מאמרים קשורים