הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

טיפוח בקנה מידה גדול של נמטודות כדי ללמוד את ההתנהגויות הקולקטיביות שלהם

1.8K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/65569

⸱

25 באוגוסט 2023

 ,  ,  ,  , 
1Program of Biomedical Science, Graduate School of Integrated Sciences for Life, Hiroshima University, 2Faculty of Design, Kyushu University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

כאן, מדווח על מערכת לחקר התנהגויות קולקטיביות של נמטודות על ידי טיפוחן בכמויות גדולות באמצעות מדיום אגר מזון לכלבים. מערכת זו מאפשרת לחוקרים להפיץ מספר גדול של תולעי דאואר וניתן ליישם אותה על Caenorhabditis elegans ומינים קרובים אחרים.

תקציר

בעלי חיים מפגינים התנהגויות קולקטיביות דינמיות, כפי שנצפה בלהקות ציפורים, להקות דגים והמוני בני אדם. ההתנהגויות הקולקטיביות של בעלי חיים נחקרו בתחומי הביולוגיה והפיזיקה. במעבדה, חוקרים השתמשו בחיות מודל שונות כגון זבוב הפירות ודגי הזברה במשך כמאה שנה, אך נותר אתגר גדול לחקור התנהגות קולקטיבית מורכבת בקנה מידה גדול המתוזמרת על ידי חיות מודל גנטיות אלה. מאמר זה מציג פרוטוקול ליצירת מערכת ניסיונית של התנהגויות קולקטיביות ב- Caenorhabditis elegans. התולעים המתפשטות מטפסות על מכסה צלחת הפטרי ומראות התנהגות נחיל קולקטיבית. המערכת גם שולטת באינטראקציות ובהתנהגויות של תולעים על ידי שינוי הלחות וגירוי האור. מערכת זו מאפשרת לנו לבחון את המנגנונים העומדים בבסיס התנהגויות קולקטיביות על ידי שינוי תנאי הסביבה ובחינת ההשפעות של תנועה ברמת הפרט על התנהגויות קולקטיביות באמצעות מוטנטים. לפיכך, המערכת שימושית למחקר עתידי הן בפיזיקה והן בביולוגיה.

מבוא

הן הלא-מדענים והן המדענים מוקסמים מהתנהגויות קולקטיביות של בעלי חיים, כמו בלהקות ציפורים ובלהקות דגים. התנהגויות קולקטיביות נותחו במגוון רחב של תחומים, כולל פיזיקה, ביולוגיה, מתמטיקה ורובוטיקה. בפרט, פיזיקת החומר הפעיל היא תחום מחקר הולך וגדל המתמקד במערכות המורכבות מיסודות בעלי הנעה עצמית, כלומר מערכות מפזרות, כגון להקות ציפורים, להקות דגים, ביופילמים של חיידקים תנועתיים, שלדים ציטושלדים המורכבים ממולקולות פעילות, וקבוצות של קולואידים בעלי הנעה עצמית. התיאוריה של פיזיקת החומר הפעיל גורסת כי ככל שהתנהגותם של יחידים מורכבת, תנועותיהם הקולקטיביות של מספר עצום של יצורים חיים נשלטות על ידי מספר קטן של כללים פשוטים. לדוגמה, מודל Vicsek, מועמד לתיאור מאוחד של התנועה הקולקטיבית של חלקיקים בעלי הנעה עצמית, חוזה כי אינטראקציית יישור לטווח קצר של עצמים נעים נדרשת כדי ליצור פאזה מסודרת לטווח ארוך עם תנודות אקסצנטריות בדו-ממד, כמו בעדרי בעלי חיים1. גישות ניסיוניות מלמעלה למטה הנוגעות לפיזיקה של חומר פעיל מתפתחות במהירות. ניסויים קודמים אישרו היווצרות של שלב מסודר ארוך טווח ב- Escherichia coli2. עבודות אחרות שנעשו לאחרונה עסקו בתאים 3,4, חיידקים5, קולואידים תנועתיים6, או חלבונים נעים 7,8. מודלים מינימליים פשוטים כמו מודל ויצ'ק תיארו בהצלחה את התופעות האמיתיות הללו. בניגוד למערכות ניסויים חד-תאיות אלה, התנהגויות קולקטיביות של בעלי חיים נצפות בדרך כלל בטבע, מכיוון שאיש לא יכול היה לקוות לבצע ניסויים מבוקרים עם 10,000 ציפורים או דגים אמיתיים.

ביולוגים חולקים את אותו עניין כמו פיזיקאים: כיצד פרטים מתקשרים זה עם זה ומתנהגים באופן פונקציונלי כקבוצה. אחד מתחומי המחקר המסורתיים לניתוח התנהגות הפרט הוא מדעי המוח, שבו נבדקו המנגנונים העומדים בבסיס ההתנהגות ברמה העצבית והמולקולרית. גישות רבות של מדעי המוח מלמטה למעלה פותחו עד כה. ניתן להקל על גישות מלמעלה למטה בפיזיקה וגישות מלמטה למעלה בביולוגיה באמצעות חיות מודל כגון זבוב הפירות, התולעת Caenorhabditis elegans והעכבר9. עם זאת, היו מעט ממצאים על ההתנהגות הקולקטיבית בקנה מידה גדול של חיות מודל אלה במעבדה10; עדיין קשה להכין חיות מודל גנטיות בקנה מידה גדול במעבדה. לכן, במחקר הנוכחי על התנהגויות קולקטיביות בביולוגיה ובפיזיקה, קשה למדענים שבדרך כלל חוקרים במעבדה לחקור התנהגויות קולקטיביות של בעלי חיים.

במחקר זה ביססנו שיטה לטיפוח בקנה מידה גדול של נמטודות כדי לחקור את ההתנהגויות הקולקטיביות שלהן. מערכת זו מאפשרת לנו לשנות את תנאי הסביבה ולבחון את ההשפעה של תנועה ברמת הפרט על התנהגויות קולקטיביות באמצעות מוטנטים10. בפיזיקה של חומר פעיל, ניתן לשלוט בפרמטרים של המודל המתמטי הן בניסויים והן בסימולציות, מה שמאפשר אימות של אותו מודל לזיהוי תיאורים אחידים. גנטיקה משמשת להבנת מנגנון המעגל העצבי העומד בבסיס ההתנהגות הקולקטיבית11.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. הכנת תולעים

הערה: הכינו את זן בריסטולN2 מסוג פרא 12 ואת זן ZX899 (לייט-1(ce314); ljIs123[mec-4p::ChR2, unc-122p::RFP])13 לתצפית על התנהגויות קולקטיביות וניסויים אופטוגנטיים, בהתאמה. שמור על זן ZX899 בתנאי חושך.

  1. הפקידו ארבע תולעים בוגרות מוזנות היטב על צלחת 60 מ"מ המכילה 14 מ"ל של מדיום גידול נמטודות (NGM) עם אגר וזרעים עם E. coli OP5012.
  2. לגדל תולעי F1 לרעב בצלחת NGM ב 23 ° C במשך 7 ימים. התפוקה של תולעי F1 היא כ-100 תולעים לצלחת בשלב זה. שלבי התולעים מהווים אוכלוסייה מעורבת של זחלי דאואר וזחלי L1 מורעבים.

2. הכנת צלחות בינוניות אגר מזון לכלבים (DFA)

  1. הוציאו בקבוק זכוכית שהכיל 2 גרם אבקת מזון לכלבים ו-5 מ"ל של 1% אגר בינוני וקררו אותו לטמפרטורת החדר (איור 1A).
    הערה: ניתן להשתמש במזונות כלבים אחרים מיצרנים שונים בניסוי זה.

3. חיסון תולעים ללוחות בינוניים DFA

  1. העבירו כמויות קטנות (כ-0.5 גרם) של תווך DFA למרכז צלחת NGM שנזרעה עם E. coli OP50 (איור 1B). עבור ניסויים אופטוגנטיים, יש לשפוך 40 μL של 50 מיקרומטר all-trans-retinal, הקו-פקטור של ערוץ רודופסין 2, על DFA לפני חיסון תולעים.
  2. אספו את התולעים המורעבות מארבע צלחות NGM באמצעות מים אוטוקלאביים.
  3. הניחו שבר קטן של מזון כלבים (כ-0.5 גרם) על מדיום DFA, במרחק של כ-2 מ"מ ממכסה הצלחת.
  4. האירו את צלחת הגז הטבעי באור אולטרה סגול למשך 15 דקות בתוך ספסל נקי כדי למנוע זיהום.
  5. חסן את התולעים שנאספו (כ-400 תולעים) על תווך DFA על לוחות NGM. אין לאטום את הצלחת בפרפילם כדי למנוע הגברת הלחות בתוך צלחת הפטרי ויצירת טיפות מים שלוכדות תולעים על מכסה.
  6. להפיץ את התולעים ב 23 מעלות צלזיוס ולאפשר להם לטפס עד מכסה הצלחת במשך כ 10-14 ימים.
    הערה: מכיוון שמספר התולעים על העפעפיים בקושי גדל לאחר 10-14 יום, ההנחה הייתה שככל הנראה נגמר המזון לתולעים.

4. תצפית על התנהגות קולקטיבית

  1. ביום הניסוי, הניחו צלחת NGM חדשה שלא כללה E. coli ומדיום אגר מזון לכלבים על צלחת אלומיניום על הבמה של מיקרוסקופ זום מאקרו (איור 2A). שמרו את החלק התחתון של לוח הגז הטבעי החדש הזה בטמפרטורה של 23°C באמצעות יחידת בקר טמפרטורה של פלטייה למשך 5 דקות לפחות (איור 2B). לאחר מכן, החליפו את המכסה של צלחת NGM חדשה זו במכסה הצלחת שעליה טיפסו התולעים. השתמשו בעדשת האובייקט (x2, NA = 0.5) כמטרת הגדלה נמוכה (איור 2A).
  2. הגדילו את הטמפרטורה של תחתית צלחת הפטרי מ-23°C ל-26°C כדי לשנות את הלחות בתוך הצלחת (איור 2).
  3. קבל תמונות של המשטח הפנימי של מכסה הלוח עם המצלמה ב- 20 פריימים s−1 (וידאו משלים S1).
  4. שמור את התמונות שנרכשו בתבנית Tagged Image File.

5. ניסוי אופטוגנטי

  1. השתמש במנורת כספית של 100 ואט כדי לספק אור כחול, מסונן באמצעות ערכת מסנן. שלוט בזמן ההארה במדויק באמצעות מערכת תריסים אלקטרומגנטית (איור 2B).
  2. שמרו על ZX899 ב-DFA בתנאים אלה למשך 5 דקות לפני הדלקת האור הכחול.
  3. להאיר תולעים ZX899 המחוברות למכסה של צלחת פטרי על במת המיקרוסקופ נשמר ב 23 ° C.
  4. קבל תמונות של המשטח הפנימי של מכסה הלוח באמצעות מצלמה ב- 20 פריימים s−1 (וידאו משלים S2).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

כאן, תולעי דאואר מסוג בר שימשו לתצפיות התנהגות קולקטיביות. תולעים טופחו בטמפרטורה של 23 מעלות צלזיוס במשך כ-10-14 ימים וטיפסו עד לפני השטח הפנימיים של מכסה צלחת בינונית DFA. ביום הניסוי, רק המכסה הועבר לצלחת NGM חדשה ללא E. coli ותווך DFA. החלק התחתון של צלחת פטרי זו נשמר בתחילה ב 23 ° C באמצעות מערכת Peltier, ולאחר מכן הטמפרטורה שלה הועלתה ל 26 ° C. סרט צולם מתחת למיקרוסקופ. איור 3 מציג תצלומי בזק של הסרט. תולעים שיפצו באופן דינמי את דפוסי הרשת שלהן במהלך שינוי לחות. ככל שהלחות עו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

במחקר זה אנו מראים פרוטוקול להכנת מערכת להתנהגות קולקטיבית בקנה מידה גדול של C. elegans במעבדה. השיטה מבוססת DFA הוקמה במקור עם Caenorhabditis japonica14 ו- Neoaplectana carpocapsae Weiser15, שניהם בעלי חיים שאינם לדוגמה. עם זאת, שיטה זו לא יושמה כדי לחקור התנהגויות קולקטיביות. C. elegans הוא חיית מודל גנטית11,12. מחקרים גנטיים התנהגותיים המשתמשים ב- C. elegans תרמו לחקיר...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר.

תודות

אנו מודים למרכז Caenorhabditis Genetics על אספקת הזנים המשמשים במחקר זה. פרסום זה נתמך על ידי JSPS KAKENHI Grant-in-Aid for Scientific Research (B) (מענק מספר JP21H02532), JSPS KAKENHI Grant-in-Aid על פרויקט "מדע הרובוט הרך" בתחומים חדשניים (מספר מענק JP18H05474), JSPS KAKENHI Grant-in-Aid for Transformative Research Areas B (מספר מענק JP23H03845), PRIME מהסוכנות היפנית למחקר ופיתוח רפואי (מספר מענק JP22gm6110022h9904), תוכנית JST-Mirai (מספר מענק JPMJMI22G3), ותוכנית JST-FOREST (מענק מספר JPMJFR214R).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Escherichia coli ו-C. elegans זנים
E. coli OP50Caenorhabditis Genetics CenterOP50Food for C. elegans. Uracil auxotroph. E. coli B.
lite-1(ce314); ljIs123[mec-4p::ChR2, unc-122p::RFP]authorZX899lite-1(ce314) מוטציה הנושאת את הגנים המבטאים ChR2 ו-RFP תחת שליטת mec-4 ו-unc-122 promoter, בהתאמה
N2 BristrolCaenorhabditis Genetics Centerזן C. elegans מסוג פרא
<חזק>לגידול תולעים
אגר מטוהר, אבקתNakarai tesque01162-15להכנת לוחות NGM
All-trans רשתיתסיגמא-אולדריץ'R2500לאופטוגנטיקה
בקטו פפטוןבקטון דיקינסון211677להכנת לוחות NGM
סידן כלורידוואקו036-00485להכנת צלחות NGM
כולסטרולוואקו034-03002להכנת צלחות NGM
di-Photassium hydrogenphosphateNakarai tesque28727-95להכנת צלחות NGM
מזון לכלביםNihon מזון לחיות מחמדVITA-ONEלהכנת מרק מזון לכלבים אגר בינוני
LennoxNakarai tesque20066-95לתרבית של E. coli OP50
מגנזיום גופרתי נטול מיםTGIM1890להכנת צלחות
NGM צלחות פטרי (60 מ"מ)Nunc150270להכנת צלחות NGM
אשלגן דיהידרוגנפוספטNakarai tesque28720-65להכנת צלחות NGM
נתרן כלורידNakarai tesque31320-05עבור הכנת לוחות NGM
<חזק>תצפית
פתרון CTלמחשבCS6229Windows10 Pro עם מעבד Intel Xeon Gold 6238R ו-768 GB של זיכרון RAM
CMOS מצלמהפוטוניקה של Hamamatsu ORCA-Lightning C14120-20Pלרכישת נתונים
מצלמת CMOSOlympusDP74לרכישת נתונים
מיקרוסקופ עם סט SZX-MGFPOlympusMVX10לרכישת נתונים
x2 עדשת אובייקטיביתOlympusMV PLAPO 2XCמרחק עבודה 20 מ"מ וצמצם מספרי 0.5
<חזק>בקרת תריס
תריסOptoSigmaBSH2-RIXלשליטה בדפוס זמני של  תאורת אור
בקר תריסOptoSigmaSSH-C2B-Aלשליטה בדפוס זמני של  תאורת אור
<חזק>בקרת טמפרטורה
Peltier יחידת בקר טמפרטורהVICSWLVPU-30לבקרת לחות בתוך לוחית פטרי
בקר UNI-THEMOAMPEREUTC-100לבקרת לחות בתוך פלטת פטרי
<חזק>תוכנת רכישת נתונים
HCImageHamamatsu פוטוניקהלרכישת נתונים
,

מקורות

  1. Vicsek, T., Czirók, A., Ben-Jacob, E., Cohen, I., Shochet, O. Novel type of phase transition in a system of self-driven particles. Physical Review Letters. 75 (6), 1226-1229 (1995).
  2. Nishiguchi, D., Nagai, K. H., Chaté, H., Sano, M. Long-range nematic order and anomalous fluctuations in suspensions of swimming filamentous bacteria. Physical Review E. 95 (2), 020601-020606 (2017).
  3. Saw, T. B., et al. Topological defects in epithelia govern cell death and extrusion. Nature. 544 (7649), 212-216 (2017).
  4. Kawaguchi, K., Kageyama, R., Sano, M. Topological defects control collective dynamics in neural progenitor cell cultures. Nature. 545 (7654), 327-331 (2017).
  5. Chen, C., Liu, S., Shi, X., Chaté, H., Wu, Y. Weak synchronization and large-scale collective oscillation in dense bacterial suspensions. Nature. 542 (7640), 210-214 (2017).
  6. Bricard, A., Caussin, J. -B., Desreumaux, N., Dauchot, O., Bartolo, D. Emergence of macroscopic directed motion in populations of motile colloids. Nature. 503 (7474), 95-98 (2013).
  7. Sumino, Y., et al. Large-scale vortex lattice emerging from collectively moving microtubules. Nature. 483 (7390), 448-452 (2012).
  8. Schaller, V., Weber, C., Semmrich, C., Frey, E., Bausch, A. R. Polar patterns of driven filaments. Nature. 467 (7311), 73-77 (2010).
  9. Lin, A., et al. Imaging whole-brain activity to understand behaviour. Nature Reviews Physics. 4 (5), 292-305 (2022).
  10. Sugi, T., Ito, H., Nishimura, M., Nagai, K. H. C. elegans collectively forms dynamical networks. Nature Communications. 10 (1), 1-9 (2019).
  11. Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A transparent window into biology: a primer on Caenorhabditis elegans. Genetics. 200 (2), 387-407 (2015).
  12. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
  13. Stirman, J. N., et al. Real-time multimodal optical control of neurons and muscles in freely behaving Caenorhabditis elegans. Nature Methods. 8 (2), 153-158 (2011).
  14. Tanaka, R., Okumura, E., Yoshiga, T. A simple method to collect phoretically active dauer larvae of Caenorhabditis japonica. Nematological Research. 40 (1), 7-12 (2010).
  15. Hara, A. H., Lindegren, J. E., Kaya, H. K. Monoxenic mass production of the entomogenous nematode Neoaplectana carpocapsae. Weiser on dog food/agar medium. 16, 1-8 (1981).
  16. de Bono, M., Bargmann, C. I. Natural variation in a neuropeptide Y receptor homolog modifies social behavior and food response in C. elegans. Cell. 94 (5), 679-689 (1998).
  17. Artyukhin, A. B., Yim, J. J., Cheong, M. C., Avery, L. Starvation-induced collective behavior in C. elegans. Scientific Reports. 5, 10647(2015).
  18. Ding, S. S., Schumacher, L. J., Javer, A. E., Endres, R. G., Brown, A. E. Shared behavioral mechanisms underlie C. elegans aggregation and swarming. eLife. 8, 1181(2019).
  19. Chen, Y., Ferrell, J. E. C. elegans colony formation as a condensation phenomenon. Nature Communications. 12 (1), 4947(2021).
  20. Chiba, T., et al. Caenorhabditis elegans transfers across a gap under an electric field as dispersal behavior. Current Biology. 33 (13), 2668-2677 (2023).
  21. Ioannou, C. C., Guttal, V., Couzin, I. D. Predatory fish select for coordinated collective motion in virtual prey. Science. 337 (6099), 1212-1215 (2012).
  22. Couzin, I. D., Krause, J., Franks, N. R., Levin, S. A. Effective leadership and decision-making in animal groups on the move. Nature. 433 (7025), 513-516 (2005).
  23. Sumpter, D. J. T., Krause, J., James, R., Couzin, I. D., Ward, A. J. W. Consensus decision making by fish. Current Biology: CB. 18 (22), 1773-1777 (2008).
  24. Sugi, T., Nishida, Y., Mori, I. Regulation of behavioral plasticity by systemic temperature signaling in Caenorhabditis elegans. Nature Neuroscience. 14 (8), 984-992 (2011).
  25. Russell, J., Vidal-Gadea, A. G., Makay, A., Lanam, C., Pierce-Shimomura, J. T. Humidity sensation requires both mechanosensory and thermosensory pathways in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (22), 8269-8274 (2014).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

Caenorhabditis elegansswarming
טיפוח בקנה מידה גדול של נמטודות כדי ללמוד את ההתנהגויות הקולקטיביות שלהם
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.